響應(yīng)面優(yōu)化超聲波輔助萃取香根油工藝及其成分研究

王賽丹，陳齊亮，孫認認，李濤，任保增

（鄭州大學(xué)化工與能源學(xué)院，河南鄭州450001）

香根草又名巖蘭草，是禾木科巖蘭屬的一種多年生草本植物[1]。原產(chǎn)自斯里蘭卡和印度，后被引種到海地、波蘭和中國等地并被廣泛種植。其根部能散發(fā)出怡人的香味，提取得到的香根油，由于味道清新、怡人而被廣泛用于香水化妝品工業(yè)[2]。目前，已有文獻報道關(guān)于香根油提取工藝的研究，例如，龔德慎等[3]用水蒸氣蒸餾法對黔產(chǎn)香根草蒸餾11 h左右，并用石油醚萃取回收殘渣，得香氣較好的0.8%的香根油，但提取率較低；Martinez等[4]對巴西產(chǎn)香根草干燥磨粉后分別經(jīng)液氮碾磨、NaOH溶液及酶處理后，再水蒸氣蒸餾16 h，得到提取率約為1.8%的香根油；朱自仁等[5]采用有機溶劑提取法連續(xù)浸提兩次，提取率達到了15.21%左右，但提取時間較長，且未經(jīng)除雜處理，所以所得精油顏色較深；本課題組廖耀華等[6]利用超臨界CO2萃取法，得到提取率為7.78%的香根油，但是，其提取過程中沒有進行除雜、提取工藝比較繁瑣、成分分析不夠完善。

超聲波輔助提取技術(shù)是指利用超聲波的能量破除植物細胞結(jié)構(gòu)，從而加速溶質(zhì)溶出擴散，提高植物有效組分從固相到液相的傳質(zhì)速率，實現(xiàn)精油的高效提取[7-8]。本研究以河南南陽地區(qū)的香根草為原料，采用超聲波輔助有機溶劑法提取法，利用單因素和響應(yīng)面試驗對提取過程進行優(yōu)化，篩選出香根油的較優(yōu)提取工藝參數(shù)，并對香根油的成分進行比較完善的分析，以期為香根草提取香根油的應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

香根草：采摘自河南南陽淅川縣；無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正己烷等試劑均為分析純。

FA2014N電子分析天平：上海菁海儀器有限公司；SHZ-D（III）真空泵：河南省予華儀器有限公司；KQ-500DE超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-52C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鞏義市英峪高科儀器廠；20×200/24層析柱：中原玻璃儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 萃取工藝流程

香根草根須→蒸餾水反復(fù)清洗→40℃電熱鼓風(fēng)干燥箱烘干32 h→粉碎過篩→超聲波萃取兩次→合并提取液→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)→少量乙醇溶解→冷凍除雜→微孔濾膜過濾→旋蒸至恒重→計算粗提油提取率→硅膠純化→流出液體濃縮→計算精油提取率

1.2.2 香根油提取率計算

香根油提取率的計算如式（1）所示：

式中：m1為香根油的質(zhì)量，g；m2為香根草的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗

選取有機溶劑、粒徑、料液比（g/mL）、超聲時間（min）和超聲溫度（℃）5個單因素進行單因素試驗?？疾旄饕蛩貙ο愀萦吞崛÷实挠绊?，試驗均平行3次取均值。

1.2.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以Box-Behnken法進行試驗設(shè)計，選取料液比、超聲時間和和超聲溫度3個影響因子（其他因子均選擇單因素最佳值進行試驗），響應(yīng)值為香根草油的提取率，設(shè)計出了三因素三水平的試驗，因素水平見表1。并運用Design-Expert.8.06b軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析，考察各因素交互作用。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平表Table 1 Variables and levels in the response surface experiment design

1.2.5 驗證試驗

驗證響應(yīng)面分析得到的最優(yōu)預(yù)測值，平行試驗3次，并計算此條件下香根草油的平均提取率，與預(yù)測值比較。

1.2.6 GC-MS聯(lián)用分析香根油成分

色譜分析條件：GsBP-35 ms毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；初始柱溫為50℃，程序升溫，以15℃/min至160℃，以1℃/min至195℃，以15℃/min至260℃，保持3min，氦氣作載氣，進樣口溫度250℃，分流比20∶1，柱流速1.0 mL/min。溶劑延遲：3.2 min。

質(zhì)譜：EI（70 eV），接口和離子源的溫度分別為250℃和220℃，掃描范圍：40 aum~500 aum。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 有機溶劑對香根油提取率的影響

在粒徑為 80目~100目，料液比 1∶15（g/mL），超聲溫度50℃，超聲時間為30 min條件下，研究不同提取劑對香根草油提取率的影響，試驗結(jié)果見表2。

由表2可知，不同有機溶劑提取效果不同，正己烷和石油醚為非極性有機溶劑，而香根油中的倍半萜類主要揮發(fā)性香氣成分一般為弱極性或中等極性的物質(zhì)，根據(jù)相似相溶原理，應(yīng)較易溶出，故純化前后提取率變化不大，色澤上為淺黃色油狀液體、清澈透明，且有濃郁的木香和厚重的清香，但提取率比較低。當(dāng)以無水乙醇為溶劑時，香根油的提取率最大為3.02%，而且所得精油色澤澄清透亮、香味濃郁持久，品質(zhì)較佳，故選取無水乙醇作為提取溶劑。

表2 不同有機溶劑提取香根草精油的效果比較Table 2 The effects comparison of different organic solvent on the extraction of vetiver essential oil

2.1.2 粒徑對香根油提取率的影響

以無水乙醇為提取溶劑，其它條件同2.1.1的條件下，研究不同粒徑對香根草油提取率的影響，結(jié)果見圖1。

圖1 粒徑對香根草油提取率的影響Fig.1 Effect of grinding granularity on yield of vetiver essential oil

由圖1可知，香根草精油的提取率隨粒徑目數(shù)的增大而呈上升趨勢，當(dāng)粒徑為80目~100目時，提取率為3.08%，繼續(xù)增大粒徑目數(shù)時，提取率基本保持不變，而且會提高研磨粉碎成本，故本試驗選擇粒徑為80目~100目。

2.1.3 料液比對香根油提取率的影響

在粒徑為80目~100目，其它條件同2.1.2時，研究不同料液比對香根草油提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 料液比對香根油提取率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on yield of vetiver essential oil

由圖2知，當(dāng)料液比低于1∶10（g/mL）時，香根油提取率隨著料液比的增大而增加，在1∶10（g/mL）時達到最大，為3.01%。這可能是因為增加溶劑用量時，溶劑中香根油的濃度會降低，從而增大了香根草精油與溶劑接觸界面處的濃度差，即增大了傳質(zhì)推動力，提高了傳質(zhì)速率[9]。隨著料液比的增加，不僅會增加溶劑用量造成不必要的浪費，而且會增加旋蒸濃縮時間，造成精油在溶劑中的揮發(fā)損失。故綜合考慮，選擇料液比為 1∶10（g/mL）。

2.1.4 超聲時間對香根油提取率的影響

在料液比 1∶10（g/mL），其它條件同 2.1.3 時，考察不同超聲時間對香根草油提取率的影響，結(jié)果如圖3。

圖3 超聲時間對香根草油提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on yield of vetiver essential oil

由圖3知，隨著超聲時間的增加，香根草油的提取率呈現(xiàn)上升趨勢，在30 min時達到最大，為3.07%。這是因為隨著超聲時間的延長，會加劇細胞破碎度，利于香根草油在有機溶劑中的溶出。而繼續(xù)延遲超聲處理時間，香根草油的提取率基本保持不變。因此，超聲處理時間選擇30 min。

2.1.5 超聲溫度對香根油提取率的影響

在超聲時間為30 min，其它條件同2.1.4時，考察不同提取溫度對香根草油提取率的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4知，香根油提取率隨著超聲溫度的增加而增加，在60℃時達到最大，為3.34%。繼續(xù)增加溫度，提取率反而下降。這可能是因為，當(dāng)溫度過高時，會導(dǎo)致香根草油中熱敏性物質(zhì)的氧化及揮發(fā)，從而造成提取率的下降。另外，升高溫度則會加大能耗和成本，故綜合考慮選擇超聲溫度為60℃。

圖4 超聲溫度對香根草油提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on yield of vetiver essential oil

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與方差分析

根據(jù)單因素的試驗結(jié)果，利用Design－Expert 8.0.6軟件中的Box－Behnken模型進行響應(yīng)面試驗設(shè)計，因素與水平見表1，試驗過程中選取料液比、超聲溫度、超聲時間為響應(yīng)變量，以硅膠純化后的香根油的提取率為響應(yīng)值。試驗方案及結(jié)果如表3所示，對表3中的數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，所得回歸方程如下式2，其中提取率（%）記作Y，回歸方程的方差分析結(jié)果見表4。

表3 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 3 Box-Behnken design with experimental results

表4是該模型的回歸方差分析表。

表4 回歸方程方差分析Table 4 Analysis of variance for the developed regression equation

從表4中可以得出，二次回歸模型的F值是34.05，P＜0.000 1，表明該二次回歸模型達到了極其顯著水平，可以用該模型來描述響應(yīng)值與各個因素之間的函數(shù)關(guān)系；失擬項P=0.110 7＞0.05，表明失擬項不顯著，該模型可以充分反映實際情況；試驗?zāi)Ｐ偷南嚓P(guān)系數(shù)R2為0.977 7，表明試驗結(jié)果與該二次回歸模型得到的預(yù)測結(jié)果差異較小，兩者有著良好的一直性，該模型的校正系數(shù)RAdj2=0.949 0，表明響應(yīng)值的變化受所選試驗因素影響較大。因此，可以用該模型對香根草油提取率的結(jié)果進行預(yù)測和分析。表4中F值的大小可以判斷自變量對因變量的影響程度大小，由此可以得出各因素對香根草油提取率的影響主次順序是A＞C＞B，即在所選定的試驗范圍內(nèi)料液比對香根草油提取率的影響最大，其次是超聲溫度，超聲時間對香根草油提取率的影響最小。由表還可以看出，一次項中超聲溫度和料液比對香根草油提取率的影響達到極顯著水平（P＜0.01），超聲時間對香根草油的提取率影響達到顯著水平（P＜0.05）；該模型的交互項中AC香根草油的提取率影響達到顯著水平（P＜0.05），表明超聲溫度和料液比之間存在著顯著的交互作用；二次項中A2和C2對香根草油提取率的影響達到極顯著水平（P＜0.01）。

2.2.2 響應(yīng)面分析

各因素交互作用對香根油提取率的影響見圖5。

響應(yīng)面是描述在其它因素恒定的情況下，來考察兩個因素的交互作用對響應(yīng)值的影響，響應(yīng)面的坡度越陡峭對響應(yīng)值的影響就越顯著，當(dāng)響應(yīng)面的等高線越接近橢圓時，表明兩因素的交互作用越顯著[10-11]。

圖5 各因素交互作用對香根油提取率的影響Fig.5 Response surface graphs showing the effect of extraction conditions on the yield of vetiver oil

圖5 A~C是反應(yīng)各因素交互作用對香根油提取率的影響。其中圖5 A是顯示在超聲溫度為60℃時，料液比和超聲時間對香根草油提取率的影響，由圖可知：香根草油的提取率隨著料液比和超聲時間的增加均有先增加后減小的趨勢，表明兩者對香根草油提取率的影響均顯著，與方差分析結(jié)果一致，其中，料液比的變化曲面比超聲時間的變化曲面更為陡峭，表明料液比對香根草油的提取率的影響更為顯著；圖5 B是在超聲時間為30 min時，料液比和超聲溫度對香根草油提取率的影響，由圖可知兩者的變化曲面都很陡峭，表明料液比和超聲溫度對香根油的提取均極其顯著；圖5 C是在料液比為30 min時，超聲溫度和時間對香根草油提取率的影響，由圖可知隨著溫度和時間的增加，香根草油的提取率先增加后減小，而且超聲溫度的變化曲面更為陡峭一些，表明超聲溫度對香根草油的提取率更為顯著一些，與方差分析結(jié)果一致。由圖5 A~C的底部等高線投影圖中可以看出，B中的等高線更接近于橢圓[12]，表明料液比和超聲溫度交互作用較為顯著，對香根草油提取率的影響結(jié)果較大。

2.2.3 最優(yōu)點驗證

利用Design-Expert 8.0.6軟件得到香根油的較優(yōu)提取工藝參數(shù)分別為料液比為1∶12.22（g/mL）、超聲提取時間35 min、提取溫度67.92℃，香根油的提取率最大達到3.35%。鑒于實際的生產(chǎn)過程，將較優(yōu)工藝參數(shù)進行一些調(diào)整，調(diào)整后的提取工藝參數(shù)分別為料液比為1∶12（g/mL）、超聲提取時間35 min、提取溫度68℃，在此工藝參數(shù)下，平行進行3次試驗，得到香根油的提取率為3.21%，和模型預(yù)測值3.35%非常接近，表明這個模型可以很有效的評價香根油的提取過程。

2.2.4 香根油的GC-MS分析

超聲波輔助有機溶劑法提取香根油的總離子流色譜圖如圖6所示。

所得質(zhì)譜圖譜經(jīng)數(shù)據(jù)庫檢索對照、人工圖譜分析及可靠性篩選后，初步確認了其中部分主要目標(biāo)組分的化學(xué)成分，分析結(jié)果如表5所示。

通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用對最優(yōu)工藝參數(shù)下制備的香根油進行化學(xué)成分分析，結(jié)果如圖6和表5所示。從超聲波輔助溶劑提取法制得香根油中共鑒定出22種相對百分含量較多的目標(biāo)組分，幾乎均為倍半萜及其氧化物，占氣相出峰總萃取物的76.96%。其中[13-15]屬于倍半萜醇類的化合物7種，總相對含量為33.95%，它們分別是：β-桉葉醇、胡木烷 -1，6-二烯-3-醇、?客素醇、α-異杜松醇、巖蘭醇、客烯醇和異朱欒倍半萜醇；屬于倍半萜酮類的化合物7種，總相對含量為22.28% ， 它 們 分 別 是 ：4αβ 甲 基 - 反 -3，4，4a，5，6，7，8，9-四氫-2H-苯并環(huán)丁烯-2-酮、菖蒲螺烯酮、長葉松香芹酮、β-巖蘭酮、香柏酮、α-巖蘭酮及倍半萜烯酮；屬于倍半萜羧酸類的化合物1種，即巖蘭酸，占總相對含量的12.87%；屬于倍半萜烯烴的化合物烴類的化合物7種，總相對含量為7.83%，它們分別是：α-紫穗槐烯、佛術(shù)烯、β-杜松烯、β-朱欒、α-愈創(chuàng)木烯、長葉烯和δ-桉葉烯。這些被鑒定出的化學(xué)組分多是各種食品添加劑、香料、中草藥等的有效組分，如β-巖蘭酮帶有濃郁的木質(zhì)異香的果香兒，可用于制備一些特殊的香料。

圖6 超聲波輔助有機溶劑法提取香根草油的總離子流色譜圖Fig.6 Ultrasonic assisted organic solvent extraction of vetiver oil total ion current chromatogram

表5 超聲波輔助有機溶劑法提取提取香根草油的GC-MS分析結(jié)果Table 5 The GC-MS analysis results of vetiver oil

3 結(jié)論

以河南南陽香根草為原料，利用超聲波輔助有機溶劑萃取法提取香根油，得到其較優(yōu)的工藝參數(shù)：料液比為1∶12（g/mL），超聲時間為35 min，超聲溫度為68℃。在此工藝參數(shù)條件下，平行試驗3次得到香根油的提取率為3.21%。響應(yīng)面結(jié)果表明，3個因素對香根油提取率影響大小順序為：料液比＞超聲溫度＞超聲時間，其中料液比和超聲溫度兩個因素的交互作用較為顯著。采用氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用分析技術(shù)對純化后得到的香根草油進行了成分分析，初步確定了其中22種主要組分化合物及各組分的相對百分含量。本研究提取工藝簡單，條件溫和，可為南陽等地的香根草綜合利用提供試驗參考。

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