分子印跡聚合物在真菌毒素檢測中的應(yīng)用

柴銀皎，李響敏，熊勇華，馬尉，蔡小霞，苑靜，郭亮*

1(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌, 330047)2(南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌, 330047)

分子印跡技術(shù)(molecularly imprinted technology，MIT)又稱分子模板技術(shù)或分子鑰匙技術(shù)，是指以目標(biāo)分子或其結(jié)構(gòu)類似物(虛擬模板)為模板分子，由模板分子經(jīng)共價或非共價鍵與功能單體預(yù)組裝后通過聚合反應(yīng)在模板分子周圍形成高度交聯(lián)的三維網(wǎng)狀聚合物的技術(shù)。通過該技術(shù)制備的產(chǎn)物稱為分子印跡聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)。當(dāng)模板分子去除后，其內(nèi)部留有與模板分子三維空間結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的空腔，且空腔內(nèi)壁含可與模板分子結(jié)合的具有特定空間排布的一個或多個識別基團(tuán)。因此，MIPs能在復(fù)雜樣品基質(zhì)中特異性識別并分離富集待測分子。

MIT具有三大顯著特點(diǎn)。首先，分子印跡技術(shù)是以目標(biāo)為導(dǎo)向的技術(shù)，可根據(jù)不同需求制備MIPs；其次，MIPs具有與天然生物分子識別系統(tǒng)，如酶與底物、抗原與抗體、受體與激素類似的親和性及選擇性，可高效專一地吸附目標(biāo)物；最后，與天然分子識別系統(tǒng)不同，MIPs理化性質(zhì)穩(wěn)定，能在各種復(fù)雜環(huán)境中應(yīng)用，且兼具重復(fù)使用率高及易儲存等優(yōu)點(diǎn)?；跇?gòu)效可設(shè)計(jì)性、專一識別性和高穩(wěn)定性等特點(diǎn)，MIPs被廣泛應(yīng)用于固相萃取、色譜分離，尤其是仿生傳感器等領(lǐng)域[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，從1993年開始，相關(guān)研究呈指數(shù)型增長。

圖1 SMI 提供的歷年分子印跡相關(guān)論文發(fā)表情況[1]Fig.1 Situation of paper publishment of molecular imprinting over the years from SMI[1]

真菌毒素(mycotoxins)是由部分絲狀真菌在適宜環(huán)境中產(chǎn)生的有廣泛毒性的次級代謝產(chǎn)物[2]，目前已知約有300余種。其毒性主要包括三致作用及免疫抑制作用，對肝、腎和生殖系統(tǒng)均可造成損害[3-4]。真菌毒素廣泛污染農(nóng)作物、農(nóng)產(chǎn)品及發(fā)酵食品，痕量真菌毒素通過食物鏈進(jìn)入人體即可嚴(yán)重危害人類健康。因此，建立靈敏、簡便、穩(wěn)定性好的食品基質(zhì)中真菌毒素的檢測方法已成為預(yù)防真菌毒素中毒、維護(hù)食品安全的迫切需要。

常用的真菌毒素檢測方法有快速篩檢法和儀器確證法[5-7]。其中快速篩檢法主要包括基于抗原抗體識別的酶聯(lián)免疫吸附法、生物傳感技術(shù)及蛋白芯片技術(shù)。儀器確證法則以色譜法為主，包括液/氣相色譜法、液/氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC/GC-MS)及薄層色譜法等。上述檢測方法雖已被廣泛使用，但仍存在一些有待解決的問題。如色譜法檢測時間長且分離物極性相差較小時分離效果差；免疫學(xué)檢測法雖能對待檢物進(jìn)行高效且靈敏的大規(guī)模篩選，但其使用的真菌毒素全抗原和抗體均為生物材料，對外界環(huán)境敏感，因此限制了該方法的應(yīng)用。真菌毒素MIPs因其高結(jié)合特異性和高穩(wěn)定性等特點(diǎn)，運(yùn)用于固相萃取可取代傳統(tǒng)的免疫親和柱(immunoaffinity column，IAC)，在實(shí)現(xiàn)特異性凈化富集的同時，降低樣品前處理成本和對前處理操作條件的要求；作為色譜固定相應(yīng)用于高效液相色譜(HPLC)檢測，可提高色譜分離效果；而以MIPs替代抗體作為識別元件的仿生傳感器，則兼具穩(wěn)定、靈敏及可重復(fù)使用等特點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)真菌毒素的快速定量檢測。本文將對近年來MIPs在真菌毒素樣品前處理、色譜分析、真菌毒素仿生傳感器等領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)展以及相關(guān)MIPs制備方法分別進(jìn)行介紹，以期為相關(guān)科研工作者及基層工作人員提供一定的理論參考依據(jù)。

1 MIPs在真菌毒素樣品前處理中的應(yīng)用

樣品中真菌毒素含量通常很低，且樣品基質(zhì)可干擾檢測，因此選擇恰當(dāng)?shù)臉悠非疤幚砑夹g(shù)對真菌毒素的凈化富集至關(guān)重要。最先被廣泛使用的樣品前處理技術(shù)是液液萃取技術(shù)，但其特異性差，且需要使用大量的有機(jī)試劑，操作復(fù)雜，耗時長。為提高特異性，真菌毒素常使用IAC凈化富集。然而IAC價格昂貴且吸附性能易受有機(jī)溶劑、酸堿度及溫度等因素影響。

表1 MIPs在樣品前處理中的應(yīng)用

注：一，表示文獻(xiàn)中未報(bào)道；*，表示方法檢出限、定量限；#，表示樣品檢出限、定量限。表2與此相同。

目前，固相萃取(solid-phase extraction，SPE)技術(shù)是最為常用的樣品前處理技術(shù)。與液液萃取相比，SPE具有富集倍數(shù)高、適用范圍廣、試劑用量少、易于實(shí)現(xiàn)自動化等優(yōu)點(diǎn)；與IAC法相比，SPE具有成本低、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。但是傳統(tǒng)SPE是利用分析物和吸附劑之間的非特異性相互作用吸附目標(biāo)物，所以當(dāng)應(yīng)用于復(fù)雜基質(zhì)時常發(fā)生共萃的現(xiàn)象[8]。1994年SELLERGREN[9]首次將分子印跡材料應(yīng)用于SPE，奠定了分子印跡-固相萃取技術(shù)(molecularly imprinted-solid phase exaction，MISPE)發(fā)展的基礎(chǔ)。該方法兼具常規(guī)SPE法和IAC法的優(yōu)點(diǎn)，可從復(fù)雜的生物或環(huán)境樣品體系中簡便地特異性吸附目標(biāo)分子，提高分析檢測的精密度和準(zhǔn)確性，因此近年來被廣泛應(yīng)用(見表1)。

1.1 分子印跡固相萃取柱法(molecularly imprinted solid phase extraction，MISPE)

分子印跡固相萃取柱法是將MIPs填裝至柱管內(nèi)進(jìn)行固相萃取的方法。根據(jù)操作方式不同，MISPE可分為離線型分子印跡固相萃取柱法 (off-line MISPE)和在線型分子印跡固相萃取柱法(on-line MISPE )。

1.1.1 離線型分子印跡固相萃取柱法

目前MISPE柱法多基于離線模式。離線型分子印跡-固相萃取裝置主要由固相萃取小柱(柱管、墊片、填料)和輔件(真空泵和進(jìn)樣器)構(gòu)成。該裝置僅為后續(xù)檢測分析提供樣品，樣品前處理與分析過程分開獨(dú)立進(jìn)行。因此，洗脫溶劑的pH值和組成等不需要和檢測儀器相匹配，利于MISPE吸附及洗脫條件的優(yōu)化。

CAO等[10]利用商品化赭曲霉毒素A(ochratoxin A，OTA)MISPE柱建立了分子印跡固相萃取-超高效液相色譜-熒光檢測器聯(lián)用系統(tǒng)(MISPE-UPLC-FLD)用于檢測生姜樣品中的OTA。該方法檢出限(limit of detection，LOD)和定量限(limit of quantitation，LOQ)分別為0.09、0.30 ng/mL。MISPE柱法陰性生姜樣品加標(biāo)回收率為88%～95%，與IAC法檢測結(jié)果相近，但是，MISPE柱重復(fù)使用41次后回收率仍大于80%，具有極佳的穩(wěn)定性及可重復(fù)使用性。此后該課題組[11]利用相同檢測系統(tǒng)，進(jìn)一步建立了啤酒、紅酒、葡萄汁樣品中OTA的凈化富集、分離檢測方法。其LOQ和LOD分別為0.08、0.025 ng/mL。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)表明，在啤酒、紅酒、葡萄汁中加標(biāo)質(zhì)量濃度為0.1 ng/mL時，回收率可達(dá)94%～100%，RSD為1.8%～4.1%。BRYA等[12]亦使用商品化的AFFINIMIP FumoZON MISPE柱分離富集玉米面、小麥產(chǎn)品中的伏馬菌素B1、B2、B3(fumonisin B1、B2、B3，F(xiàn)B1、FB2、FB3)，并與LC-MS聯(lián)用進(jìn)行定量分析，LOD滿足歐盟要求。此外，PRELLE等[13]從加標(biāo)回收率、重現(xiàn)性、LOD、LOQ四個方面比較了幾種商品化萃取柱(IAC、MIP柱、MycosepTM229、 MycospinTM和OasisTMHLB)對不同樣品中OTA的吸附性能。結(jié)果表明，對于咖啡中的OTA，MIP柱具有比其他萃取柱更高的加標(biāo)回收率和更低的LOD和LOQ。但是IAC或MycosepTM229分別更適合紅酒、啤酒或辣椒中OTA的凈化富集。因此作者認(rèn)為，需要進(jìn)一步研究確認(rèn)何種基質(zhì)成分及凈化條件會干擾MIP柱對OTA的吸附，且針對不同樣品應(yīng)該選擇不同的商品化SPE柱。

使用商品化MISPE柱雖然方便，但由于市售種類較少，目前研究人員大多根據(jù)需要自行制備。MISPE柱經(jīng)典制備方法是本體聚合法。大致過程是先將單體、模板分子、交聯(lián)劑和致孔劑混合物經(jīng)除氧密封后，通過光、熱或引發(fā)劑引發(fā)聚合得到塊狀MIP聚合物，再將塊狀聚合物研磨、粉碎、過篩得到所需粒徑大小的MIPs顆粒后裝柱。整個制備過程操作簡單，無需復(fù)雜儀器且成本較低。傳統(tǒng)MIPs制備方法常以待測物為模板分子，但是因?yàn)檎婢舅囟拘源?、價格昂貴且殘留在MIPs內(nèi)部的真菌毒素可造成假陽性檢測結(jié)果，所以一般以真菌毒素結(jié)構(gòu)類似物作為虛擬模板來合成真菌毒素MIPs。GIOVANNOLI等[14]采用本體聚合法，以N-(4-氯-1-羥基-2-萘甲酰氨基)-L-苯丙氨酸為虛擬模板[15]，甲基丙烯酸為功能單體制備得到OTA本體MIPs。以其作為SPE柱填料用于意大利不同地區(qū)17種紅酒中OTA的濃縮富集，通過HPLC 檢測，加標(biāo)回收率為88%～102%，LOD和LOQ分別為0.075、0.225 ng/mL。與IAC法相比，兩種前處理方法檢測結(jié)果顯示出良好的一致性(r2=0.981 7)，表明MISPE柱可替代IAC。APPELL等[16]亦通過本體聚合法，以吡啶甲酸為虛擬模板制備得到鐮刀菌酸(fusaric acid，F(xiàn)A)MIPs。以其作為吸附劑富集玉米提取液中的FA，加標(biāo)回收率為84%～92%。

由于一種食品可被多種真菌毒素同時污染，因此若MISPE能同時特異性富集多種真菌毒素，則可簡化前處理過程，實(shí)現(xiàn)多種真菌毒素同時、快速檢測。BAYRAM等[17]以黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)4種主要的黃曲霉毒素(aflatoxin，AF)混合物為模板采用本體聚合法制備了多功能MISPE柱。在加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)及榛子、花生、干無花果、紅辣椒等實(shí)際樣品檢測中，多功能MISPE柱與商品化一次性IAC(AflaPrep)具有相似的加標(biāo)回收率。重復(fù)使用多功能MISPE柱10次，4種AF回收率的RSD為4.1%～5.6%，說明該柱具有良好的穩(wěn)定性，可多次重復(fù)使用。

除本體聚合法外，犧牲硅膠骨架法及微乳法亦被用于真菌毒素MIPs的制備。這2種合成方法可直接制備MIPs顆粒，無需碾磨、篩分等步驟。犧牲硅膠骨架法是將預(yù)聚體在具有孔隙的硅膠中聚合，在印跡完成后，硅膠作為犧牲材料(sacrificial material)用氫氟酸溶解除去，由此制備的MIPs具有更大的孔體積和比表面積，吸附效果更佳。RAHMA[18]等采用犧牲硅膠骨架法首次制得交鏈孢酚(alternariol，AOH)MIPs。作者首先合成了4種AOH結(jié)構(gòu)類似物作為虛擬模板，然后利用組合篩選法從4種虛擬模板、8種功能單體中挑選出特異性吸附量最佳的組合，最后通過犧牲硅膠骨架法制備MIPs并作為MISPE柱填料用于西紅柿中AOH的富集。通過HPLC-FLD檢測分析，AOH的加標(biāo)回收率為81%～103%，RSD<4%，而非分子印跡聚合物(nonmolecularly imprinted polymers，NIPs)加標(biāo)回收率低于10%。WEI等[19]采用微乳法，將司盤80/CTAB水溶液和AFB1/MAA/EGDMA的氯仿溶液混合后經(jīng)超聲形成微乳液，再加入AIBN通過熱聚合得到AF分子印跡微球。微球裝柱后用于富集花生油、啤酒及飼料樣品中的AFM1和AFB1，其加標(biāo)回收率與市售IAC相近。

上述Off-line MISPE均為與HPLC-檢測器聯(lián)用進(jìn)行檢測，需要經(jīng)過HPLC分離步驟。若在保證檢測靈敏度足夠高的前提下，能省略HPLC步驟，將Off-line MISPE直接與檢測器聯(lián)用，則可縮短檢測時間并減少大型設(shè)備的使用，利于現(xiàn)場快速檢測。MISHRA等[20]首次將MISPE與競爭適配子傳感器聯(lián)用，通過差分脈沖伏安法(differential pulse voltammetry，DPV)檢測可可豆中的OTA。檢測時，經(jīng)MISPE富集得到的OTA直接與生物素化OTA競爭結(jié)合電極表面的OTA適配子，再加入親和素修飾的堿性磷酸酶及其底物進(jìn)行酶催化反應(yīng)。通過測定電極上氧化電流的變化對OTA進(jìn)行定量檢測，其LOD為0.07 ng/mL。將等質(zhì)量濃度(2.5 ng/mL)的赭曲霉毒素B(ochratoxin B，OTB)與生物素化OTA混合進(jìn)行競爭吸附，所得信號響應(yīng)值與僅添加生物素化OTA時一致，表明該傳感器具有良好的特異性。此外，BUENO等[21]利用OTA可產(chǎn)生熒光的特性，開發(fā)了一種低成本的便攜式熒光設(shè)備用于現(xiàn)場檢測可可豆中的OTA。該設(shè)備由發(fā)光二極管(light emitting diode，LED)和用來獲得傳感分子圖像的色互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體微相機(jī)組成。與商品化熒光發(fā)光檢測儀(Thermo Scientific Fluoroskan Ascent FL)相比，在檢測相同濃度的OTA時，該新型熒光設(shè)備具有更強(qiáng)的熒光響應(yīng)信號。實(shí)際樣品檢測時，樣品中的OTA由商品化OTA-MIP柱凈化富集后可不經(jīng)HPLC分離直接利用該熒光設(shè)備進(jìn)行快速定量檢測，檢測耗時50 min，LOD為1.25 ng/g，檢測結(jié)果與HPLC-FLD方法一致。

值得指出的是，自2001年P(guān)ILETSKY等[22]將計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)應(yīng)用MIPs制備以來，計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)在MIPs制備過程中發(fā)揮著越來越大的作用。通常在MIPs合成時，對功能單體的選擇、模板與功能單體比例等合成條件的優(yōu)化主要依賴人工篩選。而利用計(jì)算機(jī)模擬進(jìn)行定量計(jì)算和輔助設(shè)計(jì)使得單體選擇和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)更加快速、合理，大大減少了盲目性。ZHAO等[23]使用HYPERCHEM軟件成功分析并確定了包括功能單體、溶劑種類以及模板與單體用量等最佳MIP合成條件。按該條件制備的MIPs裝柱后用于富集蘋果汁中的展青霉素(patulin，PAT)，與液液萃取方法相比，該MISPE柱具有更大的加標(biāo)回收率。

1.1.2 在線型分子印跡固相萃取柱法

On-line MISPE的凈化富集原理與off-line MISPE一致，差別僅在于洗脫時用液相系統(tǒng)的流動相作為洗脫溶劑將待測物從MISPE柱上解析下來并直接進(jìn)入色譜柱進(jìn)行分離。由于富集凈化產(chǎn)物直接進(jìn)入檢測儀器，因此可縮短樣品處理時間，避免分步處理造成分析物損失，減少人工操作誤差，從而提高分析的精確度和精密度。VIDAL等[24]通過本體聚合法制備OTA-MIP作為MISPE吸附劑，采用on-line MISPE模式檢測小麥樣品中的OTA，加標(biāo)回收率為84%～102%，LOD為1.2 ng/mL，低于歐盟規(guī)定的未加工谷類糧食中OTA的限量標(biāo)準(zhǔn)(5.0 ng/g)。YANG等[25]則采用表面分子印跡技術(shù)，通過溶膠-凝膠法在硅球表面聚合制備了PAT核殼型分子印跡微球并建立了On-line MISPE HPLC-UV檢測方法，方法檢出限為0.5 ng/mL。

1.2 分子印跡微固相萃取(molecularly imprinted-Micro solid phase extraction，MI-μSPE)

MI-μSPE是將MIPs吸附劑包裹在多孔聚丙烯薄膜袋內(nèi)，然后將其加至樣品溶液中在攪拌輔助下萃取目標(biāo)物的樣品前處理方法。該方法具有無需裝柱，有機(jī)溶劑用量少，且聚丙烯薄膜作為濾膜可消除部分基質(zhì)干擾等優(yōu)點(diǎn)。LEE等[26]將OTA-MIP包裹在聚丙烯薄膜中建立了MI-μSPE-HPLC-FLD檢測體系。采用該方法對咖啡、葡萄汁、尿液樣品中OTA進(jìn)行檢測，LOD分別為0.06、0.02、0.02 ng/mL。新方法檢測結(jié)果與使用商品化IAC前處理的檢測結(jié)果無顯著性差異，且MI-μSPE萃取袋反復(fù)使用15次后吸附性能不變。

1.3 磁分子印跡固相萃取(magnetic molecularly imprinted solid-phase extraction，m-MISPE)

磁分子印跡固相萃取是指在磁性材料表面聚合形成分子印跡層作為吸附劑應(yīng)用于固相萃取的方法。這種在載體表面印跡聚合的方法稱為表面分子印跡技術(shù)。表面分子印跡聚合物更易接近待測物的識別位點(diǎn)和具有更大的比表面積，故吸附/洗脫效率更高且不易出現(xiàn)“模板泄漏”現(xiàn)象。而當(dāng)以納米磁性粒子作為載體時，比表面積比使用微米級載體更大，且通過外加磁場即可簡便、快速回收，可進(jìn)一步提高吸附效率、簡化前處理流程并減少耗時。URRACA等[27]以2-奈甲酸為虛擬模板，N-3, 5-雙(三氟甲基)苯基-N′-4-乙烯基苯基脲和甲基丙烯酰胺為功能單體，在Fe3O4磁性納米粒子表面印跡聚合制備得到橘霉素(citrinin，CIT)磁性表面分子印跡聚合物。以其為吸附劑進(jìn)行固相萃取并與HPLC-UV聯(lián)用檢測大米中的CIT，回收率為94%～98% ，RSD<3.4%且該吸附劑重復(fù)使用30次性能無明顯降低。

1.4 分子印跡攪拌棒吸附萃取(stir bar sorption extraction，SBSE)

SBSE具有萃取容量高、無需外加攪拌子、可避免競爭性吸附等優(yōu)點(diǎn)。但是SBSE使用的磁性攪拌子的表面萃取相多為聚二甲基硅氧烷，吸附選擇性低，難以滿足復(fù)雜基質(zhì)中痕量物質(zhì)的分析要求。采用MIPs涂層可對待測分子特異性富集，能消除復(fù)雜基質(zhì)對檢測的干擾。磁性分子印跡攪拌棒(magnetic molecularly imprinted-stirring bar，MMIP-SB)的制備一般是在磁力攪拌子的表面聚合MIPs涂層或在其周圍本體聚合形成整體柱攪樣棒。DIAZ-BAO等[28]建立了一種簡便、快速的分子印跡整體柱攪拌棒制備方法，即在MIPs本體聚合體系中直接添加Fe3O4粒子后再進(jìn)行聚合，無需使用現(xiàn)成的攪拌子。將按該方法制備的AFM1-MMIP-SB用于萃取嬰幼兒配方奶粉中的AFM1和嬰兒谷物食品中的AFB1、B2、G1、G2，與液質(zhì)聯(lián)用檢測的LOD分別為0.3×10-3、0.9×10-3、0.7×10-3、1.0×10-3和1.7×10-3ng/g。

2 在液相色譜固定相中的應(yīng)用

色譜分離過程的本質(zhì)是待分離物質(zhì)在固定相和流動相之間分配平衡的過程。傳統(tǒng)液相色譜柱一般利用待檢物、干擾物與固定相間的極性、疏水或靜電相互作用進(jìn)行分離。因此當(dāng)被分離物極性相差很小時分離效果不好。1977年，WULFF[29]首次將MIPs作為色譜固定相用于手性物質(zhì)的分離。由于可特異性結(jié)合目標(biāo)物，以MIPs作為分離介質(zhì)的色譜柱對結(jié)構(gòu)差異很小的類似物仍有極佳的分離效果。通常，MIPs以填充物或整體柱材料的形式作為色譜固定相應(yīng)用于高效液相色譜、毛細(xì)管液相色譜分析中。與填充柱相比，整體柱多以原位聚合法制備，無裝柱過程，制備相對簡單。SZUMSKI等[30]采用WYSZOMIRSKI[31]以計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)確定的虛擬模板和功能單體，通過原位紫外光聚合法成功制備AF毛細(xì)管分子印跡整體柱，并分別從流體動力學(xué)和色譜特性2個方面對其進(jìn)行了評價。將其應(yīng)用于在線色譜分離，該MIP整體柱表現(xiàn)出良好的滲透性，AFB1的印跡因子為2.21，AFB1與虛擬模板5,7-二甲氧基香豆素(DMC)的相對印跡因子為0.68，可很好地分離水溶液中的AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和DMC。

3 在真菌毒素仿生傳感器中的應(yīng)用

以MIPs為識別元件的傳感器稱為分子印跡傳感器(molecularly imprinted sensor)。分子印跡傳感器不僅可特異性識別、吸附目標(biāo)分子，實(shí)現(xiàn)快速、微量分析，還具有生物傳感器無法比擬的耐高溫、高壓、有機(jī)溶劑、酸、堿和能夠多次重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)。因此，近年來分子印跡傳感器發(fā)展迅速(表2)。根據(jù)檢測原理不同，分子印跡傳感器可分為電化學(xué)型傳感器、光學(xué)型傳感器和壓電型傳感器。

3.1 電化學(xué)型傳感器

分子印跡電化學(xué)傳感器(molecularly imprinted electrochemical sensing，MIECS)是現(xiàn)今應(yīng)用最廣泛、發(fā)展最成熟的一類分子印跡傳感器。根據(jù)響應(yīng)信號的不同，可分為電流型、電位型、電導(dǎo)型、電容型、場效應(yīng)晶體管型等。其中以電流型傳感器研究最為深入，其原理是依據(jù)分子印跡聚合物選擇性識別目標(biāo)分子前后的電流信號變化來分析待檢物。電流型傳感器可以對電活性物質(zhì)進(jìn)行直接檢測。檢測時，電活性待測物被吸附至電極表面上MIP層的印跡孔穴內(nèi)并發(fā)生得失電子反應(yīng)，由此產(chǎn)生與待檢物濃度成線性關(guān)系的電流信號。然而大多數(shù)真菌毒素不是電活性物質(zhì)，因此通常需要外加鐵氰化鉀等電活性材料作為信號探針進(jìn)行檢測。真菌毒素則通過影響鐵氰化鉀的氧化還原反應(yīng)改變傳感器產(chǎn)生的峰電流。

表2 MIPs在真菌毒素仿生傳感器中的應(yīng)用

與傳統(tǒng)傳感器相比，基于納米材料修飾的電化學(xué)傳感器具有更高的靈敏度和更快的檢測速度。例如貴金屬納米顆粒具有極佳的比表面積，活性位點(diǎn)多，具備優(yōu)良的電催化活性；而碳納米材料如石墨烯和碳納米管亦具有超大的比表面積及良好的導(dǎo)電性。因此，用貴金屬納米粒子負(fù)載型碳納米管或石墨烯修飾電極可顯著加快電化學(xué)反應(yīng)速率，并提高分子印跡電流型傳感器的檢測靈敏度[32-33]。ATAR等[34]設(shè)計(jì)了一種新穎的電流型分子印跡傳感器并利用DPV檢測黑麥樣品中的CIT。該傳感器將修飾有多金屬氧酸鹽(H3PW12O40，POM)和鉑納米粒子(PtNPs)的還原氧化石墨烯(rGO)滴加在玻璃碳電極(glassy carbon electrode，GCE)表面，然后以電聚合法在電極(PtNPs/POM/rGO/GCE)表面進(jìn)行印跡得到CIT分子印跡電流型傳感器。該傳感器的輸出信號為電荷轉(zhuǎn)移電阻(Rct)。當(dāng)樣品中無CIT時，Rct值低；一旦吸附CIT，由于CIT可阻礙K3[Fe(CN)6]發(fā)生電化學(xué)反應(yīng)使得Rct增加。由于結(jié)合了POM、PtNPs和rGO三者的電催化活性高及比表面積巨大等優(yōu)勢，該傳感器具有極高的檢測靈敏度，其LOD為5.0×10-5ng/mL。此外該傳感器還具有良好的選擇性，與OTA、OTB、AF及洛伐他汀的相對選擇系數(shù)分別為10、10、15和11。同年12月，該課題組將上述CIT傳感器中的鉑納米粒子改換成銀納米粒子，以同樣的合成方法制備得到OTA分子印跡電流型傳感器，方法檢出限為6.4×10-3ng/mL[35]。將該傳感器放置30 d后，其信號值仍高達(dá)最初值的95.7%，具有良好的穩(wěn)定性。

雙金屬復(fù)合納米材料由于兩種金屬成分間的正協(xié)同作用，具有比單一組分材料更佳的電催化活性和電子轉(zhuǎn)移效率。因此，將雙金屬納米材料與碳納米材料聯(lián)用修飾電極可進(jìn)一步提高傳感器的檢測靈敏度。WANG等[36]通過多步修飾法先將多壁碳納米管(multiwalled carbon nanotubes，MCNTs)包裹在GCE表面，再在MCNTs上原位修飾Au/Pt雙金屬納米粒子，最后以鄰苯二胺為功能單體通過電聚合在Au/PtNPs-MCNTs-GCE表面制備AFB1分子印跡膜得到AFB1電化學(xué)傳感器。該傳感器的LOD為9.0×10-3ng/mL，且儲存4周后，峰電流值僅下降3.1%。使用該傳感器檢測地溝油和菜籽油中的AFB1，回收率達(dá)到96%～111%，RSD為2.3%～4.7%。此外，地溝油中常見的硬脂酸、亞麻油酸、苯并芘、膽固醇及芥酸等成分幾乎不影響檢測。

金屬-有機(jī)骨架材料(metal-organic frameworks，MOFs)是過渡金屬離子或金屬簇與有機(jī)配體通過自組裝形成的具有周期性網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的晶體多孔材料，具有孔隙率高、比表面積大、孔道規(guī)則、孔徑可調(diào)等優(yōu)點(diǎn)。因此，MOFs在分析化學(xué)領(lǐng)域，如樣品前處理、色譜固定相及傳感器中均顯示出良好的應(yīng)用潛力。JIANG等[37]將金納米粒子與對氨基苯硫酚通過電聚合在金電極表面形成MIP-MOF膜制備得到基于金屬有機(jī)骨架的AFB1分子印跡電化學(xué)傳感器。該傳感器制備方法簡單，卻具有極高的靈敏度，LOD為3.0×10-7ng/mL，遠(yuǎn)低于其他AFB1傳感器。同時該傳感器亦顯示出極佳的選擇性，產(chǎn)生相同的信號響應(yīng)值時AFB2、AFG1和OTA所需濃度分別是AFB1濃度的109、109和107倍。此外，其印跡因數(shù)達(dá)10，說明印跡效果極佳。該傳感器的上述優(yōu)良特性表明，這種制備方法簡單的MOFs傳感器具有很好的應(yīng)用前景。

3.2 光學(xué)型傳感器

光學(xué)型分子印跡傳感器主要包括化學(xué)發(fā)光、熒光、表面等離子共振3種類型。

3.2.1 化學(xué)發(fā)光傳感器(chemiluminescence sensor，CL sensor)

3.2.2 熒光傳感器(fluorescence sensors)

MIP熒光傳感器檢測分為兩類：直接熒光檢測和間接熒光檢測。直接熒光檢測法要求待檢物自身可產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光。由于真菌毒素?zé)晒廨^弱，采用直接熒光檢測法靈敏度較低，因此真菌毒素一般采用間接熒光檢測法檢測。間接熒光檢測法是在檢測體系中引入強(qiáng)熒光物質(zhì)，利用待測物對熒光物質(zhì)的熒光增強(qiáng)或淬滅效應(yīng)進(jìn)行檢測。引入強(qiáng)熒光物質(zhì)的方式通常有以下兩種。第1種方法是在制備MIPs過程中使用熒光功能單體代替非熒光功能單體，如芘衍生物、1,8-萘內(nèi)酰亞胺染料等。TON等[40]以熒光單體N-(2-(6-(4-甲基哌嗪-1-基)-1, 3-二氧代-1H-苯并[de]異喹啉-2(3H)-基-乙基)丙烯酰胺(FIM)和非熒光單體4-乙烯基吡啶(4-VPY)為共功能單體合成CIT分子印跡微球后將其覆蓋在聚丙乙烯纖維上建立了CIT-MIP熒光傳感器。FIM是基于萘二甲酰亞胺的熒光單體，當(dāng)其與含羧基的分子結(jié)合時熒光可發(fā)生顯著增強(qiáng)。因此，該傳感器熒光強(qiáng)度與樣品中CIT(含有羧基)濃度成正比。需要指出的是，雖然CIT自身產(chǎn)熒光，但其只占總熒光強(qiáng)度的2%。這種基于FIM的MIP熒光傳感器設(shè)計(jì)思路亦可用于其他含羧基的弱熒光或非熒光待測物的檢測。第2種方法是在MIPs內(nèi)摻雜熒光物質(zhì)，如量子點(diǎn)。FANG等[41]在CdSe/ZnS量子點(diǎn)表面印跡聚合得到分子印跡熒光材料(MIOM)用以檢測谷類樣品中的玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)。由于ZEN的紫外吸收與MIOM的帶隙相近，MIOM導(dǎo)帶里的電荷能夠轉(zhuǎn)移到ZEN最低的空分子軌道中，因此MIOM與ZEN結(jié)合可導(dǎo)致熒光猝滅。該傳感器的方法檢出限為0.64 ng/mL，應(yīng)用于玉米、大米、小麥粉中ZEN的檢測時加標(biāo)回收率大于84%。但是這類MIP@QD型傳感器中的QDs被包裹在MIPs內(nèi)部，熒光被部分屏蔽，從而影響其檢測靈敏度。

3.2.3 表面等離子共振傳感器(surface plasmon resonance sensor，SPR sensor)

表面等離子共振法是一種基于傳感器表面折光率變化的微量分析物光學(xué)檢測方法。該方法無需標(biāo)記，可方便快捷檢測渾濁樣品中的待檢物。CHOI等[42]通過電聚合法在金膜表面聚合厚約5～6 nm的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)分子印跡膜，制備得到DON分子印跡表面等離子共振傳感器，其檢測線性范圍為0.1～100 ng/mL。此外，DON的2種乙酰化結(jié)構(gòu)類似物所致SPR共振角變化值分別是DON的19%、44%，說明傳感器具有較好的選擇性。目前大多數(shù)MIP傳感器的制備是直接在傳感器或經(jīng)修飾后的傳感器表面聚合形成MIPs，可能出現(xiàn)印跡位點(diǎn)包埋過深及分布不規(guī)則等缺陷，進(jìn)而影響SPR傳感器的檢測靈敏度。因此，ATAR等[43]提出先配制分子印跡反應(yīng)體系，再通過旋涂法在金表面形成薄且均勻的液膜，然后再引發(fā)聚合制備MIPs印跡層。用原子力顯微鏡表征以該方法制備的CIT-MIP SPR傳感器，MIP層厚度為(25.33±1.60) nm。在實(shí)際樣品加標(biāo)檢測中，其LOD和LOQ分別為1.7×10-3ng/mL、5.0×10-3ng/mL，回收率達(dá)98%～101%。

3.3 壓電型傳感器

壓電型傳感器是一類以重量為信號的傳感器。其中石英晶體微天平(quartz crystal microbalance，QCM)因?yàn)楹唵?、成本低、尺寸小且靈敏度高[44]應(yīng)用最為廣泛，較適合用于建立分子印跡壓電型傳感器。FANG等[45]制備了一種新型的3D分子印跡石英晶體微天平用于檢測谷類糧食中的痕量CIT。其制備過程是先將摻雜Au納米粒子(AuNPs)的介孔碳(CMK-3)固定在石英晶體Au電極(Au electrode，AuE)上，然后在AuNPs@CMK-3/AuE表面以電聚合法制備MIP層。該傳感器靈敏度高(LOD 0.45 ng/mL)、重現(xiàn)性好(RSD 4.3%)。且室溫放置2周和1個月后，其信號值仍有最初的94%和86%，具有良好的穩(wěn)定性。

4 擬ELISA檢測(pseudo-ELISA)

PILETSKY[46]以MIPs納米粒子(nano MIPs)替代抗體采用ELISA模式實(shí)現(xiàn)了對大分子及小分子物質(zhì)的檢測。與其他基于MIPs的pseudo-ELISA不同的是，PILETSKY沒有采用在96孔板中原位合成MIPs的方式，從而避免了孔間平行性差、模板分子不易洗脫及聚合體系成分與板材不相容等問題。由于ELISA法應(yīng)用非常廣泛，而pseudo-ELISA無需增添新型檢測設(shè)備，因此具有極佳的應(yīng)用前景。Nano MIPs采用固相合成方法制備(Solid-phase synthesis)[47],即先將模板分子共價連接至固相支持物表面后再進(jìn)行印跡聚合，然后經(jīng)裝柱、洗滌去除弱結(jié)合nano MIPs及NIPs，最終通過加熱分離模板分子得到高親和力的nano MIPs。固相合成方法制備的nano MIPs印跡位點(diǎn)位于顆粒表面，固相支持物-模板分子復(fù)合物可重復(fù)使用，且整個制備過程僅耗時1周，遠(yuǎn)低于抗體制備所需時間。該課題組的SMOLINSKA-KEMPISTY[48]將FB2固定在氨基化玻璃珠的表面，以N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酰胺為單體在水相中聚合得到粒徑為(93.6±3.9)nm的nano MIPs。然后用nano MIPs包被Nunclon 96孔板，采用競爭ELISA模式檢測FB2。與基于抗體的ELISA方法相比，pseudo-ELISA方法具有更低的LOD(4.4×10-3ng/mL)和更寬的線性范圍(1～104pmol/L)。

5 結(jié)語

綜上所述，MIPs以吸附劑、色譜固定相及傳感器識別元件等形式已被廣泛應(yīng)用于食品樣品中真菌毒素的檢測。在實(shí)現(xiàn)待測物的特異性富集凈化、待測物與干擾物的高效分離以及提高傳感器靈敏度的同時，大大提高了相關(guān)材料或裝置的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性，降低了檢測成本。但是，目前MIPs在真菌毒素檢測中的應(yīng)用仍有較大的局限性，且面臨諸多問題和挑戰(zhàn)。例如在真菌毒素樣品前處理中，使用的MIPs大多采用本體聚合法合成，很少有納米MIPs材料及表面MIPs材料的應(yīng)用；未見針對水溶性真菌毒素的水相容性分子印跡材料合成及應(yīng)用；吸附效率高且操作簡單的m-MISPE和on-line MISPE應(yīng)用少。因此，在真菌毒素MIPs吸附劑的合成中應(yīng)加強(qiáng)納米分子印跡材料及表面分子印跡技術(shù)的應(yīng)用，尤其是基于(磁性)納米材料的表面分子印跡；加快研發(fā)水相容性MIPs，為建立水溶性真菌毒素的水相富集方法以及HPLC流動相含水的on-line MISPE方法奠定基礎(chǔ)。此外，目前商業(yè)化MISPE柱和分子印跡色譜柱仍然較少，說明方法穩(wěn)定且能大規(guī)模合成性能優(yōu)良的MIPs的制備技術(shù)仍然十分欠缺。因此應(yīng)進(jìn)一步探索真菌毒素MIPs的制備方法，如設(shè)計(jì)新功能單體，采用多模板或多功能單體印跡技術(shù)，利用計(jì)算機(jī)模擬輔助合成，以及借鑒化學(xué)合成領(lǐng)域的新進(jìn)展、新技術(shù)如固相合成、活性/可控自由基聚合、點(diǎn)擊化學(xué)[49]等技術(shù)，以期獲得吸附容量大、在復(fù)雜基質(zhì)中選擇性好、耐高壓以及水相容性好的MIPs的新方法。在傳感器設(shè)計(jì)方面，則應(yīng)靈活應(yīng)用表面化學(xué)及納米技術(shù)，通過減小MIP殼層厚度、將納米材料及多孔結(jié)構(gòu)材料應(yīng)用于MIPs層與電極表面之間的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)以及應(yīng)用比率熒光法定量等方法進(jìn)一步提高其靈敏度。

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