半胱氨酸/納米金修飾電極差分脈沖伏安法測(cè)定蘆丁

黃玉斌，嚴(yán)春榮，王齊

（1.玉溪市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測(cè)中心，云南玉溪653100；2.昆明理工大學(xué)分析測(cè)試研究中心，云南昆明650000；3.云南省分析測(cè)試中心，云南昆明650000）

蘆?。≧utin）又名蕓香苷，普遍存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)、種子中，是一種具有生物活性的重要黃酮類物質(zhì)[1]。其分子中的α、β不飽和吡喃酮是各種生物活性的關(guān)鍵基團(tuán)，而A、B、C三環(huán)的各種取代基則決定了其特定的藥效作用，從而決定了其不同生物活性。經(jīng)過大量的研究表明，蘆丁具有抗炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗癌抗腫瘤、抑制醛糖還原酶活性和治療毛細(xì)血管通透性增高引起的出血癥等功效，并且對(duì)器官缺血損傷也有保護(hù)與修復(fù)作用[2]。蘆丁的以上性質(zhì)，使其成為許多中成藥試劑或保健食品的重要性指標(biāo)組分，因此研究簡(jiǎn)便、快捷、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法具有實(shí)際意義。蘆丁分子結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 蘆丁分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of rutin

目前蘆丁的檢測(cè)方法主要是高效液相色譜法和分光光度法，其中高效液相色譜法是一種比較準(zhǔn)確的分離、定量測(cè)定方法[3－4]，但是其具有龐大的色譜分離系統(tǒng)、較高儀器與試劑成本的缺點(diǎn)；而紫外分光光度法在實(shí)際樣品測(cè)定中，經(jīng)常會(huì)受到共存還原性組分或樣品自身空白的影響，使測(cè)定結(jié)果比實(shí)際含量偏高30%～100%以上[5]。如何簡(jiǎn)便、高效地對(duì)復(fù)雜體系中蘆丁含量進(jìn)行定量分析，成為分析工作者的難題。近十年來，電化學(xué)分析法利用物質(zhì)在特定電極上氧化還原電位的不同，建立起了多種測(cè)定微、痕量物質(zhì)的方法，如循環(huán)伏安法、差分脈沖伏安法、溶出伏安法等[6－10]，在未對(duì)物質(zhì)進(jìn)行預(yù)分離的情況下，這些方法對(duì)復(fù)雜體系中某一組分的定量測(cè)定有很好的效果。

本研究利用半胱氨酸分子在金表面和金納米的自組裝性質(zhì)，制備了一種多層結(jié)構(gòu)的修飾電極，研究了蘆丁分子在修飾電極上的電化學(xué)性質(zhì)，并利用蘆丁分子在修飾電極上的差分脈沖伏安響應(yīng)信號(hào)，建立了一種高靈敏度測(cè)定蘆丁含量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

CHI660C電化學(xué)工作站、電化學(xué)測(cè)量采用三電極體系、金圓盤電極（φ＝2mm）、飽和甘汞參比電極、鉑絲輔助電極：美國(guó)CHI公司；Milli－Q Element超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；SK3300H超聲波清洗儀：中國(guó)科導(dǎo)公司。

L－半胱氨酸（＞98.5%）、氯金酸（HAuCl4，99%）：Aldrich公司；甲醇、檸檬酸、磷酸、濃硫酸（均為分析純）：Aladdin公司。

1.2 Au納米微粒的制備

Au納米微粒的制備采用簡(jiǎn)單的Frens法[11－13]，即在100 mL沸水中加入30 mg檸檬酸，在攪拌加熱下緩慢滴加入2 mL 0.5 mg/mL HAuCl4，反應(yīng)30 min后立即用冰水浴冷卻至室溫后4℃保存。

1.3 修飾電極的制備

電極的預(yù)處理：將金圓盤電極在金相砂紙上打磨，再依次用 0.3、0.1、0.05 μm Al2O3粉拋光，用水超聲清洗數(shù)分鐘后取出清洗；再置于0.5 mol/L稀H2SO4溶液中以10 V/s掃描速度在－0.5 V～2.0 V的電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描10 min，即為裸金電極（NAu）。

修飾電極的自組裝過程：將預(yù)處理好的NAu電極置于0.01 mol/L L－半胱氨酸水溶液中進(jìn)行自組裝6 h后取出、用水超聲清洗5 min，為L(zhǎng)－半胱氨酸修飾電極（NAu/C）；制備好的NAu/C電極再次放入Au納米微粒溶液中自組裝6 h后取出、用水清洗，為金納米微粒修飾電極（NAu/C/Au）；將NAu/C/Au電極再次放入0.01 mol/L L－半胱氨酸水溶液中進(jìn)行自組裝6 h后取出用水清洗，為二次L－半胱氨酸修飾電極（NAu/C/Au/C）。制備的修飾電極浸泡在水中4℃保存。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的制備

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，用適量甲醇及pH 6.8的磷酸緩沖溶液溶解定容至50 mL，得200.0 μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再分別吸取若干用pH 6.8的磷酸緩沖溶液定容至 50mL，得到濃度分別為 6.0、8.0、10.0、12.0、14.0、16.0、18.0、20.0 μg/mL 的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

準(zhǔn)確稱取約0.10 g精制苦蕎茶用適量甲醇及pH 6.8的磷酸緩沖溶液超聲溶解，經(jīng)濾紙過濾定容于250 mL容量瓶中，待測(cè)。

1.5 試驗(yàn)方法

以修飾電極為工作電極，記錄－0.2 V～0.6 V范圍內(nèi)的差分脈沖伏安（Differential Pulse Voltammetry，DPV）信號(hào)，其試驗(yàn)參數(shù)為：脈沖幅度50mV、脈沖寬度0.05 s、采樣寬度0.016 s、脈沖周期0.2 s、靜置時(shí)間為2 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 修飾電極的自組裝過程

本試驗(yàn)所制備的Au納米微粒為酒紅色膠體溶液，其紫外可見吸收見圖2，吸收峰波長(zhǎng)約為530 nm，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[11]；經(jīng)高分辨TEM（圖2）表征發(fā)現(xiàn)，Au納米微粒為球型微粒，納米微粒半徑為（8±2）nm，且能觀察到清晰的晶格線條紋，說明本試驗(yàn)所制備的Au納米微粒晶體生長(zhǎng)較完整。

圖2 Au納米微粒的光學(xué)與形貌表征Fig.2 The optical characteristic and morphology of Au nanoparticles

在電極的自組裝過程中，半胱氨酸分子首先通過巰基與裸Au電極表面的相互作用，定向自組裝在裸Au電極的表面；半胱氨酸分子的氨基再通過靜電作用力與表面帶負(fù)電荷的Au納米微粒相互作用，使Au納米微粒自組裝在半胱氨酸分子表面；最終半胱氨酸分子再通過巰基自組裝于Au納米微粒表面，形成一種典型的多層結(jié)構(gòu)修飾電極，其組裝示意圖見圖3。

2.2 蘆丁在修飾電極上的電化學(xué)行為

圖4為蘆丁分子在NAu/C修飾電極上的循環(huán)伏安曲線圖。

在0.1 V～0.4 V之間出現(xiàn)一對(duì)明顯的氧化還原峰。蘆丁是一種重要的黃酮類物質(zhì)，其抗氧化活性成分主要來源于蘆丁分子結(jié)構(gòu)上苯環(huán)羥基。在pH 6.8的磷酸緩沖溶液中，掃描循環(huán)伏安過程時(shí)，蘆丁分子B環(huán)上的3’，4’-取代羥基發(fā)生兩電子兩質(zhì)子氧化還原反應(yīng)，進(jìn)一步發(fā)生電子重排[9-10，13]，此氧化還原反應(yīng)對(duì)應(yīng)于循環(huán)伏安曲線中的0.21 V還原電位峰和0.26 V氧化電位峰。

然而，蘆丁分子在NAu/C修飾電極上的循環(huán)伏安氧化還原電位峰很弱，對(duì)蘆丁的信號(hào)響應(yīng)靈敏度很低。為了提高響應(yīng)靈敏度，繼續(xù)考察了蘆丁分子在修飾電極上的差分脈沖伏安（DPV）信號(hào)響應(yīng)，結(jié)果見圖5。

圖3 修飾電極的自組裝示意圖Fig.3 Schematic illustration of the modified electrode fabrication process

圖4 蘆丁分子在NAu/C修飾電極上的循環(huán)伏安曲線圖Fig.4 Cyclic vohammograms of rutin on the NAu/C modified electrode

圖5 蘆丁分子在NAu/C和NAu/C/Au/C修飾電極上的差分脈沖伏安圖Fig.5 DPV of the NAu/C and NAu/C/Au/C modified electrode

在pH 6.8的磷酸緩沖溶液中，蘆丁分子在NAu/C修飾電極上通過差分脈沖伏安掃描出現(xiàn)了位于0.23 V處的氧化峰，并且隨著電極的進(jìn)一步修飾，在NAu/C/Au/C多層修飾電極上，0.23 V處的氧化峰信號(hào)進(jìn)一步增強(qiáng)。這是由于具有大比表面積Au納米微粒對(duì)電極的多層修飾，增加了氧化還原反應(yīng)位點(diǎn)，提高了修飾電極對(duì)蘆丁分子響應(yīng)靈敏度。

2.3 差分脈沖伏安法對(duì)蘆丁的定量測(cè)定

在pH 6.8的磷酸緩沖溶液中，對(duì)不同濃度的蘆丁采集了DPV電化學(xué)信號(hào)如圖6所示。

圖6 蘆丁差分脈沖伏安測(cè)定信號(hào)的線性關(guān)系Fig.6 The linear relationship of DPV signals on rutin

隨著蘆丁濃度的增加，DPV在0.23V處的信號(hào)峰也隨之增加，其峰電流與蘆丁的濃度呈線性變化關(guān)系，線性回歸方程為 I（μA）=0.112C（μg/mL）+0.07，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 3，儀器檢出限（3S/N）為 0.024 μg/mL，結(jié)果見表1。

表1 不同儀器方法測(cè)定蘆丁的靈敏度比較Table 1 Different methods of determination of rutin

分析方法檢出限為6.0 mg/100 g。重復(fù)10次測(cè)定蘆丁，其RSD為1.70%，方法重復(fù)性滿足定量測(cè)定要求。

2.4 實(shí)際樣品中蘆丁的測(cè)定

用差分脈沖伏安法對(duì)精制苦蕎茶樣液中的蘆丁含量進(jìn)行了測(cè)定，并且用紫外可見分光光度法[14]和高效液相色譜法[3]對(duì)樣品做了方法比對(duì)試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果如表2所示。

表2 不同方法測(cè)定苦蕎茶樣品中蘆丁的結(jié)果比較Table 2 Measurement result of rutin in Buckwheat tea with different methods

從表2中可以看出，本方法對(duì)實(shí)際樣品中的蘆丁含量測(cè)定的3次平行性結(jié)果為2.10 g/100 g（RSD值小于5.0%），與高效液相色譜法結(jié)果相比略高7.3%，而相比紫外分光光度法而言，結(jié)果低了近30%。結(jié)果表明，本法可以通過DPV測(cè)定電位的不同將其他具有類似酚羥基結(jié)構(gòu)分子的雜質(zhì)物質(zhì)對(duì)蘆丁組分的測(cè)定干擾進(jìn)行有效的降低，但是仍然有約7%的干擾，但此結(jié)果在可接受范圍之內(nèi)。

同時(shí)，試驗(yàn)了實(shí)際樣品的回收率，以1號(hào)樣品溶液20 mL 為母液（10.91 μg/mL），分別加入 0.2、0.5、0.7 mL 200.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，制得3組標(biāo)準(zhǔn)加入樣品，分別測(cè)定回收率，結(jié)果如表3所示。

表3 苦蕎茶樣品中蘆丁加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Measurement result of Recovery experiments in Buckwheat tea

回收率在99.65%～101.10%之間，表明此方法用于試劑樣品中蘆丁含量的測(cè)定具有較高的準(zhǔn)確性。

3 結(jié)論

本文以半胱氨酸與Au的靜電吸附自組裝原理，制備了一種多層結(jié)構(gòu)的半胱氨酸/納米金修飾電極。在此修飾電極上研究了蘆丁分子的電化學(xué)行為，利用蘆丁分子在修飾電極上的兩電子兩質(zhì)子氧化還原反應(yīng)所產(chǎn)生的位于0.23 V處差分脈沖伏安信號(hào)，建立了一種蘆丁定量分析方法。該方法線性回歸方程為I（μA）=0.112C（μg/mL）+0.07，相關(guān)系數(shù) R2=0.999 3，且具有較低的檢出限，重復(fù)10次測(cè)定蘆丁，其RSD為1.70%，方法重復(fù)性滿足定量測(cè)定要求，與高效液相方法和紫外分光光度法比較，該方法能夠簡(jiǎn)便、快速、高效地適應(yīng)于復(fù)雜體系中蘆丁含量的測(cè)定。

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