陜西關(guān)中地區(qū)羊乳中細(xì)菌多樣性的分析

高佳媛，邵玉宇，雷飛艷，王畢妮，張富新

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

羊乳營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，富含蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、氨基酸、礦物質(zhì)以及多種維生素，有“白色血液”之稱，是人類主要的乳源之一[1]。由于羊乳的成分豐富，為不同的細(xì)菌提供了優(yōu)良的生存環(huán)境，是細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的天然培養(yǎng)基。羊乳中的細(xì)菌種類和數(shù)量對(duì)乳品的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和保質(zhì)期有著重要影響，完整的解析羊乳中細(xì)菌微生物的多樣性，對(duì)有效利用原料羊乳中有益菌、防止有害菌滋生及提高羊乳安全和質(zhì)量具有重要意義。

自然界大多數(shù)微生物處于活的非可培養(yǎng)狀態(tài)，且環(huán)境中的微生物群落信息比較豐富和復(fù)雜，采用常規(guī)的分離、純化、培養(yǎng)及鑒定方法不易獲取樣品中完整的微生物群落結(jié)構(gòu)信息[2-3]。隨著分子生物學(xué)方法的發(fā)展，焦磷酸測(cè)序、AB SOLiD sequencer、單分子測(cè)序技術(shù)和Illumina Solexa高通量測(cè)序平臺(tái)[4]等新的檢測(cè)技術(shù)受到廣大學(xué)者的關(guān)注，這些方法測(cè)序通量大、速度快、精度高、成本較低，不需要對(duì)微生物進(jìn)行純培養(yǎng)，可直接從樣品中提取DNA，進(jìn)行特異性擴(kuò)增后測(cè)序，為更好的挖掘環(huán)境中微生物新資源提供了很好的平臺(tái)，成為環(huán)境樣品中菌種鑒定、研究微生物群落組成結(jié)構(gòu)的重要手段[5-7]。

目前，對(duì)于食品中細(xì)菌多樣性的研究主要集中在發(fā)酵乳和泡菜，對(duì)于原料乳的細(xì)菌多樣性研究也以牛乳為主，對(duì)羊乳中細(xì)菌群落組成研究較少。本研究以陜西關(guān)中地區(qū)的羊乳為原料，提取羊乳中微生物宏基因組DNA，對(duì)16S rRNA基因V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增、高通量測(cè)序，研究羊乳中細(xì)菌的組成及豐度，解析羊乳中細(xì)菌微生物的多樣性，對(duì)羊乳中有害微生物的防控具有指導(dǎo)價(jià)值，同時(shí)為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用羊乳中微生物資源提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 羊乳

樣品采自陜西省楊凌、寶雞、渭南3個(gè)地區(qū)的乳樣。人工擠乳后將樣品快速置于無(wú)菌管中，編號(hào)后立即將樣品置于冰盒中運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室于-40 ℃冰箱中保存。

每個(gè)地區(qū)分別取兩個(gè)牧區(qū)的混合乳樣進(jìn)行多樣性分析。楊凌西農(nóng)羊場(chǎng)、寶雞地區(qū)和渭南地區(qū)各采取2個(gè)乳樣，編號(hào)分別為Y1、Y2、B1、B2、W1和W2。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

糞便DNA基因組提取試劑盒，QIAGEN公司；DNA Marke、PCR擴(kuò)增試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；PCR引物，上海生工生物工程公司。

1.3 儀器設(shè)備

L5S L6/L6S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海儀電分析儀器有限公司；DYY-12電泳儀，北京六一儀器廠；BIO-BEST200E凝膠成像儀，美國(guó)西蒙；ARITIK型PCR擴(kuò)增儀，美國(guó)熱電公司；LDZX-30KBS手輪式自動(dòng)不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 羊乳中總DNA提取及純度測(cè)定

1.4.2 16S rRNA基因的V3-V4區(qū)特異性擴(kuò)增

本試驗(yàn)以樣品總DNA稀釋液(l00 ng/uL)作為PCR擴(kuò)增反應(yīng)的模板進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增，以341F：5’-CCTAYGGGRBGCASCAG-3’和907R：5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’為引物，對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(25 μL)為：10×PCR buffer (Mg2+) 2.5 μL，dNTP mix (10 mmol/L) 2.0 μL，引物(10 pmol/μL)各1 μL，Tap DNA polymerase (5 U/μL) 0.3 μL，模板DNA (100 ng/μL) 1μL，用ddH2O補(bǔ)充至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)行30次循環(huán)(94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min)，最后72 ℃末端延伸10 min，4 ℃保溫。擴(kuò)增完畢后，用1.5%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，30 min后在凝膠成像儀紫外下查看結(jié)果。

1.4.3 PCR產(chǎn)物的混樣和純化及測(cè)序

將擴(kuò)增產(chǎn)物等量混合后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，成功后回收擴(kuò)增產(chǎn)物。使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit和Q-PCR定量，文庫(kù)合格后，用HiSeq2500 PE250執(zhí)行測(cè)序。

1.4.4 高序列質(zhì)量控制

參照Qiime(V1.7.0，http://qiime.org/scripts/split_libraries_fastq.html)[10]的Tags質(zhì)量控制流程來(lái)處理原始數(shù)據(jù)(Raw Tags)。截去Barcode和引物序列后，使用FLASH(V1.2.7, http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/)[11]對(duì)每個(gè)樣品的reads進(jìn)行拼接、質(zhì)控[12]，得到有效數(shù)據(jù)(Clean Tags)、去除嵌合體序列[13-14]后得到高質(zhì)量序列(Effective Tags)進(jìn)行多樣性分析。

1.4.5 序列生物信息學(xué)分析

用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/)[15]對(duì)所有乳樣的全部有效Tags進(jìn)行聚類，按照序列一致性為97%將序列聚類成為操作分類單元(OTUs，Operational Taxonomic Units)，同時(shí)選取OTUs代表性序列并進(jìn)行物種注釋，通過(guò)使用Mothur方法和SILVA(http://www.arb-silva.de/)[16]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)用來(lái)進(jìn)行物種注釋(閾值設(shè)定為0.8～1)，從而得到分類學(xué)信息并在各個(gè)水平進(jìn)行分類。Chao1，Simpson，Shannon，ACE指數(shù)用Qiime軟件來(lái)計(jì)算。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品高通量測(cè)序結(jié)果

將提取好的羊乳總DNA的16S rRNA基因進(jìn)行V3-V4區(qū)擴(kuò)增，合格后進(jìn)行高通量測(cè)序。通過(guò) Illumina HiSeq高通量測(cè)序，原始數(shù)據(jù)質(zhì)控、去除嵌合體處理后，本研究共從6個(gè)測(cè)序樣品中獲得了225 424條高質(zhì)量的16 SrRNA基因序列(Effective Tags)，將所有樣品的Effective Tags進(jìn)行聚類，以97%的一致性將序列聚類成OUT，然后對(duì)OTUs的代表序列進(jìn)行物種注釋，平均每個(gè)樣品聚成673個(gè)OTUs。各乳樣測(cè)序信息見(jiàn)表1。由表1可知，本測(cè)序結(jié)果Q20都大于98%，表示有98%以上的堿基測(cè)序的正確率均達(dá)到了99%，表明測(cè)序結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可進(jìn)行下一步分析。

表1 各樣品的測(cè)序標(biāo)簽

注：Y、B、W分別代表陜西楊凌市西農(nóng)羊場(chǎng)、寶雞市千陽(yáng)縣、渭南市富平縣3個(gè)地區(qū)的乳樣，下同。

2.2 羊乳中細(xì)菌群落構(gòu)成

2.2.1 特定物種分類樹(shù)

通過(guò)對(duì)所有乳樣進(jìn)行物種分類，篩選特別關(guān)注的物種(相對(duì)豐度排名前10的屬)進(jìn)行物種分類樹(shù)統(tǒng)計(jì)[17]，結(jié)果見(jiàn)圖1。從左至右的分類水平分別為界、門、綱、目、科、屬、種；不同灰度的圓圈表示不同的乳樣，對(duì)應(yīng)左側(cè)圖例；圓圈中扇形的大小代表在該分類水平上細(xì)菌的相對(duì)豐度大??；細(xì)菌名稱下方的兩個(gè)數(shù)字均表示相對(duì)豐度百分率，前者表示該分類占該樣品中所有分類物種的百分率，后者則表示該分類占該樣品所選取的分類物種中的百分率。從圖1可以看出，樣品中在門水平上豐度大于1%的物種依次為Proteobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes；在綱水平上豐度較大的物種有Gammaproteobacteria、Betaproteobacteria和Bacilli等；在目分類水平上含量較多的細(xì)菌目有Pseudomonadales、Enterobacteriales和Burkholderiales等；含量超過(guò)1%的細(xì)菌科有Enterobacteriaceae、Moraxellaceae、Pseudomonadaceae和Alcaligenaceae等；在屬水平上豐度較大的物種依次為Enterobacter、Acinetobacter、Pseudomonas、Staphylococcus、Massilia和Stenotrophomonas等。

圖1 各乳樣中特定物種分類樹(shù)Fig.1 Classification tree of specific species in samples

2.2.2 物種相對(duì)豐度展示

選取每個(gè)乳樣或分組在屬水平上最大豐度排名前10的物種，生成物種相對(duì)豐度柱形累加圖，以便直觀查看各樣品在屬水平上，相對(duì)豐度較高的物種及其比例。物種相對(duì)豐度柱形圖如圖2和圖3。

從圖2和圖3中可以看出，6個(gè)樣品在屬水平上物種豐度大小依次均為Enterobacter、Acinetobacter、Pseudomonas、Staphylococcu、Stenotrophomonas和Massilia等，其中楊凌地區(qū)Enterobacter最高，占總菌屬37.4%，在Y1和Y2兩個(gè)牧場(chǎng)中分別占32.9%和41.9%；在寶雞兩個(gè)牧場(chǎng)分別占33.1%和34.5%；Enterobacter在渭南地區(qū)的乳樣所占比例最小，僅占2.87%。渭南地區(qū)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為Acinetobacter，占總細(xì)菌數(shù)的33.9%，W1和W2兩個(gè)牧場(chǎng)各占28.9%和38.8%。

圖2 各分組在屬水平上的物種相對(duì)豐度柱形圖Fig.2 The relative abundance of species at the genus level between groups

圖3 各樣品在屬水平上的物種相對(duì)豐度柱形圖Fig.3 The relative abundance of species at the genus level between samples

2.2.3 羊乳中細(xì)菌群落門水平分布

本研究中，在所有羊乳樣品中共有27種細(xì)菌門被鑒定出，含量超過(guò)0.1%的細(xì)菌門有Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、Thaumarchaeota和Cyanobacteria，各個(gè)樣品中的細(xì)菌群落門分布見(jiàn)表2。

表2 羊乳中細(xì)菌群落在門水平分類

由表2可知，3個(gè)地區(qū)羊乳中的細(xì)菌門組成存在一定的差異。Proteobacteria為陜西關(guān)中地區(qū)羊乳中的優(yōu)勢(shì)菌群門，其中渭南地區(qū)所占比例最高，為91.15%，在楊凌和寶雞地區(qū)分別占62.44%和60.33%，且渭南地區(qū)的Proteobacteria含量和其他兩個(gè)地區(qū)具有顯著性差異。Firmicutes在楊凌和寶雞地區(qū)所占比例較高，分別為19.14%和19.48%，在楊凌地區(qū)僅占4.23%，且楊凌、寶雞地區(qū)和渭南地區(qū)的Firmicutes含量具有顯著性差異。Bacteroidetes在楊凌、寶雞和渭南地區(qū)所占比例分別為4.51%、2.32%和0.66%，各地區(qū)間無(wú)顯著性差異。Actinobacteria、Thaumarchaeota和Cyanobacteria在3個(gè)地區(qū)的細(xì)菌門中所占比例較低，且楊凌和寶雞地區(qū)這3種細(xì)菌門的含量均高于渭南地區(qū)。

2.2.4 羊乳中細(xì)菌群落屬水平分布

在所有羊乳中共鑒定出了354種細(xì)菌屬，含量超過(guò)0.5%的細(xì)菌屬有Enterobacte、Acinetobacter、Pseudomonas、Staphylococcus、Stenotrophomonas、Massilia、Bacillus、Streptococcus、Bacteroides、Delftia、Lachnoclostridium、E.Shigella、Janthinobacterium、Lactococcus、Sphingomonas和Bradyrhizobium。排名前5的細(xì)菌屬在3個(gè)地區(qū)的相對(duì)含量分布見(jiàn)表3。

表3 羊乳中細(xì)菌群落在屬水平分類

由表3可以看出，楊凌兩個(gè)羊場(chǎng)主要以Enterobacter、Pseudomonas和Acinetobacter等細(xì)菌種屬為主，寶雞兩個(gè)羊場(chǎng)主要以Enterobacter、Staphylococcus和Pseudomonas等細(xì)菌種屬為主，渭南兩個(gè)羊場(chǎng)主要以Acinetobacter、Pseudomonas和Stenotrophomonas等細(xì)菌種屬為主。Enterobacter是關(guān)中地區(qū)羊乳中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬，在總細(xì)菌屬中含量最多，3個(gè)地區(qū)所占比例分別為37.41%、33.82%和2.87%。Acinetobacter在渭南地區(qū)所占比例較高，為33.85%，在楊凌和寶雞地區(qū)所占比例較小，分別為2.31%和3.63%。Pseudomonas在渭南地區(qū)的相對(duì)含量高于楊凌和寶雞地區(qū)，分別為6.54%、6.26%和26.59%，楊凌和渭南地區(qū)、寶雞和渭南地區(qū)的Pseudomonas含量具有顯著性差異，楊凌和寶雞地區(qū)的Pseudomonas含量無(wú)顯著性差異。Staphylococcus在楊凌、寶雞和渭南地區(qū)所占比例分別為4.27%、7.94%和0.37%，各地區(qū)間無(wú)顯著性差異。Stenotrophomonas在渭南地區(qū)含量較高，占8.5%，在楊凌和寶雞地區(qū)僅占0.51%和0.63%。

2.2.5 羊乳中細(xì)菌群落種水平分布

在陜西3個(gè)地區(qū)所有羊乳中共鑒定出了細(xì)菌種有826種，含量超過(guò)0.5%的細(xì)菌種有P.aeruginosa、A.johnsonii、P.geniculata、B.anthracis、D.tsuruhatensis、E.coli、J.lividum、L.lactis、R.gnavus、S.thermophilus和B.elkanii，3個(gè)地區(qū)排名前5的細(xì)菌種相對(duì)含量分布見(jiàn)表4。

表4 羊乳中細(xì)菌群落在種水平分類

由表4可以看出，菌種P.aeruginosa在3個(gè)地區(qū)中含量最高，為陜西關(guān)中地區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌株。P.aeruginosa在楊凌和寶雞地區(qū)所占比例較小，分別占1.17%和0.81%，在渭南地區(qū)的乳樣中所占比例達(dá)21.8%，顯著高于其他兩個(gè)地區(qū)。菌種A.johnsonii在渭南地區(qū)所占比例也較高，而在楊凌和寶雞地區(qū)僅占0.45%和1.26%。渭南地區(qū)的P.geniculata、B.anthracis和D.tsuruhatensis含量均顯著高于楊凌和寶雞地區(qū)。

2.3 不同地區(qū)羊乳樣品細(xì)菌群體間的多樣性分析

2.3.1 不同地區(qū)羊乳中細(xì)菌的多樣性指數(shù)

一般來(lái)說(shuō)，序列相似性在97%以上的聚類成為一個(gè)OTU的序列，可斷定可能是源自于同一個(gè)種的序列。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同乳樣在97%相似性下的多樣性進(jìn)行分析，用Chao，Shannon, Simpson，Observed species和ACE這5個(gè)多樣性指數(shù)，綜合體現(xiàn)羊乳中細(xì)菌群落的豐富度和均勻度，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 不同地區(qū)羊乳樣品的多樣性指數(shù)

群落豐富度由Chao或ACE指數(shù)決定，值越高，表明越豐富越高；群落多樣性則由Shannon和Simpson值決定；Shannon值越高、Simpson值越低，則表明群落多樣性越高，Observed species表示實(shí)際測(cè)到的OTU數(shù)量。由表5可以看出，不同地區(qū)羊乳樣品中細(xì)菌的多樣性各有差異。楊凌和寶雞地區(qū)羊乳中細(xì)菌Chao指數(shù)、ACE指數(shù)和Shannon指數(shù)值明顯高于渭南地區(qū)，Simpson值低于渭南地區(qū)，表明楊凌和寶雞這兩個(gè)地區(qū)羊乳中細(xì)菌群落豐富度和多樣性較高，渭南地區(qū)羊乳中細(xì)菌群落豐富度和多樣性較低。楊凌和寶雞地區(qū)羊乳的OTUs數(shù)也高于渭南地區(qū)，說(shuō)明楊凌和寶雞地區(qū)羊乳樣品的細(xì)菌種類較為豐富。

2.3.2 UPGMA聚類樹(shù)

為了研究陜西3個(gè)地區(qū)不同乳樣間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性，使用UPGMA(Unweighted pair-group method with arithmetic mean)聚類分析方法對(duì)乳樣進(jìn)行了聚類分析，將聚類結(jié)果與各乳樣在門水平上的物種豐度進(jìn)行整合從而構(gòu)建出樣品的Weighted Unifrac聚類樹(shù)[18-19]，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，所有樣品共聚成兩大類和三小類。其中第一小類包括Y1和B2，第二小類包括Y2和B1，第三小類包括W1和W2?？傮w來(lái)說(shuō)，不同地區(qū)之間的羊乳菌群有一定的差異性，聚類之間的不同可能與不同的采樣地點(diǎn)有關(guān)；但是，樣品之間微生物群落結(jié)構(gòu)差距不大，有一定的相似性，這可能是由于采樣地區(qū)都位于陜西省關(guān)中地帶，乳山羊的品種、飲食情況、所處環(huán)境氣候等因素都比較相似，導(dǎo)致其乳樣的菌群結(jié)構(gòu)比較接近。

圖4 基于Weighted Unifrac距離的UPGMA聚類樹(shù)Fig.4 UPGMA clustering tree based on Weighted Unifrac distance

3 討論

高通量測(cè)序技術(shù)具有高靈敏度、低運(yùn)行成本、測(cè)序深度高等突出優(yōu)勢(shì)，目前已經(jīng)廣泛于應(yīng)用食品工業(yè)，主要針對(duì)其中的微生物多樣性進(jìn)行分析，使人們對(duì)食品中微生物群落結(jié)構(gòu)有更多的了解。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)羊乳細(xì)菌多樣性研究比較少，本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)陜西關(guān)中3個(gè)地區(qū)(渭南富平、寶雞千陽(yáng)、楊凌西農(nóng)羊場(chǎng))羊乳的菌群結(jié)構(gòu)和微生物多樣性進(jìn)行研究，在所有羊乳樣品中共鑒定出了13種細(xì)菌門，含量超過(guò)0.5%的細(xì)菌門分別為Proteobacteria(71.31%)、Firmicutes(14.28%)、Bacteroidetes(2.50%)和Actinobacteria(0.65%)，其中Proteobacteria是優(yōu)勢(shì)菌門，這4種菌門的含量占到總數(shù)的88.73%。在屬的水平上，在所有羊乳樣品中含量均超過(guò)0.5%分別為Enterobacter、Acinetobacter、Pseudomonas和Staphylococcus等。TORMO[20]等對(duì)法國(guó)朗格多克-魯西永比利牛斯的羊乳中細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌屬有Staphylococcus、Arthrobacter和Serratia，與本試驗(yàn)結(jié)果共有的優(yōu)勢(shì)菌屬是Staphylococcus?？傮w而言，羊乳中有相似的細(xì)菌菌群，但是由于地區(qū)不同，其飲食，海拔，溫度，濕度等有很大的差異，導(dǎo)致不同地區(qū)之間羊乳中微生物群落結(jié)構(gòu)有差異。

通過(guò)高通量測(cè)序?qū)ζ渌先橹形⑸锒鄻有缘难芯恳灿袌?bào)道。韓瑞芳[21]對(duì)山東和寧夏地區(qū)牛乳中細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山東地區(qū)乳樣中優(yōu)勢(shì)種屬細(xì)菌菌群是Acinetobactersp和Klebsiellasp，寧夏地區(qū)在乳樣中21株優(yōu)勢(shì)種屬細(xì)菌菌群是L.lactissubsp.lactis和Acinetobactersp。張敏[22]等對(duì)新疆地區(qū)不同原料乳中微生物多樣性分析，發(fā)現(xiàn)牛乳中優(yōu)勢(shì)菌屬是Pseudomonas、Enterobacter和Lactococcus，駝乳優(yōu)勢(shì)菌屬是E.Shigella、Enterobacter和Lactococcus，馬乳優(yōu)勢(shì)菌屬是Leuconostoc、Acinetobacter和Lactococcus。COLLADO[23]等通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)健康人乳中細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌群是Staphylococcus、Streptococcus、Bifidobacterium和Lactobacillus。目前，研究牛乳中微生物多樣性已經(jīng)非常普遍。通過(guò)高通量測(cè)序，我們了解到牛乳中優(yōu)勢(shì)菌群主要是Acinetobactersp、Klebsiella、Enterobacte和Lactococcus等，和羊乳中微生物結(jié)構(gòu)具有一定的差異性，可能是由于羊乳中酪蛋白含量、脂肪球直徑、乳糖比例和各種氨基酸含量都不同于牛乳[24]，乳成分的差異可能導(dǎo)致其中微生物組成的差異。

此外，在對(duì)羊乳中的細(xì)菌進(jìn)行分析時(shí)，除了P.aeruginos和A.johnsonii等含量較多的菌種外，我們發(fā)現(xiàn)還存在一定量的L.reuteri、W.cibaria、P.aeruginosa菌種及細(xì)菌屬Staphylococcus、Alcaligenes、Psychrobacte等。KRASSE[25]等通過(guò)對(duì)患有牙齦炎的患者服用L.reuteri，發(fā)現(xiàn)L.reuteri可以有效治療牙齦出血和牙齦炎癥。熊濤[26]等發(fā)現(xiàn)L.reuteriNCU801發(fā)酵液對(duì)E.coliCMCC444有明顯的抑制作用。姚沛琳[27]等通過(guò)對(duì)引起齲齒的一種主要病原菌S.mutansATCC 25175的研究，發(fā)現(xiàn)了W.cibaria對(duì)齲齒具有一定的預(yù)防作用。這些細(xì)菌的益生性能的研究為以后羊乳中益生菌的提取和開(kāi)發(fā)利用提供一定的科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，Staphylococcus經(jīng)常被檢測(cè)出來(lái)與食品中毒有關(guān)[28]，主要是由于食用了含有S.aureus的食品，而對(duì)于原料乳則是常見(jiàn)的感染來(lái)源[29]，S.aureus污染會(huì)導(dǎo)致乳產(chǎn)品質(zhì)量下降，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[30]。羊乳中存在著一些在貯藏期間會(huì)產(chǎn)生耐熱脂肪酶和耐熱蛋白酶的嗜冷菌，如細(xì)菌屬Alcaligenes[31]、Psychrobacter[32]，細(xì)菌種P.psychrotoleran[33]、P.celer[34]等，這些細(xì)菌在巴氏殺菌處理后仍然會(huì)有殘留，在貯藏期間產(chǎn)生的耐熱脂肪酶能分解脂肪產(chǎn)生游離的脂肪酸，耐熱蛋白酶能分解蛋白導(dǎo)致酪蛋白膠束不穩(wěn)定，使乳發(fā)生凝固現(xiàn)象，且產(chǎn)生的氨基酸會(huì)使產(chǎn)品發(fā)生褐變，導(dǎo)致乳及乳制品的風(fēng)味劣化[35]。研究這些有害菌，對(duì)于防止羊乳中有害菌滋生，提高羊乳安全和質(zhì)量具有重要意義。

4 結(jié)論

以陜西地區(qū)3個(gè)牧場(chǎng)的羊乳樣品為研究對(duì)象，利用高通量測(cè)序技術(shù)研究羊乳中細(xì)菌多樣性和群落的組成結(jié)構(gòu)。對(duì)不同地區(qū)羊乳中細(xì)菌群落構(gòu)成分析顯示，所有羊乳樣品中細(xì)菌門有27種，以變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)為主，分別占71.31%和14.28%；細(xì)菌屬有354種，以腸桿菌屬(Enterobacter)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)和假單胞菌屬(Pseudomonas)為主，分別占24.69%、13.26%和13.13%；細(xì)菌種有826種，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌種有銅綠假單胞菌(P.aeruginos)、約氏不動(dòng)桿菌(A.johnsonii)和彎曲假單胞菌(P.geniculata)，分別占7.96%、4.34%和3.20%。

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