鄭捷,孫朋朋,胡愛軍,2,*,胡小華,任圓圓,于思雨
(1.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院,天津食品安全低碳制造協(xié)同創(chuàng)新中心,天津300457;2.天津市寬達(dá)水產(chǎn)食品有限公司,天津300304)
天麻又名赤箭、定風(fēng)草、獨搖芝,為蘭科天麻屬植物。據(jù)神農(nóng)本草經(jīng)和本草綱目記載,天麻(Gastrodia elata Bl.)有非常好的藥理作用,是一種傳統(tǒng)名貴中藥。天麻對小兒驚厥[1]、記憶力減退[2]、坐骨神經(jīng)病[3]、頭暈?zāi)垦?、癲癇[4-5]等疾病有治療作用。它在錫蘭、新幾內(nèi)亞、澳大利亞、中國、朝鮮、日本和印度的多山地區(qū)均有種植[6]。在中國,野生天麻主要分布在四川、廣東、云南等省[7]。天麻含有多糖、有機酸、類固醇、酚類化合物等功能成分[8-10]。其特有的天麻素更是有著鎮(zhèn)靜安眠[11]、抗偏頭痛[12]、抗肝硬化[13]等功效。
天麻中含有豐富的天麻多糖,具有很好的藥理作用。繆化春等[1]發(fā)現(xiàn)天麻多糖能夠明顯降低高血壓模型大鼠的收縮壓和舒張壓。Hong Qiu等[14]從天麻中分離出 α-D-(1-4)葡聚糖和 α-(1-4)葡聚糖(WGEW、AGEW),發(fā)現(xiàn)這兩種葡聚糖衍生物對登革熱病毒有抑制作用。Xia Chen等[15]從天麻塊莖中分離出一種水溶性的葡聚糖(WTMA),它能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的繁殖。天麻多糖還有清除自由基、抗衰老的作用[16]。目前對天麻及其多糖的研究主要集中在藥理方面,而其食藥兼用、保健功能方面的研究仍具有重大潛在價值,值得進(jìn)一步開發(fā)。現(xiàn)在市場上的天麻產(chǎn)品主要是含有天麻素的一些制劑,天麻多糖類產(chǎn)品未見報道。本試驗采用單因素正交試驗優(yōu)化了天麻多糖的最佳提取條件,并采用天麻多糖提取液、紅棗汁、檸檬酸、白砂糖復(fù)配出一款抗氧化活性較好的天麻多糖飲料。
天麻:陜西略陽縣中藥材技術(shù)推廣服務(wù)中心提供;紅棗、白砂糖:超市購買;檸檬酸:天津奧凱化工貿(mào)易有限公司;葡萄糖、重蒸酚、鐵氰化鉀、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸均為分析純。
TDZ5-W型離心機:長沙湘儀離心機儀器有限公司;D66-101-1電子天平:天津市天宇試驗儀器有限公司;LGJ0.5型凍干機:北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器:上海亞榮生化儀器廠;752型紫外可見分光光度計:上海菁華科技儀器有限公司;HW·SY21-K電熱恒溫水浴鍋:北京市長風(fēng)儀器儀表公司。
取天麻藥材,切片,干燥(80℃,1 h),粉碎,粉末過60目篩,備用。
稱取適量的天麻粉末,加入一定比例的蒸餾水,在恒溫狀態(tài)下持續(xù)攪拌,一段時間后,離心(4 000 r/min,20 min),取上清液,得到天麻多糖提取液。
采取苯酚-硫酸法[17-18]測定天麻多糖的含量。以葡萄糖的質(zhì)量濃度(C,mg/mL)為橫坐標(biāo),以吸光值(A)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)回歸處理得線性回歸方程:Y=16.473X+0.004 7,R2=0.999 4。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。
準(zhǔn)確稱取20 mg多糖粗品溶于水,定容于100 mL容量瓶中,用苯酚硫酸法測定吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品中的糖含量。天麻多糖得率計算公式如下:
圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose
式中:W為多糖得率,%;C為從曲線中查出的糖濃度,mg/mL;M1為多糖質(zhì)量;M2為原料質(zhì)量。
稱取原料 5.00 g,料液比分別為 15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1(mL/g),60 ℃提取 1 h,苯酚-硫酸法測糖含量。
稱取原料 5.00 g,料液比 30 ∶1(mL/g),分別在 30、40、50、60、70 ℃,提取 1 h,苯酚-硫酸法測糖含量。
稱取原料 5.00 g,料液比 30∶1(mL/g),分別在 60 ℃提取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,苯酚-硫酸法測糖含量。
稱取天麻粉末5.00 g,在單因素的基礎(chǔ)上,以溫度、液料比和提取時間進(jìn)行正交試驗,正交試驗設(shè)計方案見表1。
表1 正交試驗L9(33)的因素與水平Table 1Factors and levels of L9(33)orthogonal text
1)根據(jù)天麻多糖提取最優(yōu)工藝條件,稱取天麻粉末,加入35倍量凈化水,在60℃提取2 h,提取液離心過濾備用。2)選擇核小肉厚、物霉?fàn)€、無蟲蛀的紅棗,去核,用6倍量的凈化水在85℃提取2次,每次提取2 h,合并提取液,過濾備用。
隨機挑選20個經(jīng)培訓(xùn)的食品相關(guān)專業(yè)的學(xué)生和老師,以口感和風(fēng)味為主要指標(biāo),按照表2對天麻提取液及棗汁不同配比進(jìn)行感官評價,選擇口感、風(fēng)味較好的配比。
表2 天麻提取液和大棗提取液不同配比Table 2 Different extract ration of gastrodia elata and jujube
白砂糖和檸檬酸的比例分別為100∶1、120∶1、140∶1、160 ∶1、180 ∶1(體積比),以甜度程度為感官評價指標(biāo),選取最優(yōu)的天麻提取液及大棗提取液配比。
對不同配比的天麻提取液與棗汁、白砂糖、檸檬酸進(jìn)行L9(34)正交試驗,通過模糊評定法給出各配方的綜合評分,評分標(biāo)準(zhǔn):評定論域{氣味,香氣,酸度,甜度,苦澀},權(quán)重系數(shù) {0.15,0.20,0.20,0.25,0.2},評語論域 {<60,60~70,70~80,80~90,90~100}。正交設(shè)計表見表3。
表3 飲料配方優(yōu)化正交試驗表Table 3 Levels and factors of orthogonal test
參考周海華等的方法[19],取天麻飲品 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL加入試管中,不足1.0 mL用蒸餾水補足至1.0 mL,各管再加入0.2 mol/L,pH6.6的磷酸緩沖液2.5 mL 和質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1%鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)溶液2.5 mL,混合后在50℃保溫20 min后冷卻,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的三氯乙酸溶液2.5mL,混合后以3000r/min的速度離心10 min,取上層液體2.5 mL,加入2.5 mL蒸餾水和質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%氯化鐵2.5 mL,混勻,靜置10 min,在700 nm處測定吸光度。吸光度越高,抗氧化性越好,還原力越強。以蒸餾水代替三氯化鐵溶液作為空白調(diào)零。
參考王宗君等的方法[20],在各試管中分別加入不同濃度的天麻飲品1.0 mL、8.8 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、9 mmol/L H2O2溶液 1.0 mL,9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液各1.0 mL,最后加入H2O2啟動反應(yīng),37℃反應(yīng)0.5 h,在510 nm下測量各溶液的吸光度??紤]到天麻飲品本身的吸光度,以8.8 mmo1/L FeSO4溶液1.0 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.0 mL、不同濃度的天麻飲品1.0 mL和蒸餾水1.0 mL為天麻飲品的本底吸收。清除率計算公式:
式中:A0為空白對照液的吸光度;Ai為加入天麻飲品后的吸光度;Aj為不加H2O2天麻飲品本底的吸光度。
采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。P<0.05表示有顯著性差異,P<0.01表示有極顯著差異,所有試驗均重復(fù)3次。所有圖中出現(xiàn)的字母代表不同水平之間的顯著性,相同字母表示差異不顯著,不同字母表示差異顯著,大寫字母表示置信度0.01水平所測得,小寫字母表示置信度0.05水平下所測得。
在提取溫度為60℃,提取時間為1 h條件下,不同液料比 15 ∶1、20 ∶1、25 ∶1、30 ∶1、35 ∶1(mL/g)對多糖得率的影響如圖2所示。
圖2 料液比對天麻多糖得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on polysaccharide yield
由圖 2 可知,液料比在 15∶1(mL/g)~25∶1(mL/g)范圍內(nèi),天麻多糖得率從8.92%快速增加到11.93%,液料比在 25∶1(mL/g)~35∶1(mL/g)范圍內(nèi)時,增加的趨勢明顯變緩,天麻多糖得率在液料比30∶1(mL/g)時(11.93%)與 35∶1(mL/g)(11.96%)相比,差異不顯著,這可能是因為隨著料液濃度升高,天麻組織內(nèi)外濃度差也相應(yīng)升高,天麻多糖不易溶出的原因[21],也可能是因為液料比在25∶1(mL/g)時,天麻多糖的溶出量大于其它雜質(zhì)的溶出量,隨著料液濃度的升高,其它雜質(zhì)溶出量大于天麻多糖[22]。
在天麻液料比 30∶1(mL/g),提取時間 60 min的條件下,研究不同提取溫度 30、40、50、60、70 ℃對天麻多糖得率的影響,如圖3所示。
圖3 提取溫度對多糖得率的影響Fig.3 Effect of different temperature on polysaccharide yield
由圖3可知,30℃~50℃,隨著溫度的升高,天麻多糖得率增加顯著,溫度達(dá)到60℃時,天麻多糖得率達(dá)到最大值(12.21%),60℃~70℃,天麻多糖得率下降,這可能是因為適當(dāng)?shù)臏囟扔欣诒┞读u基的大分子物質(zhì)空間構(gòu)象的解析疊,進(jìn)而促進(jìn)氫鍵的形成或連接,多糖的親水性增加[23];但是過高的溫度會引起多糖的降解反應(yīng)[24]。
天麻液料比 30∶1(mL/g),提取溫度 60℃,研究提取不同時間(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h)對天麻多糖得率的影響,如圖4所示。
由圖4可知,隨著提取時間的延長,天麻多糖得率在不斷增加,在0.5 h~1.5 h之間,隨著時間的延長,天麻得率顯著增加,當(dāng)時間達(dá)到1.5 h后,天麻多糖得率趨于穩(wěn)定,這是可能因為在1.5 h時,提取液與細(xì)胞內(nèi)多糖濃度基本平衡,超過1.5 h,原料中有雜質(zhì)溶出,部分多糖發(fā)生降解[25]。
在單因素基礎(chǔ)上做正交試驗,結(jié)果如表4所示,正交試驗方差分析結(jié)果見表5。
圖4 提取時間天麻多糖得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on polysaccharide yield
表4 正交試驗結(jié)果Table 4 Results of orthogonal array design test
表5 正交試驗方差分析結(jié)果Table 5 Results of analysis of variance
分析可知,各因素對多糖得率的影響順序為:A>C>B;即提取溫度>提取時間>料液比。根據(jù)方差分析結(jié)果,提取溫度為顯著性影響因素。正交試驗得到的最佳提取條件為:A3B3C1即提取溫度50℃,液料比35 ∶1(mL/g),提取時間 2 h。驗證試驗:天麻多糖得率為13.46%。
以天麻提取液為主體部分,口感和風(fēng)味為主要指標(biāo),對天麻提取液及棗汁不同配比進(jìn)行感官評價,評價結(jié)果見表6。
表6 天麻提取液和紅棗提取液不同配比的評價結(jié)果Table 6 The evaluation results of different extract ration of gastrodia elata and red dates
由表6可知,當(dāng)天麻提取液70%,大棗提取液30%時,苦澀味較淡,同時能保留天麻和大棗的風(fēng)味,初步選定天麻提取液和大棗提取液的配比為7∶3(體積比)。
確定天麻提取液和大棗提取液的配比后,添加不同的糖酸比,進(jìn)行感官評價,結(jié)果見表7。
表7 糖酸比預(yù)選Table 7 Selection of sugar-acid proportions
選取白砂糖、檸檬酸、天麻提取液和大棗提取液的配比做L9(34)正交試驗,并運用模糊綜合評價法進(jìn)行品質(zhì)測評。測評結(jié)果見表8,方差分析結(jié)果見表9。
表8 感官評價結(jié)果Tablet 8 The sensory evaluation result
續(xù)表8 感官評價結(jié)果Continue tablet 8 The sensory evaluation result
表9 正交試驗方差分析表Table 9 Variance analysis of orthogonal tests
由表8和表9可知,影響天麻飲料配方的各因素的主次順序為:B>A>C,即白砂糖>天麻多糖與紅棗提取液>檸檬酸,而且白砂糖、天麻多糖和大棗提取液的用量對感官評分的影響都達(dá)到了極顯著水平,分析得出最佳水平組合為A2B1C2,即天麻提取物:棗汁為7∶3(體積比)、白砂糖6%、檸檬酸0.05%,此結(jié)果與感官評分得分最高的組合A2B1C2相符。
在一般情況下,樣品的還原力與抗氧化活性之間有顯著的相關(guān)性,吸光度越大表示還原力越強見圖5。
圖5 天麻飲料的還原能力Fig.5 Reduction capacity of gastrodia elata drinks
由圖5可知,天麻飲品具有一定的還原能力,還原力隨著天麻飲品量的增大而增加。
羥自由基的化學(xué)性質(zhì)非?;顫?,其毒性也是最大的,可與多種有機物或無機物反應(yīng)。對天麻飲料進(jìn)行不同程度的濃縮或稀釋,測定其清除羥基自由基的能力,結(jié)果見圖6。
圖6 天麻飲料對·OH的清除作用Fig.6 Scavenging effects of gastrodia elata drinks on·OH
由圖6可知,天麻飲料對·OH有很好的清除能力,并在一定的范圍內(nèi)顯現(xiàn)出劑量效應(yīng),天麻飲料原液對羥基自由基的清除率達(dá)到了80.65%,濃縮為原液的2倍后天麻飲品的抗氧化性達(dá)到96.30%,繼續(xù)濃縮,天麻飲品濃度繼續(xù)升高,清除能力趨于平衡,不再升高。
色澤:淺紅色;
滋味及氣味:天麻、紅棗味協(xié)調(diào)一致,酸甜適中,無異味;
組織形態(tài):汁液均勻一致,無雜質(zhì)。
可溶性固形物(糖度)為9°Bx左右,酸度為pH值4.6左右。
細(xì)菌總數(shù)≤100個/mL,大腸菌群數(shù)≤6個/mL,致病菌未檢出。
天麻多糖的最佳提取條件為:提取溫度80℃,液料比30∶1(mL/g),提取時間 2 h,此時天麻多糖得率為13.46%。此外,通過單因素和正交試驗確定了天麻飲料的最佳配方為天麻提取液∶紅棗汁7∶3體積比、白砂糖6%、檸檬酸0.05%,該飲料具有較好的抗氧化活性。
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