不同分子量段巢脾多糖理化性質(zhì)及其抗氧化活性分析

殷玲，吉挺，戰(zhàn)旭梅，李冠華

（1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州225300；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇揚(yáng)州225009）

中國(guó)是世界第一養(yǎng)蜂大國(guó)，養(yǎng)蜂生產(chǎn)淘汰下來(lái)的巢脾數(shù)量相當(dāng)可觀。蜜蜂世代在巢脾內(nèi)棲息和繁衍，老巢脾內(nèi)殘留大量蜂蜜、花粉、蜂王漿、蜂膠、幼蟲(chóng)繭衣及其分泌物，研究表明蜜蜂巢脾含有大量的生物活性成分，如多糖、有機(jī)酸、生物堿、鞣質(zhì)以及苷類等[1-3]。蜜蜂巢脾具有抑菌殺菌，殺蟲(chóng)攻毒，祛風(fēng)鎮(zhèn)痛，降血壓，降血脂，抗氧化等多種生物學(xué)及藥理學(xué)價(jià)值[4-6]。但巢脾常被用來(lái)提取蜂蠟，而其它活性物質(zhì)卻被丟棄，造成了極大的資源浪費(fèi)。近年來(lái)，隨著人們對(duì)天然多糖研究的深入，天然多糖所具有的調(diào)節(jié)人體免疫、抗氧化、抗腫瘤、降低固醇等各種生理功能逐漸為人們所重視[7-9]，多糖已經(jīng)開(kāi)始在食品、功能性保健品、藥物等領(lǐng)域進(jìn)行開(kāi)發(fā)應(yīng)用[10-11]。蜜蜂巢脾多糖（下文簡(jiǎn)稱巢脾多糖）是蜜蜂巢脾中的主要功效成分，有著重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用空間，而目前對(duì)于蜂巢多糖的生物活性研究仍處于空白。多糖的生物學(xué)活性受到多糖的分子量，結(jié)構(gòu)，及其理化性質(zhì)如黏度、溶解度等因素的影響[12-13]。本試驗(yàn)采用超濾法對(duì)巢脾多糖進(jìn)行分級(jí)分離，獲得分子量為 4 kDa~10 kDa（HCP-1）、10 kDa~50 kDa（HCP-2）、50 kDa~100 kDa（HCP-3），大 于100 kDa（HCP-4）4個(gè)不同分子量段的巢脾多糖，并對(duì)4個(gè)分子量段巢脾多糖的理化性質(zhì)和抗氧化活性進(jìn)行分析，以期為巢脾多糖的構(gòu)效關(guān)系研究及活性成分的有效開(kāi)發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西方蜜蜂老巢脾（使用3年以上）。

氯仿、正丁醇、乙酸乙酯、咔唑、溴化鉀、乙腈、甲醇、磷酸二氫鈉（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；三氟乙酸（TFA）、1-苯基-3-甲基-5-吡啉酮（PMP）、單糖標(biāo)準(zhǔn)品均為（色譜純）：上海源葉生物科技有限公司。

抗超氧陰離子測(cè)定試劑盒、羥自由基測(cè)定試劑盒、總抗氧化測(cè)定試劑盒：南京建成生物制藥研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

MSC300 超濾杯、截留分子量為 4、10、50、100 kDa的超濾膜：上海魔速科學(xué)器材有限公司；4種超濾膜紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)T6、雙光束紫外可見(jiàn)分光光度TU-1901：北京普析通用儀器有限公司；高效液相色譜1260：德國(guó)安捷倫公司；顯微紅外光譜儀670：美國(guó)Varian公司；全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀：美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 蜜蜂巢脾多糖的提取及分級(jí)

粉碎的蜜蜂巢脾→按1∶15（g/mL）加入蒸餾水→50℃水浴鍋水浴90 min→120目紗布過(guò)濾→重復(fù)3次→濃縮至原溶液的1/4→冷卻離心→1∶4無(wú)水乙醇→4℃靜置過(guò)夜→取沉淀離心→蜜蜂巢脾粗多糖→去色素→去蛋白→蜜蜂巢脾多糖→依次使用截留分子量的為4、10、50、100 kDa的超濾膜超濾→獲得分子量為 4 kDa~10 kDa（HCP-1）、10 kDa~50 kDa（HCP-2）、50 kDa~100 kDa（HCP-3），大于 100 kDa（HCP-4）的多糖樣品。

1.3.2 巢脾多糖基本理化性質(zhì)的測(cè)定

1.3.2.1 基本組成測(cè)定

分別采用費(fèi)林試劑反應(yīng)及硫酸-苯酚法測(cè)定蜜蜂巢脾多糖中還原糖及總糖含量；利用三氯化鐵反應(yīng)及碘-碘化鉀反應(yīng)分別檢測(cè)多羥基酚類物質(zhì)及淀粉；考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白質(zhì)含量；硫酸-咔唑法檢測(cè)糖醛酸含量；pH計(jì)在室溫下測(cè)其pH值；不同極性溶液檢測(cè)其溶解性。

液相色譜法測(cè)定巢脾多糖的單糖組成。液相色譜條件[13]為色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18，250 mm×4.6 mm×5 μm；流動(dòng)相：0.1 mol/L 磷酸二氫鉀（pH6.7）緩沖液-乙腈（0~18 min體積比為82∶18，18 min~40 min體積比為83∶17）；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：20 μL。檢測(cè)器：DAD。

1.3.2.2 光譜分析

巢脾多糖樣品（0.05 mg/mL）置于紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)中190 nm~380 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描。巢脾多糖（充分干燥粉末）少許，加入少許溴化鉀晶體，在紅外燈照射下于瑪瑙研缽中輕輕研磨至極細(xì)，用壓片機(jī)壓制成透明薄片，經(jīng)顯微紅外光譜儀400 cm-1~4 000 cm-1中紅外區(qū)掃描。

1.3.3 體外抗氧化能力檢測(cè)

按照試劑盒方法測(cè)定各分子量段的巢脾多糖體外抑制羥自由基能力、抗超氧陰離子能力及總抗氧化能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同分子量段蜜蜂巢脾多糖理化性質(zhì)鑒定

2.1.1 不同分子量段蜜蜂巢脾多糖的單糖基本組成

對(duì)不同分子量巢脾多糖的蛋白質(zhì)含量、總糖含量、糖醛酸含量、還原糖含量及pH值進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，經(jīng)計(jì)算巢脾多糖中總糖含量為75 g/100 g左右，糖醛酸含量在0.2 g/100 g左右，各分子量段差異不大。蛋白質(zhì)含量隨著分子量的增大而增高，這是由于多糖的糖鏈常與肽鏈結(jié)合，形成糖肽或糖蛋白，增加了多糖的分子量。而還原糖含量則隨著分子量的增大而減小，說(shuō)明多次超濾，有效地降低了單雙糖的含量。各分子量段巢脾多糖pH值在7左右，屬于中性多糖。多糖溶于水是其發(fā)揮生物學(xué)活性的首要條件[12]，定性檢測(cè)結(jié)果顯示，各級(jí)別HCP不含淀粉及多酚類物質(zhì)，可溶于水、稀酸及稀堿，不溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶液。

本試驗(yàn)以12種常見(jiàn)單糖作標(biāo)準(zhǔn)品，采用柱前衍生化法對(duì)蜜蜂巢脾多糖中的單糖組成進(jìn)行分析。分析結(jié)果如表2所示。

表2 不同分子量段巢脾多糖的單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of comb polysaccharide with different molecular weights

由表2可知，不同級(jí)別多糖均含有甘露糖、葡萄糖醛酸，各分子量段單糖組成及含量差異較大。HCP-1中含鼠李糖、半乳糖醛酸、氨基半乳糖；HCP-2中含氨基葡萄糖、核糖；HCP-3中含核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖；HCP-4中含核糖、鼠李糖、氨基半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖。本研究中各HCP的單糖組成差異較大，有研究結(jié)果顯示多糖生物學(xué)活性受其主鏈糖單元組成影響較大[14-15]，提示各分子量段生物活性差異可能與其單糖組成有關(guān)。

2.1.2 光譜分析

紫外光譜掃描結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同分子量段巢脾多糖的紫外光譜圖Fig.1 UV absorption spectra of comb polysaccharide with different molecular weights

由圖1可知，各分子量段巢脾多糖峰型特征一致，在波長(zhǎng)380 nm~190 nm中，各分子量未出現(xiàn)明顯的特征吸收峰，吸光度值隨著波長(zhǎng)的縮短而增大，直至190 nm處出現(xiàn)最大吸收值。

紅外光譜是研究聚合物結(jié)構(gòu)和化學(xué)鍵，表征或鑒別不同化合物的常用手段之一，具有高度的特征性，是一種有效研究分子官能團(tuán)特征的手段。各分子量段巢脾多糖的紅外光譜圖如圖2所示。

圖2結(jié)果顯示各分子量段巢脾多糖皆具有典型的多糖特征吸收峰（3 387.3、2 934.4、1 413.4、772.3 cm-1），且峰型基本一致[16]。在3387.3cm-1處出現(xiàn)的寬峰為分子間和分子內(nèi)羥基（O-H）伸縮振動(dòng)特征峰[17]，2 934.4 cm-1處吸峰收為糖鏈中飽和甲基或亞甲基（C-H）伸縮振動(dòng)峰[18]，1 413.4 cm-1處吸收峰為N-H的變角振動(dòng)峰，772.3 cm-1處吸收峰為C-X伸縮振動(dòng)[19]。此外，1 630.2 cm-1處吸峰收為C=O伸縮振動(dòng)峰，表明該多糖為糖蛋白綴合物[20-21]。而在1700 cm-1～1 775 cm-1范圍內(nèi)無(wú)明顯吸收峰，表明樣品中不含羧基，即該多糖是一種中性糖[18]，這與pH值檢測(cè)結(jié)果一致。1 075.9 cm-1處吸收峰可能是吡喃糖環(huán)的特征吸收峰[19]，891.3 cm-1處有吸收說(shuō)明該多糖存在β型吡喃糖苷[17]。由于多糖的結(jié)構(gòu)具有一定的相似性，所以多糖的紅外光譜具有某些相同的特征吸收峰。通過(guò)對(duì)一些特征峰的分析，可對(duì)多糖結(jié)構(gòu)中是否含有這些殘基或大致結(jié)構(gòu)類型進(jìn)行判斷。試驗(yàn)結(jié)果顯示，各分子量段紅外光譜特征吸收峰基本一致，說(shuō)明其所含殘基大致相同。

圖2 巢脾多糖的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of comb polysaccharide with different molecular weights

2.2 不同分子量段蜜蜂巢脾多糖的抗氧化活性

2.2.1 不同分子量段巢脾多糖對(duì)羥自由基的清除作用

不同分子量段巢脾多糖對(duì)羥自由基的清除能力如圖3所示。

由圖3可知，在所選濃度范圍內(nèi)，所有分子量段的巢脾多糖清除能力隨濃度的增大而增大，在濃度為30 mg/mL時(shí)，HCP-4對(duì)羥自由基的清除能力達(dá)到最高80.80 U/mL?？傮w而言，各分子量段巢脾多糖對(duì)羥自由基都具有較強(qiáng)的清除能力，其中HCP-3及HCP-4效果最好。

圖3 不同分子量巢脾多糖對(duì)羥自由基的清除能力Fig.3 Scavenging activities of comb polysaccharide with different molecular weights against alkyl free radicals

2.2.2 不同分子量段巢脾多糖對(duì)超氧自由基的清除作用

不同分子量段巢脾多糖對(duì)超氧自由基的清除能力如圖4所示。

圖4 不同分子量巢脾多糖對(duì)超氧自由基的清除能力Fig.4 Scavenging activities of comb polysaccharide with different molecular weights against hydroxyl free radicals

由圖4可知，各分子量段巢脾多糖均具有清除超氧自由基的能力，在一定范圍內(nèi)，抑制率與多糖濃度呈量效關(guān)系。其中HCP-3及HCP-4對(duì)超氧自由基的清除能力優(yōu)于HCP-1及HCP-2，在濃度為50 mg/mL時(shí)，HCP-4對(duì)羥自由基的清除能力達(dá)到最高63.40 U/mL。

2.2.3 不同分子量段巢脾多糖對(duì)總抗氧化能力的測(cè)定

不同分子量段巢脾多糖總抗氧化能力（TOA）如圖5所示。

圖5 不同分子量巢脾多糖對(duì)總抗氧化能力的測(cè)定Fig.5 Total antioxidant capacity of comb polysaccharide with different molecular weights

由圖5可知，在一定濃度范圍內(nèi)，各級(jí)分子量多糖TOA與多糖濃度呈量效關(guān)系。當(dāng)多糖濃度達(dá)到40mg/mL時(shí)，各級(jí)分子量多糖的TOA達(dá)到最高，其中HCP-4總抗氧化能力最高為486.23 U/mL，且HCP-4總抗氧化能力明顯高于其它分子量多糖。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用4個(gè)不同截留分子量的超濾膜，對(duì)巢脾多糖進(jìn)行分級(jí)分離，獲得分子量為4 kDa~10 kDa（HCP-1）、10 kDa~50 kDa（HCP-2）、50 kDa~100 kDa（HCP-3），大于 100 kDa（HCP-4）4 個(gè)不同分子量段的巢脾多糖，并對(duì)不同分子量段巢脾多糖的理化性質(zhì)和抗氧化活性進(jìn)行分析。結(jié)果顯示巢脾多糖中總糖含量為75 g/100 g左右，糖醛酸含量在0.2 g/100 g左右，各分子量段差異不大。蛋白質(zhì)含量隨著分子量的增大而增高，還原糖含量則隨著分子量的增大而減小。各分子量段巢脾多糖pH值在7左右，屬于中性多糖。定性檢測(cè)結(jié)果顯示，各分子量段多糖不含淀粉及多酚類物質(zhì)，可溶于水、稀酸及稀堿，不溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機(jī)溶液。各分子量段巢脾多糖紫外及紅外光譜特征相似，而單糖組成及含量差異較大，HCP-3及HCP-4中單糖種類及含量相比于HCP-1及HCP-2都較為豐富。體外抗氧化活性分析結(jié)果顯示，在一定濃度范圍內(nèi)，各分子量段多糖對(duì)超氧自由基、羥自由基清除能力及總抗氧化能力與多糖濃度呈明顯的量效關(guān)系，總體而言，HCP-4的抗氧化活性最強(qiáng)，這是否與HCP-4的單糖組成豐富相關(guān)，還需要進(jìn)一步探討。本研究為巢脾多糖的構(gòu)效關(guān)系研究及活性成分的有效開(kāi)發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。

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