滑子菇多糖提取工藝優(yōu)化

朱振元，韓丹

（食品營養(yǎng)與安全教育部重點實驗室，天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

食用菌是指子實體碩大、可供食用的大型真菌，通稱為蘑菇，多屬擔(dān)子菌亞門[1]。食用菌營養(yǎng)價值非常豐富，含有大量的蛋白質(zhì)、核酸、碳水化合物、纖維素、維生素、礦物質(zhì)等[2]。食用菌多糖具有抗氧化[3-5]、調(diào)節(jié)免疫力[6-8]、抗腫瘤[9-10]、降血糖[11-12]、抑菌[13]等多種功效。研究報道表明，食用菌多糖現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于免疫缺陷性疾病和腫瘤等疾病的臨床輔助治療，被稱為一種重要的生物效應(yīng)調(diào)節(jié)劑[14]。

滑子菇，又名珍珠菇、滑菇、真姬菇，因其表面附有一層黏液而得名，是集食用和藥用一體的菌類植物[15]。多糖是滑子菇重要的活性成分之一，具有抗氧化、抗腫瘤和增強(qiáng)免疫力等生物活性。目前常用的提取方法有：熱水提取法、稀堿水溶液提取法和酶解法[16]，多糖是極性大分子，通?？捎盟鋈軇﹣硖崛。驗榇蟛糠只钚远嗵窃诘蜆O性的有機(jī)溶劑中的溶解度較低，所以可用乙醇或丙酮沉淀粗提液中的活性多糖。為節(jié)省有機(jī)溶劑，對多糖提取液可先濃縮后沉淀。沉淀物再水洗、過濾或用離心機(jī)除去不溶物。因為操作方便，成本較低，所以該法是提取水溶性多糖最普遍的方法[17]。食用菌多糖的提取常常受提取時間、溫度、加水量等因素的影響，從而影響多糖的提取得率[18]。本文采用熱水浸提法提取多糖，通過單因素試驗考察提取溫度、提取時間以及料液比對滑子菇多糖提取得率的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗對多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化從而確定滑子菇多糖的最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 原料

新鮮滑子菇：天津市濱海新區(qū)金元寶農(nóng)貿(mào)市場，經(jīng)烘干、粉粹后過60目篩得滑子菇干粉，用密封袋包好置于干燥器內(nèi)。

1.2 主要設(shè)備

粉碎機(jī)：天津市康達(dá)電器有限公司；ESJ205-4型電子天平：沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；TGL-16B臺式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SP-2102UV型紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；循環(huán)水真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；真空干燥箱：上海益恒科技有限公司；DF-Ⅲ集熱式磁力加熱攪拌水浴鍋：天津歐諾儀器儀表有限公司；ModeL 680酶標(biāo)儀：Thermo ELectron U.S.A；XW-80A微型旋渦混合儀：上海滬西分析儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 滑子菇粗多糖提取工藝

1.3.1.1 滑子菇粉末的制備

取定量的新鮮滑子菇在95%乙醇中在室溫下浸泡24 h，以除去其大部分脂質(zhì)。然后，將滑子菇烘干，用粉碎機(jī)粉碎，后過60目篩得滑子菇干粉，用密封袋包好置于干燥器內(nèi)備用。

1.3.1.2 熱水浸提

取8 g干燥的滑子菇粉末放入500 mL燒杯中，在按1∶4（體積比）的比例加入320 mL蒸餾水，并在90℃的攪拌水浴中浸提2 h，以4 000 r/min離心10 min。濾渣重復(fù)該過程共3次，將濾液合并。

1.3.1.3 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)

用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在60℃下冷凝濃縮至150 mL。

1.3.1.4 乙醇沉淀

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)所得濃縮液加入4倍體積的95%乙醇溶液（體積比）醇沉24 h后，以4 000 r/min離心10 min，去除上清液，留沉淀。

1.3.1.5 Sevag法脫蛋白

醇沉得到的物質(zhì)用Sevag法脫蛋白[19]，按多糖水溶液的1/5～1/4體積加入Sevag試劑（氯仿∶正丁醇為5∶1，體積比），振蕩混勻靜置直到水層和溶液層分層，去除水層和溶液層交界處的變性蛋白質(zhì)，如此反復(fù)，直至溶劑層與水的界面無乳白色沉淀為止。

1.3.1.6 脫色

脫完蛋白的多糖溶液用大孔樹脂AB-8脫色[20]，將粗多糖溶液按體積比2∶1加入經(jīng)預(yù)處理樹脂于50℃水浴鍋中水浴3 h進(jìn)行脫色，并間隔攪拌，抽濾將樹脂除去，用少量水沖洗樹脂，合并的洗液即為經(jīng)過脫色的多糖溶液，凍干得滑子菇粗多糖。

1.3.1.7 可溶性糖含量的測定

采用苯酚-硫酸法[21]測定總糖含量。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：取干燥至恒重的無水葡萄糖0.1 g，加蒸餾水溶解，然后將溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶加水定容，獲得1 g/L的溶液，振搖均勻后從中用移液管量取10 mL，加入到另一支100 mL的容量瓶中，加入蒸餾水定容至刻度線，即得0.1mg/mL的標(biāo)液。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 至 10 mL 具塞試管中，用蒸餾水補足1 mL，向各個試管中加入6%的苯酚溶液1 mL迅速加入5 mL濃硫酸搖勻，靜置10 min，沸水浴15 min，置于室溫冷卻，在490 nm處測吸光度OD值。以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品中總糖含量測定：精確稱取樣品，配成濃度為0.1 mg/mL的溶液，按上述方法測定樣品在490 nm處吸光度OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總糖含量。

1.3.1.8 多糖提取得率的計算[22]

多糖提取得率/%=總多糖含量（g）/滑子菇粉末質(zhì)量（g）×100

1.3.2 提取工藝優(yōu)化

1.3.2.1 單因素試驗

1）提取溫度對滑子菇多糖提取得率的影響

精確稱取滑子菇粉末4.000 g，按1∶40（g/mL）的料液比加入蒸餾水，分別在不同的溫度（70、75、80、85、90℃）下提取，提取時間2 h、提取次數(shù)3次，4 000 r/min離心10 min，將清液過濾，收集濾液，測定多糖的含量并計算多糖提取得率。

2）提取時間對滑子菇多糖提取得率的影響

精確稱取滑子菇粉末4.000 g，按1∶40（g/mL）的料液比加入蒸餾水，提取溫度80℃，分別提取提取時間 60、90、120、150、180 min，提取次數(shù) 3 次，4 000 r/min離心10 min，將清液過濾，收集濾液，測定多糖的含量并計算多糖提取得率。

3）料液比對滑子菇多糖提取得率的影響

精確稱取滑子菇粉末4.000 g，提取溫度80℃，提取時間 2 h、料液比分別為 1 ∶30、1 ∶35、1 ∶40、1 ∶45、1∶50（g/mL），提取次數(shù) 3次，4 000 r/min離心 10 min，將清液過濾，收集濾液，測定多糖的含量并計算多糖提取得率。

1.3.2.2 正交試驗

在單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，確定各變量的水平取值，進(jìn)行L9（33）的正交試驗，以滑子菇多糖提取得率為評價指標(biāo)，考察各因素對滑子菇多糖提取得率的影響。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels in orthogonal test

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

2.1.1 提取溫度對滑子菇多糖提取得率的影響

提取溫度對滑子菇多糖提取得率的影響見圖1。

圖1 提取溫度對滑子菇多糖提取得率的影響Fig.1 The influence of temperature on the extraction extraction rate

結(jié)果如圖1所示：當(dāng)提取溫度從70℃至80℃時，滑子菇多糖的提取率隨提取溫度的升高而上升；當(dāng)提取溫度從85℃至90℃時，滑子菇多糖提取得率明顯下降。溫度為80℃時，滑子菇多糖提取得率最大，為21.34%。多糖隨溫度變化的趨勢分析原因可能是溫度低于80℃時，隨著溫度的升高，加速了分子運動，多糖在水中的溶解度增大；當(dāng)提取溫度超過80℃后，高溫提取會破壞多糖的結(jié)構(gòu)影響其生物活性[23]，多糖分子結(jié)構(gòu)鏈出現(xiàn)一定程度的降解，從而導(dǎo)致多糖提取得率下降。由試驗結(jié)果可確定最佳的提取溫度為80℃左右。

2.1.2 提取時間對滑子菇多糖提取得率的影響

提取時間對滑子菇多糖提取得率的影響見圖2。

圖2 提取時間對滑子菇多糖提取得率的影響Fig.2 The influence of time on the extraction rate

結(jié)果如圖2所示：當(dāng)提取時間從60 min~120 min時，滑子菇多糖的提取率隨提取時間的增長而上升；當(dāng)提取時間增長至150 min~180 min時，滑子菇多糖提取得率明顯下降。提取時間為120 min時，滑子菇多糖提取得率最大，為22.07%。提取時間過短時，滑子菇多糖無法充分溶出，延長提取時間，可使滑子菇中可溶性多糖溶解，從而使多糖提取得率上升。達(dá)到一定時間后，細(xì)胞內(nèi)、外滲透壓逐步趨于平衡，多糖提取得率不再上升，加熱狀態(tài)下過長的時間可能導(dǎo)致多糖鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使多糖提取得率下降[24]。由試驗結(jié)果可確定最佳的提取時間在120 min左右。

2.1.3 料液比對滑子菇多糖提取得率的影響

料液比對滑子菇多糖提取得率的影響見圖3。

結(jié)果如圖3所示：當(dāng)料液比從1∶30（g/mL）增大到1∶40（g/mL）時，滑子菇多糖的提取率逐漸增大。料液比為1∶40（g/mL）時，滑子菇多糖提取得率最大，為22.13%。繼續(xù)增大料液比，滑子菇多糖的提取得率基本保持平穩(wěn)，幅度變化不明顯，隨著料液比的升高，多糖得率也會相應(yīng)的增高；而當(dāng)料液比過高時，多糖得率并未升高反而有所降低，可能是因為多糖能與水以任意比互溶，水量越多，后續(xù)工藝中的提取液的濃縮成本和醇沉中的乙醇用量就越多，提取液中多糖的濃度太低時，相同濃度的乙醇就越難以將多糖沉淀出來[25]。考慮后續(xù)試驗多糖提取液需濃縮，因此，確定最佳提取的料液比為1∶40（g/mL）左右。

圖3 料液比對滑子菇多糖提取得率的影響Fig.3 The influence of liquid ratio on the extraction rate

2.2 正交試驗

由單因素試驗結(jié)果，確定各變量的水平取值，進(jìn)行L9（33）的正交試驗。對試驗結(jié)果進(jìn)行方差分析，試驗結(jié)果見表2、表3。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

表3 正交試驗方差分析表Table 3 Orthogonal analysis of variance table

由表2、3可知，影響滑子菇多糖提取得率的各因素次序為B＞C＞A，3個因素中，即溫度對滑子菇多糖提取得率影響最大（P＜0.05），其次是料液比，最后為提取時間。最優(yōu)提取工藝為A2B3C2，即提取溫度85℃，提取時間 2 h，料液比 1 ∶40（g/mL）。

2.3 驗證試驗

在最佳工藝條件下進(jìn)行提取多糖的驗證試驗，結(jié)果見表4。

表4 最佳工藝驗證試驗Table 4 The verification experiment of optimum extraction parameters

試驗結(jié)果表明：在最佳工藝條件下提取多糖，提取率達(dá)24.55%。

3 結(jié)論

本文以滑子菇為研究對象，對滑子菇多糖的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過正交試驗可知，3個因素中溫度對滑子菇多糖提取得率影響最大，其次是提取時間和料液比。并確定了熱水浸提滑子菇多糖的最佳提取條件是：提取溫度85℃，提取時間2 h，料液比1∶40（g/mL）。在此工藝條件下多糖的得率為24.55%。

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