γ-聚谷氨酸復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠特性的影響

白登榮，劉根，賀雪華，尚永彪,2,3*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶,400715) 2(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(重慶)，重慶,400715) 3(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶,400715)

目前常見的肉糜制品種類繁多，但主要是魚肉糜和豬肉糜，雞肉糜卻很少，這主要是由于雞肉的一些固有特性使得雞肉糜的加工較魚肉糜和豬肉糜復(fù)雜[1]，嚴(yán)重限制了雞肉糜制品的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。在肉類加工過程中，肌肉鹽溶性蛋白的凝膠特性很大程度上決定了肉糜類制品的質(zhì)地、組織狀態(tài)、外觀和出品率等[2]，而且受眾多因素的影響。為了改善雞肉糜制品的凝膠特性，目前研究較多的是加入添加劑，如谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(Transglutaminase，TGase)、大豆分離蛋白、多糖、多聚磷酸鹽等。此外，如漂洗、斬拌、超高壓處理及加熱方式等凝膠制備工藝的優(yōu)化也從很大程度上改善了雞肉糜制品的凝膠特性。

γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)是一種水溶性、可生物降解、無毒性的高分子氨基酸聚合物[3-4]，它能夠增加腸胃蠕動(dòng)，促進(jìn)小腸對(duì)礦物質(zhì)的吸收，且其降解產(chǎn)物谷氨酸單體還可以被人體吸收利用[5-6]。TGase是一種催化?；D(zhuǎn)移反應(yīng)的酶，它能使蛋白質(zhì)分子間發(fā)生交聯(lián)，改變蛋白質(zhì)的空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而改善蛋白質(zhì)的凝膠特性。近年來，在TGase改善肌原纖維蛋白凝膠特性等方面的研究已經(jīng)相當(dāng)廣泛，但關(guān)于γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠特性的影響的研究鮮有報(bào)道。本文以冷凍雞胸肉為原料，研究不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的γ-PGA和TGase復(fù)合后對(duì)其肌原纖維蛋白凝膠特性的影響，并分析凝膠特性變化的機(jī)理，以幫助解決雞肉糜凝膠特性差等問題。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉，購于重慶北碚永輝超市，-18 ℃冷凍儲(chǔ)藏備用。使用前取一定量的雞胸肉解凍后剔除可見脂肪及結(jié)締組織，加入冰水?dāng)匕璩扇饷?，? ℃條件下冷藏。

Na2HPO4、NaH2PO4、牛血清蛋白、CuSO4、尿素、KCl、NaCl、乙二胺四乙酸(EDTA)、β-疏基乙醇、HCl，成都市科龍化工試劑廠；酒石酸鉀鈉寧波大川精細(xì)化工有限公司；SDS、2-硝基苯甲酸(DTNB)，BIOSHARP；Tris Sigma-Alorich，以上均為分析純。TGase(酶比活力為100 U/g)，東圣食品科技有限公司；γ-PGA，軒凱生物科技有限公司，以上均為食品級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-4C+酸度計(jì)，成都世紀(jì)方舟科技有限公司；XHF-D內(nèi)切式勻漿機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Avanti J-30I貝克曼冷凍離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特公司；722-P可見分光光度計(jì)，上海現(xiàn)科儀器有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司；RZ-288c攪肉機(jī)美的集團(tuán)；DW-25W518冰箱，青島海爾電器有限公司；UltraScan PRO測(cè)色儀，美國HunterLab公司；CT-3質(zhì)構(gòu)儀，美國Brookfield公司；Mini-PROTEAN?電泳槽，美國BIO-RAD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肌原纖維蛋白(myofibrillar protein，MP)的提取

參考XIONG[7]的方法并稍作修改。取一定量的雞肉糜加入4倍體積0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(0.1 mol/L NaCl，5 mmol/L EDTA，pH 7.0)，10 000 r/min高速勻漿60 s后冷凍離心(4 ℃、5 500 r/min)15 min，棄去上清液，將所得沉淀按上述步驟重復(fù)提取2次，然后將所得沉淀與4倍體積0.1 mol/L NaCl (pH 6.25)混合，6 000 r/min高速勻漿30 s，4 ℃、5 500 r/min離心15 min，在將所得沉淀與8倍體積0.1 mol/L NaCl(pH 6.25)混合，過濾、去除結(jié)締組織，4 ℃、5 500 r/min離心15 min后所得沉淀即為肌原纖維蛋白。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用雙縮脲法。

1.3.2 肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的制備

取一定量的肌原纖維蛋白于4 ℃的磷酸鹽緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl、0.05 mol/L Na2HPO4、pH 6.5)中，在4 ℃條件下2 800 r/min勻漿24 s使蛋白充分溶解，勻漿過程中盡量避免氣泡的產(chǎn)生，使蛋白質(zhì)溶液質(zhì)量濃度為40 mg/mL，分別加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的γ-PGA(0、0.03%、0.06%、0.09%、0.12%)和TGase(0、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%)混勻，調(diào)節(jié)pH值為6.5，在4 ℃條件下處理1 h，然后取7 mL樣液于10 mL的離心管中，在水浴鍋中先40 ℃保溫30 min，然后80 ℃保溫30 min形成凝膠，快速冷卻，然后在4 ℃的條件下放置過夜后進(jìn)行凝膠相關(guān)特性的測(cè)定。

1.3.3 凝膠硬度和彈性的測(cè)定

制備好的凝膠從4 ℃條件下取出后放于室溫下平衡30 min。使用質(zhì)構(gòu)儀對(duì)其凝膠硬度和彈性進(jìn)行測(cè)定。測(cè)定參數(shù)設(shè)置如下：探頭類型：TA5；測(cè)前速度：5 mm/s；測(cè)中速度：1 mm/s；測(cè)后速度：1 mm/s；壓縮比：50%；觸發(fā)點(diǎn)負(fù)載：5.0 g；觸發(fā)類型：Auto；數(shù)據(jù)攫取速率：200 Hz；停留時(shí)間：5 s。

1.3.4 凝膠保水性的測(cè)定

參考SALVADOR等[8]的方法對(duì)凝膠保水性進(jìn)行測(cè)定。制備好的凝膠從4 ℃條件下取出后放于室溫下平衡30 min，放入離心管中稱重記為m1；于4 ℃、5 000 r/min條件下離心10 min，除去離心管中的水后稱重記為m2，結(jié)果取平均值。凝膠保水性計(jì)算見公式(1)：

(1)

式中：m，離心管的質(zhì)量，g；m1，離心前離心管和凝膠的質(zhì)量，g；m2，離心后離心管和凝膠的質(zhì)量，g。

1.3.5 凝膠白度值的測(cè)定

采用UltraScan PRO色差儀進(jìn)行凝膠白度值分析，測(cè)色儀先用白、黑板校正，然后將樣品垂直緊扣在鏡口，測(cè)定并記錄L*(亮度)、a*(紅度)、b*(黃度)，所有樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品取3個(gè)點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)點(diǎn)重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。白度值的計(jì)算見公式(2)：

(2)

1.3.6 離子鍵、氫鍵、疏水相互作用的測(cè)定

1.3.7 活性巰基和總巰基的測(cè)定

參考ELLMAN[10]的方法并作適當(dāng)?shù)男薷摹７Q取8 g蛋白凝膠化樣品溶解于22 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液C(pH 7.0，內(nèi)含10 mmol/L EDTA、0.6 mol/L KCl)中，10 000 r/min均質(zhì)30 s后10 000 r/min離心10 min。利用雙縮脲法測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)量濃度并調(diào)節(jié)至1 mg/mL。取5.5 mL蛋白溶液與0.1 mL DTNB(10 mmol/L)混合，4 ℃條件下放置1 h后在412 nm處測(cè)定溶液的吸光度，計(jì)算活性疏基含量；取0.5 mL蛋白溶液與5 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液D(pH 8.0，內(nèi)含10 mmol/L EDTA、0.6 mol/L KCl、8 mol/L尿素)混合，再加入0.1 mL DTNB(10 mmol/L)，40 ℃條件下保溫25 min后在412 nm處測(cè)定溶液的吸光度，計(jì)算總巰基含量。巰基的摩爾吸光系數(shù)為13 600 (L/mol·cm)。

1.3.8 凝膠蛋白溶解度的測(cè)定

參考RAWDKUEN等[11]方法。稱取1 g蛋白凝膠化樣品溶解于20 mL 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(內(nèi)含1% SDS，8 mmol/L尿素和2% β-疏基乙醇，pH 8.0)中，均質(zhì)后在100 ℃加熱2 min，室溫下攪拌4 h，然后10 000 r/min離心30 min。取上清液10 mL，加入2 mL 冷的50%TCA，混合液在4 ℃條件下放置18 h后10 000 r/min離心20 min，取沉淀用10%的TCA沖洗，待沉淀風(fēng)干后溶于0.5 mmol/L NaOH中。利用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，結(jié)果以可溶性蛋白占總蛋白(樣品直接溶于0.5 mmol/L NaOH中測(cè)得的蛋白含量)含量的百分比表示。

1.3.9 肌原纖維蛋白SDS-PAGE凝膠電泳

參考LAEMMLI[12]的方法進(jìn)行凝膠電泳的測(cè)定。取一定量的肌原纖維蛋白用0.6 mol/L NaCl(pH 6.5)溶液調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為2 mg/mL，加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的γ-PGA和TGase混勻，調(diào)節(jié)pH值為6.5，在4 ℃條件下處理1 h后進(jìn)行電泳樣品的制備。分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，電泳開始時(shí)先采用恒定電流15 mA，待樣品進(jìn)入分離膠后將電流調(diào)節(jié)至25 mA。

1.3.10 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)處理有3個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值。用Excel 2015對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，用Origin軟件進(jìn)行繪圖，用SPSS Statistics 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠硬度和彈性的影響

γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠硬度和彈性的影響如圖1所示。

圖1 γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠硬度(a)和彈性的影響(b)Fig.1 Effect of γ-polyglutamic acid combined with TGase on the hardness and springiness of gelatin from chicken myofibrillar protein

由圖1可知，在未添加TGase時(shí)，隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，凝膠硬度和彈性呈先增大后減小的趨勢(shì)，且在γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%時(shí)，凝膠硬度和彈性分別達(dá)到最大值，與完全空白組(未添加TGase和γ-PGA)相比分別顯著增大(p<0.05)了61.11%、13.10%；添加TGase后，在同一TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，凝膠硬度和彈性先顯著增大后變化不明顯，但在TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%、γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%時(shí)，凝膠硬度和彈性顯著減小(p<0.05)。在同一γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，隨著TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，凝膠硬度和彈性先顯著增大后變化不明顯，但在γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%時(shí)，添加0.7%的TGase后反而使凝膠硬度和彈性明顯減小(p<0.05)。在TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%時(shí)，凝膠硬度和彈性分別達(dá)到最大值，與完全空白組相比分別提高了4.48倍、1.27倍。研究發(fā)現(xiàn)，γ-PGA水溶液在加熱過程中會(huì)產(chǎn)生多肽鏈的隨機(jī)斷裂[13]，一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的γ-PGA降解后暴露出的Glu殘基與蛋白質(zhì)中的Lys殘基之間通過非二硫共價(jià)鍵發(fā)生交聯(lián)[14]，使凝膠硬度和彈性隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大而增大，添加一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的TGase后，在TGase催化作用下，蛋白質(zhì)之間非二硫共價(jià)鍵的形成增加，γ-PGA-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間的交聯(lián)作用增強(qiáng)，形成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更加有序，從而使凝膠硬度和彈性進(jìn)一步提高，然而當(dāng)γ-PGA和TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)，凝膠硬度和彈性增加不明顯甚至減小，這可能是由于底物濃度已經(jīng)飽和，過高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的γ-PGA和TGase使得γ-PGA-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間過度交聯(lián)，造成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)無序化，從而影響凝膠硬度和彈性的提高[15]。將γ-PGA和TGase復(fù)合使用后對(duì)凝膠硬度和彈性的增強(qiáng)效果明顯大于單獨(dú)使用γ-PGA或TGase對(duì)凝膠硬度和彈性的增強(qiáng)效果，這說明γ-PGA和TGase之間可能存在協(xié)同作用。

2.2 γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響

γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響如圖2所示。

圖2 γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠保水性的影響Fig.2 Effect of γ-polyglutamic acid combined with TGase on water holding capacity of gelatin from chicken myofibrillar protein

由圖2可知，在未添加TGase時(shí)，隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，凝膠保水性呈先增大后減小的趨勢(shì)，且在γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%時(shí)，凝膠保水性達(dá)到最大值，這可能是由于一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的γ-PGA使體系中的凈電荷增加，靜電斥力也隨之增加，蛋白質(zhì)分子間的空隙增大，從而使凝膠保水性提高[16]。此外，由于γ-PGA側(cè)鏈上大量游離羧基所帶負(fù)電荷的排斥作用，使γ-PGA分子鏈的空間伸展很大[17]，即使在較低的濃度條件下，仍然能保持良好的吸水保濕性能，這有利于凝膠保水性的進(jìn)一步提高。添加TGase后，在同一TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，凝膠保水性隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大先顯著增大后變化不明顯，但在TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%、γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%時(shí)，凝膠保水性顯著減小(p<0.05)。在同一γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，隨著TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，凝膠保水性先顯著增大后變化不明顯，但在γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%時(shí)，添加0.7%的TGase反而使凝膠保水性顯著減小(p<0.05)。在TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%時(shí)，凝膠保水性達(dá)到最大值，與完全空白組相比提高了10.97%。凝膠保水性的增加主要是可移動(dòng)水的增加，其增加程度受蛋白質(zhì)內(nèi)在結(jié)構(gòu)和外在條件的影響，在凝膠制作過程中添加一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的TGase可以催化蛋白質(zhì)分子間形成異型肽鍵及致密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，加之受熱過程中一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的γ-PGA降解后與蛋白質(zhì)之間發(fā)生交聯(lián)使凝膠孔洞更加細(xì)小、均勻，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密，從而使更多的水分包埋或被結(jié)合在凝膠結(jié)構(gòu)中[18]，然而當(dāng)γ-PGA和TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)會(huì)造成γ-PGA-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間產(chǎn)生過度聚集作用，蛋白質(zhì)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，蛋白質(zhì)與水分子之間的相互作用減弱，從而對(duì)凝膠保水性能產(chǎn)生不利影響[19]。

2.3 γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠白度值的影響

γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠白度值的影響如圖3所示。

圖3 γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠白度值的影響Fig.3 Effect of γ-polyglutamic acid combined with TGase on whiteness of gelatin from chicken myofibrillar protein

當(dāng)TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0～0.1%、γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.06%時(shí)，在同一TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，凝膠白度值隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大變化較小(p>0.05)，然而在γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.06%時(shí)，隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，凝膠白度值逐漸減小(p<0.05)，且在γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%時(shí)，凝膠白度值達(dá)到最小值，這可能是由于隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，第二階段加熱過程中Maillard反應(yīng)的速度加快[20]，有色物質(zhì)的生成導(dǎo)致凝膠白度值降低；當(dāng)TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%～0.7%時(shí)，在同一TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，凝膠白度值隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大先明顯減小后變化不明顯。在同一γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，隨著TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，凝膠白度值先逐漸減小后變化不明顯。在TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%、γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%時(shí)，凝膠白度值最小，但與完全空白組相比僅降低了2.51%。造成凝膠白度值下降的原因可能是由于添加TGase和γ-PGA后，γ-PGA-蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)分子間發(fā)生共價(jià)交聯(lián)，蛋白質(zhì)的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更加緊密，降低了凝膠L*值，所以蛋白凝膠白度值降低[21]，這可能也與TGase本身的黃褐色使凝膠顏色加深有關(guān)。此外，凝膠白度值的變化與保水性也有一定的關(guān)系[22]，一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的γ-PGA和TGase使凝膠保水性增加，凝膠樣品表面的游離水減少，從而降低了與白度值正相關(guān)的L*值。

2.4 γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠化學(xué)作用力的影響

肌肉蛋白質(zhì)熱誘導(dǎo)凝膠形成的過程實(shí)際上是肌原纖維蛋白變性聚集的過程，在這個(gè)過程中，離子鍵、疏水相互作用、氫鍵和二硫鍵等化學(xué)作用力共同作用促使蛋白質(zhì)的凝膠結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[23]，而凝膠結(jié)構(gòu)的改變最終會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的凝膠特性產(chǎn)生重要影響。

2.4.1 γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠離子鍵、氫鍵和疏水相互作用的影響

γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠離子鍵、氫鍵和疏水相互作用的影響如圖4所示。

圖4 γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠離子鍵(a)、氫鍵(b)和疏水相互作用(c)的影響Fig.4 Effect of γ-polyglutamic acid combined with TGase on ionic bonds, hydrogen bonds and hydrophobic interactions of gelatin from chicken myofibrillar protein

由圖4可知，在未添加TGase時(shí)，離子鍵和氫鍵隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)，且在γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%時(shí)分別達(dá)到最大值，疏水相互作用隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈先增大后減小的趨勢(shì)；添加TGase后，在同一TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，離子鍵和氫鍵隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大逐漸減小，而疏水相互作用隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大先顯著增大后變化不明顯，這可能是由于γ-PGA側(cè)鏈上存在的大量活性較高的游離羧基與蛋白質(zhì)的親水基團(tuán)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)，從而使蛋白質(zhì)分子間的疏水相互作用增強(qiáng)，但在TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%、γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%時(shí)，疏水相互作用顯著減小(p<0.05)。在同一γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，隨著TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，離子鍵和氫鍵逐漸減小，這可能是由于在TGase的催化作用下，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，活性基團(tuán)被大量包埋或參與非二硫共價(jià)鍵的形成[24]，導(dǎo)致離子鍵和氫鍵逐漸減小，而疏水相互作用隨著TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大先顯著增大后變化不明顯，但在γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%、TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%時(shí)疏水相互作用反而明顯減小(p<0.05)。TGase能夠催化蛋白質(zhì)中Lys殘基的ε-氨基與Glu的γ-酰胺基之間形成ε-(γ-Glu)-Lys共價(jià)鍵，促進(jìn)蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)發(fā)生共價(jià)交聯(lián)[25]，隨著TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，交聯(lián)作用逐漸增強(qiáng)，更多的親水基團(tuán)被包埋在致密的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，從而使疏水相互作用逐漸增大，然而當(dāng)γ-PGA和TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高時(shí)，疏水相互作用增加不明顯甚至有所減小，這可能是由于底物濃度已經(jīng)飽和，過高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的γ-PGA和TGase使得γ-PGA-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間過度交聯(lián)，導(dǎo)致凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得無序，此時(shí)疏水相互作用已不能再改善蛋白質(zhì)的凝膠特性[26]。

FOEGEDING等[27]認(rèn)為，疏水相互作用在蛋白質(zhì)凝膠形成過程中起關(guān)鍵作用，適宜的疏水相互作用能減少肉糜體系中的熵值，促進(jìn)蛋白質(zhì)之間的聚集和交聯(lián)，從而促使其形成穩(wěn)定的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，但過強(qiáng)的疏水相互作用反而會(huì)導(dǎo)致凝膠脫水收縮，使凝膠強(qiáng)度降低，這與本文的研究結(jié)論相似。通過與圖1比較可知，疏水相互作用是維持蛋白質(zhì)凝膠三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的主要化學(xué)作用力，而離子鍵和氫鍵對(duì)維持蛋白質(zhì)凝膠三維結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定貢獻(xiàn)不大。

2.4.2 γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠活性巰基與總巰基的影響

γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠活性巰基和總巰基的影響如圖5所示。

圖5 γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠活性巰基(a)和總巰基(b)的影響Fig.5 Effect of γ-polyglutamic acid combined with TGase on active sulfhydryl(a) and total sulfhydryl(b) of gelatin from chicken myofibrillar protein

由圖5-(a)可知，在同一TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，活性巰基含量隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大顯著增大(p<0.05)，這可能是由于γ-PGA側(cè)鏈上大量活性較高的游離羧基使包埋在疏水基團(tuán)內(nèi)部的巰基暴露出來，在γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.06%以后，隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，活性巰基含量變化不明顯(p>0.05)。在同一γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，隨著TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，活性巰基含量先顯著減小后變化不明顯，特別是TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.06%時(shí)，活性巰基含量減小的幅度更大，這可能是因?yàn)樵赥Gase的催化作用下，γ-PGA-蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間交聯(lián)作用加強(qiáng)，在形成更加致密的凝膠三維結(jié)構(gòu)的過程中包埋了較多的活性巰基，從而使活性巰基含量隨著TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大逐漸減小。由圖5-(b)可知，γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)蛋白質(zhì)凝膠總巰基含量的影響較小，這說明γ-PGA和TGase對(duì)二硫鍵的形成影響也較小。有研究表明[28-31]，二硫鍵的形成主要受加熱方式和加熱程度的影響。

2.4.3 γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠溶解度的影響

含有SDS、尿素和β-疏基乙醇的Tris-HCl緩沖溶液可以斷裂肌原纖維蛋白凝膠中除ε-(γ-Glu)-Lys以外的其他化學(xué)鍵[32]。因此，蛋白質(zhì)凝膠中ε-(γ-Glu)-Lys非二硫共價(jià)鍵的多少可以根據(jù)其在上述試劑中溶解度的高低來判斷。γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠溶解度的影響如圖6所示。

由圖6可知，在未添加TGase時(shí)，凝膠溶解度隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大呈先減小后增大的趨勢(shì)，且在γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%時(shí)，凝膠溶解度較低；添加TGase后，在同一TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，凝膠溶解度呈明顯的下降趨勢(shì)，且在γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%時(shí)，凝膠溶解度較低，隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增大，凝膠溶解度變化不明顯，但在TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%、γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%時(shí)，凝膠溶解度有所增大(p<0.05)。

圖6 γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠溶解度的影響Fig.6 Effect of γ-polyglutamic acid combined with TGase on solubility of gelatin from chicken myofibrillar protein

在同一γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下，隨著TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，凝膠溶解度先減小后變化不明顯，但在γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%時(shí)，添加0.7%的TGase后反而使凝膠溶解度明顯增大(p<0.05)。在TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%時(shí)，凝膠溶解度較低，說明凝膠中非二硫共價(jià)鍵的形成量較高，這與圖1的結(jié)果基本一致，說明非二硫共價(jià)鍵也是維持凝膠三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的主要化學(xué)作用力。γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)蛋白質(zhì)凝膠溶解度的影響可能是由于在熱誘導(dǎo)凝膠形成的過程中，γ-PGA受熱降解暴露出的Glu殘基與蛋白質(zhì)中的Lys殘基交聯(lián)形成ε-(γ-Glu)-Lys非二硫共價(jià)鍵[14]，或在TGase的催化作用下，蛋白質(zhì)分子間或分子內(nèi)交聯(lián)形成ε-(γ-Glu)-Lys非二硫共價(jià)鍵[33]，當(dāng)γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)和TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)在一定范圍內(nèi)增大時(shí)，形成的ε-(γ-Glu)-Lys非二硫共價(jià)鍵也就越多，蛋白質(zhì)的凝膠特性也就越好，然而當(dāng)γ-PGA和TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高時(shí)，非二硫共價(jià)鍵增加趨勢(shì)變緩甚至有所減小，從而影響蛋白質(zhì)凝膠特性的進(jìn)一步提高。因此，γ-PGA和TGase只有在配比合理的情況下才能最大程度的發(fā)揮協(xié)同作用，從而極大的改善蛋白質(zhì)的凝膠特性。

2.5 γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖譜的影響

γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖譜的影響如圖7所示。

M-標(biāo)準(zhǔn)蛋白；C-未添加γ-PGA也未添加TGase的蛋白樣品；MHC-肌球蛋白重鏈；Actin-肌動(dòng)蛋白圖7 γ-PGA復(fù)合TGase對(duì)雞肉肌原纖維蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖譜的影響Fig.7 Effect of γ-polyglutamic acid combined with TGase on the SDS-PAGE pattern of chicken myofibrillar protein

從圖7-(a)中可以看出，與末添加γ-PGA的蛋白樣品相比，加入γ-PGA后的蛋白樣品其肌球蛋白重鏈(MHC)條帶和肌動(dòng)蛋白(Actin)條帶都明顯減弱。隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，MHC條帶和Actin條帶都逐漸減弱，這可能是由于在蛋白質(zhì)中少量的TGase的催化作用下，γ-PGA降解后產(chǎn)生的Glu殘基與蛋白質(zhì)中的Lys殘基發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)、形成大分子物質(zhì)，然而當(dāng)γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增大時(shí)，此時(shí)底物濃度已經(jīng)飽和，MHC條帶和Actin條帶并未隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步增大而繼續(xù)減弱。在含有γ-PGA的蛋白樣品中加入0.5%的TGase后，如圖7-(b)所示，隨著γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，MHC條帶和Actin條帶都逐漸減弱，且在γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大至0.06%后MHC條帶和Actin條帶變化都不明顯，這與圖1的結(jié)果一致。從圖7-(c)中可以看出，MHC條帶隨著TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大逐漸減弱，這是由于TGase催化MHC之間通過ε-(γ-Glu)-Lys共價(jià)鍵發(fā)生交聯(lián)并形成了大分子物質(zhì)[34]，但當(dāng)TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)一步增大時(shí)，MHC條帶并未發(fā)生明顯變化，在整個(gè)過程中Actin條帶也未發(fā)生明顯變化，說明Actin沒有參與TGase催化的交聯(lián)作用。在含有TGase的蛋白樣品中加入0.06%的γ-PGA后，如圖7-(d)所示，與未添加γ-PGA也未添加TGase的蛋白樣品相比，MHC條帶和Actin條帶都明顯減弱。隨著TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，MHC條帶逐漸減弱，而Actin條帶并未發(fā)生明顯變化。從圖7-(b)和圖7-(d)中可以看出，將γ-PGA和TGase復(fù)合使用后MHC條帶的減弱程度明顯大于單獨(dú)使用γ-PGA或TGase對(duì)MHC條帶的減弱程度，這說明γ-PGA和TGase復(fù)合使用時(shí)能夠最大限度地增強(qiáng)蛋白質(zhì)的交聯(lián)程度，進(jìn)而改善蛋白質(zhì)的凝膠特性。此外，從圖7-(a)、圖7-(b)、圖7-(d)中可以看出，在凝膠頂部存在著一些顏色很深的條帶，這可能是由于γ-PGA的分子量很高，其在高溫條件下降解后產(chǎn)生了一些分子質(zhì)量超過200 kDa的高分子物質(zhì)[35]，這些物質(zhì)在進(jìn)行凝膠電泳時(shí)無法進(jìn)入到濃縮膠和分離膠中，從而聚積在凝膠頂部。

3 結(jié)論

γ-PGA和TGase之間存在協(xié)同作用，將γ-PGA和TGase復(fù)合使用后對(duì)雞肉肌原纖維蛋白凝膠特性的改善效果明顯優(yōu)于單獨(dú)使用γ-PGA或TGase對(duì)凝膠特性的改善效果，且在TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.06%時(shí)，凝膠硬度、彈性和保水性都達(dá)到最大值；在TGase質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%、γ-PGA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%時(shí)凝膠白度值最小?；瘜W(xué)作用力分析表明，經(jīng)γ-PGA和TGase處理后，疏水相互作用和非二硫共價(jià)鍵是構(gòu)成凝膠三維結(jié)構(gòu)的主要作用力，離子鍵、氫鍵和二硫鍵是次要作用力，二硫鍵主要形成于加熱過程中。SDS-PAGE凝膠電泳圖譜結(jié)果表明，TGase能夠催化γ-PGA-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間通過ε-(γ-Glu)-Lys共價(jià)鍵發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)并形成大分子物質(zhì)，使肌原纖維蛋白凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)變得更加致密。

[1] 陳建良，芮漢明，變性淀粉在高靜壓下對(duì)雞肉糜品質(zhì)及其微觀結(jié)構(gòu)的影響[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2009, 35(10): 152-157.

[2] 倪學(xué)文, 嚴(yán)文莉, 汪芳麗, 等. 魔芋膠對(duì)雞肉和豬肉混合肉糜凝膠特性的影響[J]. 食品工業(yè)科技, 2015, 36(8): 305-308.

[3] ISHWAR BAJAJ, REKHA SINGHAL. Poly(glutamic acid)-An emerging biopolymer of commercial interest[J]. Bioresource Technology, 2011, 102(10): 5 551-5 561.

[4] ADETORO OGUNLEYE, ADITYA BHAT, VICTOR U, et al. Poly-γ-glutamic acid: production, properties and applications[J]. Microbiology, 2015, 161: 1-17.

[5] TANIMOTO H, MORI M, MOTOKI M, et al. Natto mucilage containing poly-γ-glutamic acid increases soluble calcium in the rat small intestine[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2001, 65(3): 516-521.

[6] HO G H, HO T I, HSIEH K H, et al. Gamma-Polyglutamic acid produced byBacillussubtilis(natto): structural characteristics, chemical properties and biological functionalities[J]. Journal of the Chinese Chemical Society, 2006, 53(6): 1 363-1 384.

[7] XIONG Y L. A comparison of the rheological characteristics of different fraction of chicken myofibrillar proteins[J]. Journal of Food Biochemistry, 1993, 16(4): 217-227.

[8] SALVADOR P, TOLDRA M, SAGUER E, et al. Microstructure-function relationships of heat-induced gels of porcine haemoglobin [J]. Food Hydrocolloids, 2009, 23(7):1 654-1 659.

[10] ELLMAN G L. Tissue sulfhydryl groups[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1959, 82(1): 70-77.

[11] RAWDKUEN S, BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, et al. Chicken plasma protein affects gelation of surimi from bigeye snapper (Priacanthustayenus)[J]. Food Hydrocolloids, 2004, 18(2): 259-270.

[12] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophageT4[J]. Nature, 1970, 227(5 259): 680- 685.

[13] GOTO A, KUNIOKA M. Biosynthesis and hydrolysis of poly(glutamic acid) fromBacillussubtilisIFO3335[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 1992, 56(7): 1 031-1 035.

[14] SEO J H, KIM C S, LEE S P. Physicochemical properties of poly-γ-glutamic acid produced by a novelBacillussubtilisHA isolated from Cheonggukjang[J]. Preventive Nutrition and Food Science, 2008, 13(4): 354-361.

[15] TSAI G, LIN S, JIANG S T. Trangsglutaminase from streptoverticillium ladakanum and application to minced fish product[J]. Journal of food science, 1996, 61(6): 1 234-1 238.

[16] WESTPHALEN A D, BRIGGS J L, LONERGAN S M. Influence of pH on rheological properties of porcine myofibrillar protein during heat induced gelation[J]. Meat Science, 2005, 70(2): 293-299.

[17] 王靜心, 李政, 張健飛, 等. γ-聚谷氨酸水凝膠研究與應(yīng)用進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2014, 41(8): 1 649-1 654.

[18] SOOTTAWAT B, WONNOP V, SUTTIRAK P. Suwari gel properties as affected by transglutaminase activator and inhibitors[J]. Food Chemistry, 2004, 85(1): 91-99.

[19] MARTELO-VIDAL M J, FERNNDEZ-NO I C, GUERRA-RODRGUEZ E, et al. Obtaining reduced-salt restructured white tuna (Thunnusalalunga) mediated by microbial transglutaminase[J]. LWT-Food Science and Technology, 2016, 65: 341-348.

[20] TARR H L A. Ribose and the Maillard reaction in fish muscle[J]. Nature, 1953, 4 347(171): 344-345.

[21] URESTI R M, RAMIREZ J A, LOPEZ-ARIAS N, et al. Negative effect of combining microbial transglutaminase with low methoxyl pectins on the mechanical properties and colour attributes of fish gels[J]. Food Chemistry, 2003, 80(4): 551-556.

[22] YANG H, PARK J W. Effects of starch properties and thermal-processing conditions on surimi-starch gels[J]. LWT-Food Science and Technology, 1998, 31(4): 344-353.

[23] VISSCHERS R W, DE JONGH H H J. Disulphide bond formation in food protein aggregation and gelation[J]. Biotechnology Advances, 2005, 23(1): 75-80.

[24] LIU H, GAO L, REN Y, et al. Chemical interactions and protein conformation changes during silver carp (Hypophthalmichthysmolitrix) surimi gel formation[J]. International Journal of Food Properties, 2014, 17(8): 1 702-1 713.

[25] DONDERO M, FIGUEROA V, MORALES X, et al. Transglutaminase effects on gelation capacity of thermally induced beef protein gels[J]. Food Chemistry, 2006, 99(3): 546-554.

[26] TAKEDA H, SEKI N. Enzyme-catalyzed cross-linking and degradation of myosin heavy chain in walleye pollack surimi paste during setting[J]. Fisheries Science, 1996, 62(3): 462-467.

[27] FOEGEDING E A, LANIER T C, HULTIN H O. Characteristics of edible muscle tissues[J]. Food Chemistry, 1996, 3(15): 879-942.

[28] HOSSAIN M I, ITOH Y, MORIOKA K, et al. Contribution of the polymerization of protein by disulfide bonding to increased gel strength of walleye pollack surimi gel with preheating time[J]. Fisheries Science, 2001, 67(4): 710-717.

[29] KO W C, YU C C, HSU K C. Changes in conformation and sulfhydryl groups of tilapia actomyosin by thermal treatment[J]. LWT-Food Science and Technology, 2007, 40(8): 1 316-1 320.

[30] SANO T, OHNO T, OTSUKA-FUCHINO H, et al. Carp natural actomyosin: thermal denaturation mechanism[J]. Journal of Food Science, 1994, 59(5): 1 002-1 008.

[31] JIANG S T, Lan C C, TSAO C Y U. New approach to improve the quality of minced fish products from freeze-thawed cod and mackerel[J]. Journal of Food Science, 1986, 51(2): 310-312.

[32] BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, SRIVILAI C. Porcine plasma proteins as gel enhancer in bigeye snapper (Priacanthustayenus) surimi[J]. Journal of Food Biochemistry, 2001, 25(4): 285-305.

[33] KIMURA I M, SUGIMOTO M, TOYODA K, et al. A study on the cross-links reaction of myosin in kamaboko ‘suwari’gels[J]. Nippon Suisan Gakkaishi, 1991, 57: 1 386-1 389.

[34] JIANG S T, HSIEH J F, HO M L, et al. Microbial transglutaminase affects gel properties of golden threadfin- bream and pollack surimi[J]. Journal of Food Science, 2000, 65(4): 694-699.

[35] KUNIOKA M AND CHOI H. Hydrolytic degradation and mechanical properties of hydrogels prepared from microbial poly (amino acid) s[J]. Polymer Degradation and Stability, 1998, 59(1):33-37.