浸提對(duì)甜橙果皮中黃烷酮和多甲氧基黃酮的影響及其抗氧化活性研究

聶超，趙梓燕，劉珞憶，董昕穎，周志欽,2*

1(西南大學(xué) 園藝園林學(xué)院，重慶，400715) 2(西南大學(xué) 南方山地園藝學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400715)

甜橙(CitrussinensisOsbeck)是柑橘重要的栽培類型之一，味道甜美多汁。既適于鮮食，又可用于生產(chǎn)橙汁。甜橙加工后，產(chǎn)生大量皮渣等副產(chǎn)物，造成資源的浪費(fèi)[1-2]。國內(nèi)外研究表明，甜橙果皮中富含具有抗氧化、抗炎、抗衰老等功能的黃酮類物質(zhì)，對(duì)慢性疾病的防治有一定功效[3-5]。黃烷酮(flavanones，F(xiàn)LAs)和多甲氧基黃酮(polymethoxyflavones，PMFs)是甜橙果皮中主要的黃酮類物質(zhì)。其中PMFs是一類高度甲氧化的黃酮類化合物，幾乎僅存在于柑橘屬水果中[6]，因其易于吸收，且活性高于一般黃酮，所以受到人們的廣泛關(guān)注[7]。

黃酮類物質(zhì)的提取主要有溶劑浸提、超聲波、微波、超臨界提取等方法[8]。其中溶劑浸提法操作簡(jiǎn)單，廣泛用于工業(yè)化提取[9]。在優(yōu)化提取方法上，前人的研究大多根據(jù)比色法測(cè)定總黃酮含量，以此來優(yōu)化提取條件[10]。比色法測(cè)定黃酮存在有一定的缺陷，不能精確反映具體物質(zhì)的變化。朱攀攀[11]等利用高效液相色譜法(HPLC)，研究了不同超聲參數(shù)對(duì)血橙皮渣中蕓香柚皮苷和橙皮苷的影響。但針對(duì)柑橘多甲氧基黃酮提取的研究鮮有報(bào)道。

大孔樹脂吸附、溶劑萃取、水沉法等富集純化方法，常用于黃酮物質(zhì)的精制，能夠有效除去糖酸、蛋白質(zhì)等水溶性雜質(zhì)[12]。水沉法具有收率高，工藝簡(jiǎn)便，成本較低等優(yōu)點(diǎn)，因此更適于實(shí)際生產(chǎn)[13]。吳婉瑩[14]等對(duì)比采用水沉法與大孔樹脂法桑葉總黃酮，發(fā)現(xiàn)兩種方法精制后的產(chǎn)物純度沒有明顯差異。目前，關(guān)于水沉法精制柑橘黃酮的研究報(bào)道較少。

本實(shí)驗(yàn)研究浸提參數(shù)對(duì)甜橙果皮中黃烷酮與多甲氧基黃酮的影響，針對(duì)不同極性的黃酮類物質(zhì)，確定最佳提取條件。利用水沉法精制粗提取物，研究精制后提取物對(duì)DPPH、ABTS等自由基的清除作用。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

甜橙于2016年12月中下旬采自重慶市國家果樹種質(zhì)資源柑橘圃(National Citrus Germplasm Repository, Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing, China)。洗凈,晾干，削皮，果皮于50 ℃烘箱烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎后過80目篩子，置于干燥器中備用。

標(biāo)準(zhǔn)品蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷、甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素，購于美國Sigma公司。甲醇(色譜純),購于美國Sigma公司;甲酸(色譜純),購于美國Fisher公司;無水乙醇(分析純)，購于成都市科龍?jiān)噭S。

1.2 主要儀器和設(shè)備

密理博Milli-Q Advantange A10超純水系統(tǒng),美國密理博(Millipore)公司;電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9240A),上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;高效液相色譜儀(Waters e2695)、光電二極管陣列檢測(cè)器(Waters 2998),美國Waters公司;電子天平(Sartorius BSA224S，感量0.1 mg，Max 220 g),賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;水浴恒溫振蕩器(SHA-C),金壇市宏業(yè)實(shí)驗(yàn)儀器廠;EYEL4 FDU-2000小型冷凍干燥機(jī)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,日本東京理化器械株式會(huì)社。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黃酮含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件

采用高效液相色譜法測(cè)定黃烷酮和多甲氧基黃酮的含量。參考張?jiān)穂15]等方法，色譜柱：Sunfire-C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A(0.1% 甲酸超純水)和B(甲醇)，采用梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋?1)0～20 min，37%～50% B；(2)20～35 min，50%～80% B；(3)35～40 min，80%～100% B；(4)40～50 min，100% B；(5)50～60 min，37% B，流速：0.7 mL/min。在特定波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)3種黃烷酮類(蕓香柚皮苷、橙皮苷、香蜂草苷)，3種多甲氧基黃酮(甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素)進(jìn)行檢測(cè)。其中黃烷酮的檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm，多甲氧基黃酮的檢測(cè)波長(zhǎng)為330 nm。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)10.0 mg，甲醇定容至10.0 mL，得濃度為1 mg/mL的母液。將母液稀釋成不同濃度，按照上述HPLC條件分別進(jìn)樣，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.1.3 提取液中黃酮含量測(cè)定

取甜橙果皮黃酮提取液，經(jīng)0.22 μm濾頭過濾，濾液裝入棕色進(jìn)樣瓶，按照2.1.1所述方法測(cè)定。采用單標(biāo)法對(duì)其進(jìn)行定性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

2.2 不同條件下提取甜橙果皮中黃烷酮和多甲氧基黃酮的含量

稱取5.0 g的甜橙果皮粉末，分別考察溶劑體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度、浸提時(shí)間、料液比對(duì)提取液中黃烷酮和多甲氧基黃酮含量影響。(1)溶劑體積分?jǐn)?shù)，選擇60%、70%、80%、90%、100%的乙醇。在料液比為1∶20，90 ℃下加熱回流浸提4 h；料液比為1∶10，60 ℃下加熱回流浸提2 h。(2)浸提溫度，設(shè)置電加熱套溫度60、70、80、90、100、110 ℃。以70%乙醇為溶劑，在料液比為1∶20下加熱回流浸提4 h；80%乙醇為溶劑，在料液比為1∶10下加熱回流浸提2 h。(3)浸提時(shí)間。料液比為1∶20，在90 ℃下以70%乙醇加熱回流浸提0.5、1、2、3、4、5 h；料液比為1∶10，在60 ℃下以80%乙醇加熱回流浸提0.5、1、2、3、4、5 h。測(cè)定提取液中黃烷酮和多甲氧基黃酮的含量(4)料液比。以1∶5，1∶10，1∶20，1∶30，1∶40為料液比，在90 ℃下，70%乙醇加熱回流浸提4 h；60 ℃下，80%乙醇加熱回流浸提2 h。測(cè)定提取液中黃烷酮和多甲氧基黃酮的含量。

2.3 甜橙果皮總黃酮提取物的精制

水沉法是中藥生產(chǎn)中常用精制工藝，按照2.2所得出的最優(yōu)條件提取甜橙果皮中的總黃酮，將提取液冷卻后過濾。參照陳華麗[13]等方法，稍作修改，在45 ℃減壓濃縮濾液，按照浸膏∶水=1∶4(g∶mL)加水沉淀，4 ℃靜置2 h，5 000 r/min離心10 min，將沉淀進(jìn)行真空冷凍干燥。采用HPLC測(cè)定精制前后黃酮組成與含量，方法參照2.1，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量，各峰對(duì)應(yīng)的黃酮物質(zhì)含量相加即為總黃酮含量，同時(shí)考察水洗次數(shù)對(duì)總黃酮純度和保留率的影響。具體計(jì)算公式如下：

(1)

(2)

2.4 甜橙果皮總黃酮提取物的體外抗氧化活性研究

2.4.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

DPPH自由基清除能力測(cè)定參考GORINSTEIN等[16]的方法，稍做修改。準(zhǔn)確稱取0.019 7 g DPPH標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇定容至500 mL，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為0.1 mmol/L。取0.1 mL待測(cè)樣液加到3.9 mL DPPH溶液中，振蕩均勻后避光反應(yīng)30 min，于517 nm處測(cè)定吸光值。不同濃度提取物的抗氧化能力采用DPPH消除率表示，具體計(jì)算公式如下：

(3)

其中：A0，0.1 mL乙醇加到DPPH標(biāo)準(zhǔn)液的吸光值；A測(cè)，0.1 mL樣品溶液和DPPH標(biāo)準(zhǔn)液混合的吸光值。

2.4.2 ABTS自由基清除能力測(cè)定

ABTS自由基清除能力測(cè)定參照ALMEIDA等[17]的方法，稍作修改。分別配制140 mmol/L過硫酸鉀溶液和7 mmol/L ABTS+溶液待用，取176 μL過硫酸鉀溶液與10 mL ABTS+溶液混合均勻后避光反應(yīng)12～16 h。將混合液用乙醇稀釋到吸光值為(0.7±0.002)，即為ABTS工作液。取0.1 mL待測(cè)樣品液加到3.9 mL ABTS溶液中，搖勻后反應(yīng)10 min，于734 nm處測(cè)定吸光值。樣品溶液的抗氧化能力采用ABTS自由基消除率表示，具體計(jì)算公式如下：

(4)

其中:A0，0.1 mL乙醇加到ABTS標(biāo)準(zhǔn)液的吸光值；A測(cè)，0.1 mL樣品溶液和ABTS標(biāo)準(zhǔn)液混合的吸光值。

2.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel和SPSS 19軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Origin 8作圖，試驗(yàn)重復(fù)3次，以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 黃酮標(biāo)準(zhǔn)品HPLC分析與標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

6種主要類黃酮標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程、相關(guān)系數(shù)如表1所示。本方法測(cè)定的蕓香柚皮苷、橙皮苷等標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積呈良好線性關(guān)系，符合定量要求。

表1 黃酮物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

3.2 不同提取條件下甜橙果皮黃酮含量變化

研究了不同提取條件下黃酮含量變化，結(jié)果表明,甜橙果皮中黃酮主要分為黃烷酮和多甲氧基黃酮，且黃烷酮的含量遠(yuǎn)高于多甲氧基黃酮，其中橙皮苷是含量最高的黃烷酮，這與WANG[18]等研究結(jié)果一致。在不同提取條件下，總黃酮的含量為(8.74±0.26)～(24.04±0.75) mg/g，與LIU[19]等研究結(jié)果相似。

3.2.1 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取對(duì)甜橙果皮中黃酮類物質(zhì)含量的影響

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇提取，所得提取液中黃烷酮和多甲氧基黃酮的含量變化如圖1所示。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，黃烷酮和多甲氧基黃酮的變化規(guī)律略有差異。對(duì)于黃烷酮，橙皮苷和香蜂草苷的含量最大值出現(xiàn)在乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，而蕓香柚皮苷含量最大值出現(xiàn)在乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)。進(jìn)一步提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，3種黃烷酮含量均出現(xiàn)明顯的下降。YANG[20]等在研究黃烷酮提取時(shí)發(fā)現(xiàn)，存在一個(gè)最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)，進(jìn)一步增加乙醇體積分?jǐn)?shù)會(huì)導(dǎo)致提取效率下降。這可能是高體積分?jǐn)?shù)的乙醇極性偏小，不適用于黃烷酮的提取[21]。

隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化，3種多甲氧基黃酮含量的變化趨勢(shì)相似，呈先增加后降低最后趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。在80%體積分?jǐn)?shù)乙醇提取下，3種多甲氧基黃酮含量均達(dá)到最大值。其中，甜橙黃酮的含量從(0.60±0.04) mg/g增加到(0.87±0.01) mg/g。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，多甲氧基黃酮的含量開始降低并趨于平穩(wěn)。LIBRN[22]等發(fā)現(xiàn)，在85%的乙醇體積分?jǐn)?shù)提取下，多甲氧基黃酮含量最高，這與我們研究結(jié)果相似。由于多甲氧基黃酮極性偏小，根據(jù)相似相溶原理，高體積分?jǐn)?shù)乙醇有利于多甲氧基黃酮提取。進(jìn)一步提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，極性開始改變，導(dǎo)致提取效率下降。也有學(xué)者認(rèn)為，高體積分?jǐn)?shù)的乙醇可能破壞細(xì)胞壁性質(zhì)，使得酚類物質(zhì)不易溶出，同時(shí)對(duì)酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)移也有一定影響[23]。

綜上所述，我們認(rèn)為，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)，黃烷酮和總黃酮得率最高，乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，有利于多甲氧基黃酮。

圖1 不同乙醇濃度對(duì)對(duì)果皮中黃酮類物質(zhì)含量的影響Fig.1 Effect of water content in ethanol on the yield of flavonoids

3.2.2 不同浸提溫度對(duì)甜橙果皮中黃酮類物質(zhì)含量的影響

溫度對(duì)果皮中黃酮類物質(zhì)含量的影響如圖2所示。由圖2可知，黃烷酮的含量變化規(guī)律大致相同，呈先增加后降低的趨勢(shì)。溫度從60 ℃增加到90 ℃，蕓香柚皮苷、橙皮苷和香蜂草苷等含量迅速增高，這與朱攀攀[11]等研究結(jié)果一致。隨著溫度升高，溶劑分子運(yùn)動(dòng)加速，有利于黃酮類物質(zhì)提取[24]。其中橙皮苷的含量從(6.46±0.53) mg/g提高到(15.22±1.28) mg/g，增加了1倍多。當(dāng)浸提溫度超過90 ℃后，黃烷酮的含量開始下降。這可能是由于溫度升高，破壞了黃酮化合物的結(jié)構(gòu)[25]。

多甲氧基黃酮的含量隨溫度的變化與黃烷酮的變化明顯不同，提取溫度從60 ℃升高到110 ℃，多甲氧基黃酮含量無明顯變化。M’HIRI[26]等在提取多甲氧基黃酮時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著溫度的增加，其含量無明顯變化。KO[27]等的研究證明，在較高溫度時(shí)，多甲氧基黃酮類物質(zhì)具有良好的穩(wěn)定性，能夠保持較高的提取率，但其糖苷類物質(zhì)卻開始降解。我們推測(cè)，相較于黃烷酮，多甲氧基黃酮在高溫下更加穩(wěn)定。

由黃烷酮和多甲氧基黃酮的變化趨勢(shì)可以看出，提取溫度為90 ℃黃烷酮和總黃酮等物質(zhì)提取量最高，而溫度為60 ℃就可以較好地提取多甲氧基黃酮。

圖2 不同浸提溫度對(duì)對(duì)果皮中黃酮類物質(zhì)含量的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on the flavonoids yield

3.2.3 浸提時(shí)間對(duì)甜橙果皮中黃酮類物質(zhì)含量的影響

黃烷酮和多甲氧基黃酮的含量隨提取時(shí)間的變化規(guī)律由圖3所示。由圖3可知，提取時(shí)間從0.5 h增加到4 h，蕓香柚皮苷和橙皮苷的含量均明顯上升，4 h時(shí)達(dá)到最大值分別為：(1.11±0.08)、(18.10±0.75) mg/g。當(dāng)提取時(shí)間超過4 h后，含量開始下降。香蜂草苷最大值出現(xiàn)在2 h，隨后含量開始下降。時(shí)間[28]是影響黃酮提取的重要因素，CHEIGH[24]等在研究橙皮苷和蕓香柚皮苷提取時(shí)發(fā)現(xiàn)，時(shí)間對(duì)提取含量的影響主要與溶解性和熱穩(wěn)定性有關(guān)，提取時(shí)間太短不利于物質(zhì)的溶解，提取時(shí)間太長(zhǎng)容易造成黃烷酮的降解。

多甲氧基黃酮含量隨著提取時(shí)間的變化規(guī)律不同。其中甜橙黃酮的變化趨勢(shì)與黃烷酮相似，隨著提取時(shí)間的增加呈先上升后下降趨勢(shì)，最大值出現(xiàn)在2 h，和香蜂草苷相同。但川陳皮素和橘皮素的變化規(guī)律與甜橙黃酮不同，其含量隨時(shí)間的增加先增加后趨于平穩(wěn)，沒有出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，最大值均出現(xiàn)在1 h，較早于甜橙黃酮。XU[29]等也發(fā)現(xiàn)川陳皮素、甜橙黃酮等含量隨著提取時(shí)間的增加并沒有發(fā)生下降的現(xiàn)象，這可能與其結(jié)構(gòu)有關(guān)[30]。同時(shí)相較于黃烷酮，多甲氧基黃酮類物質(zhì)更易提取[27]，所需時(shí)間較短。

溶劑浸提法最大缺點(diǎn)就是時(shí)間太長(zhǎng)，從多甲氧基黃酮提取來看，提取時(shí)間為1～2 h，即可獲得較高含量。而黃烷酮和總黃酮的提取時(shí)間需要4 h才能達(dá)到最大值。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)果皮中黃酮類物質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of extraction time on the flavonoids yield

3.2.4 料液比對(duì)甜橙果皮中黃酮類物質(zhì)含量的影響

液料比是影響提取的關(guān)鍵因素之一，合適的料液比可以促進(jìn)物質(zhì)的溶解，增加提取效率。由圖4可知，黃烷酮和多甲氧基黃酮的產(chǎn)量都隨料液比的提高呈先增加后降低趨勢(shì)。橙皮苷和香蜂草苷在料液比為1∶20時(shí)含量達(dá)到最高，蕓香柚皮苷含量的最大值出現(xiàn)在料液比為1∶10，而后隨著料液比的增加，含量開始下降。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，在料液比從1∶5提高到1∶20時(shí)，橙皮苷的含量顯著增加，這與許鷺[31]等研究相同，增加料液比利于黃酮物質(zhì)的提取。

多甲氧基黃酮的含量變化規(guī)律相似，呈先增加后降低趨勢(shì)。與黃烷酮不同的是，甜橙黃酮、川陳皮素、橘皮素3種多甲氧基黃酮均在料液比為1∶10時(shí)含量達(dá)到最高。李成平[33]等發(fā)現(xiàn)料液比為1∶15時(shí)多甲氧基黃酮得率較高，這與我們的研究結(jié)果相近。

在料液比為1∶10時(shí)多甲氧基黃酮含量即可達(dá)到最高值，而黃烷酮和總黃酮的最大值則出現(xiàn)在料液比為1∶20時(shí)，我們推測(cè)是由于多甲氧基黃酮相較于黃烷酮較易溶出所致。隨著料液比繼續(xù)增加，黃酮的提取效率開始下降，這可能是料液比的提高，其他物質(zhì)如多糖和蛋白質(zhì)的溶解性提高，阻礙了黃酮的溶解，不利于提取[32]。

圖4 不同料液比對(duì)果皮中黃酮類物質(zhì)含量的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the flavonoids yield

3.3 甜橙果皮總黃酮提取物的精制

甜橙果皮粗提取物中含有大量的糖、有機(jī)酸、色素等物質(zhì)以及一些油脂類雜質(zhì)，致使樣品不易凍干，且容易吸潮。如圖5所示，水沉法可以有效等除去糖、酸等雜質(zhì)。水沉次數(shù)對(duì)精制效果的影響如表2所示，綜合考慮純度、保留率以及用水量，選擇水沉兩次為宜。精制后提取物中總黃酮純度從12.34%提高到42.05%。李春美[34]等利用AB-8大孔樹脂分離純化柚皮黃酮，產(chǎn)物純度為39.67%，蘆柑總黃酮經(jīng)大孔樹脂純化后，純度可達(dá)63.1%[35]。本實(shí)驗(yàn)得到的提取物純度介于兩者之間，且方法簡(jiǎn)便快捷，易于操作。

A-標(biāo)準(zhǔn)品；B-精制前；C-精制后；1-蕓香柚皮苷； 2-橙皮苷：3-香蜂草苷；4-甜橙黃酮；5-川陳皮素；6-橘皮素圖5 六種標(biāo)準(zhǔn)品和精制前后總黃酮提取物的HPLC圖譜Fig.5 The HPLC spectra of six standards and extracts of total flavonoids before and after purification

表2 水沉次數(shù)對(duì)精制效果的影響

Table 2 Effect of different times of water precipitation on the results

水沉次數(shù)總黃酮/(mg·g-1)純度/%保留率/%1387.23±4.52a38.72b83.64a2420.57±8.46b42.05a81.73b3433.32±12.37c43.33a78.18c

注:表2結(jié)果表示為3次測(cè)定的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同一列不同小寫字母表示在0.05顯著性水平上差異顯著。

3.4 甜橙果皮總黃酮提取物的抗氧化活性

3.4.1 甜橙果皮總黃酮提取物對(duì) DPPH和ABTS自由基的清除能力

不同濃度甜橙果皮提取物對(duì) DPPH、ABTS自由基的清除能力如圖6所示。由圖6看出，甜橙果皮提取物對(duì)DPPH、ABTS自由基均表現(xiàn)出較好的清除作用。同一濃度下，甜橙果皮提取物對(duì)ABTS的清除能力高于DPPH，這與不同自由基本身性質(zhì)有關(guān)[36]。

另外，隨著果皮提取物濃度的增加，其對(duì)DPPH、ABTS自由基的清除率也逐漸增大，劑量效應(yīng)關(guān)系明顯。甜橙果皮提取物對(duì)DPPH、ABTS自由基的IC50分別為(1.12±0.13)、(0.22±0.01) mg/mL。LIU[37]在研究甜橙黃酮提取物對(duì)DPPH的清除能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，其IC50為(1.19±0.12) mg/mL，與本研究結(jié)果一致。

圖6 不同濃度的甜橙果皮提取物中黃酮對(duì)自由基的清除作用Fig.6 scavenging potency of extract of orange peels with different concentration

3.4.2 甜橙果皮總黃酮含量與DPPH和ABTS自由基清除能力相關(guān)性分析

對(duì)甜橙果皮提取物中黃酮含量與抗氧化活性進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果如圖7所示。果皮提取物中黃酮含量與DPPH(R2=0.959 7，p<0.01)、ABTS(R2=0.985 7，p<0.01)自由基清除能力均呈顯著正相關(guān)關(guān)系，這說明提取物中黃酮的含量與抗氧化性極相關(guān)，提取物中的黃酮類物質(zhì)是抗氧化的主要物質(zhì)，這與LOU[38]等在研究金橘總黃酮含量與抗氧化能力的相關(guān)性時(shí)，得到的結(jié)果相似。但萬利秀[39]等研究發(fā)現(xiàn)，柑橘果皮中總黃酮含量與DPPH自由基清除能力無關(guān)，分析其原因可能是，提取液中存在其他雜質(zhì)，影響了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖7 甜橙果皮提取物中黃酮含量與自由基清除能力的相關(guān)性分析Fig.7 Analysis of the correlation between the radical scavenging ratios (%) and the total flavonoids of the extracts from orange peels

4 結(jié)論

甜橙果皮中的黃酮類物質(zhì)主要為黃烷酮和多甲氧基黃酮，本實(shí)驗(yàn)主要采用加熱浸提法提取甜橙果皮中的黃酮類物質(zhì)并利用HPLC對(duì)不同提取條件下黃烷酮和多甲氧基黃酮進(jìn)行了精確的定量，篩選出了最優(yōu)的提取條件。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃烷酮的最佳提取條件為：以70%體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為溶劑，料液比為1∶20，90 ℃提取4 h，提取效果最佳，達(dá)到(24.74±0.42) mg/g；多甲氧基黃酮提取的最佳條件為：以80%乙醇作為提取溶劑，料液比為1∶10，60 ℃提取2 h，多甲氧基黃酮的提取效果最佳，達(dá)到(2.47±0.08) mg/g。

采用水沉法精制甜橙黃酮提取物，經(jīng)HPLC檢測(cè)分析，精制后提取物中的總黃酮純度達(dá)到42.05%，其中多甲氧基黃酮含量為(19.93±0.14) mg/g。利用DPPH、ABTS兩種體外抗氧化體系評(píng)價(jià)精制后甜橙果皮提取物總黃酮的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)甜橙果皮提取物總黃酮對(duì)ABTS的清除作用較強(qiáng)，且總黃酮含量與抗氧化能力呈極顯著正相關(guān)，甜橙果皮提取物中的黃酮類物質(zhì)是主要的抗氧化成分。

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