新疆南疆地區(qū)羊口瘡病毒的分離鑒定及其遺傳進(jìn)化分析

沙娜瓦爾·塔希，買買提艾力·斯迪克，比力克孜·阿不都熱依木，馬 偉，盛卓君，依布拉依木·阿布力米提，居馬別克·夏拉巴依，阿依吐拉·肉孜，薛 文，王 文*

（1.新疆維吾爾自治區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，新疆 烏魯木齊 830001；2.新疆喀什地區(qū)動物疾病控制與診斷中心，新疆 喀什 844000；3.新疆阿圖什市畜牧獸醫(yī)站，新疆 阿圖什 845350）

羊傳染性膿皰、羊傳染性膿皰皮炎、羊傳染性膿皰口炎也都被稱為羊口瘡，是一種全球流行的急性、接觸性傳染病，是一種非系統(tǒng)性皮膚和衰弱的疾病[1]，主要感染綿羊和山羊，但也有報道稱可以感染如駱駝、馴鹿、狗、貓和松鼠等各種反芻動物和哺乳動物[2]，另外人在與患病動物親密接觸時也有可能被感染[3]。該病毒是副痘病毒屬痘病毒科大家族中的一員，其感染特點(diǎn)是羊口、鼻、唇、乳房等處出現(xiàn)增殖，其后是形成丘疹、囊泡和塵土樣膿皰，最終變得干燥后脫落，感染羊口瘡的羊只死亡率較低，但可以引起其他細(xì)菌的繼發(fā)感染，使其死亡率大大增加，給養(yǎng)羊業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。

羊口瘡傳統(tǒng)的診斷方法包括觀察口腔黏膜、嘴唇等出現(xiàn)的臨床癥狀，血清中和實(shí)驗(yàn)、病毒分離和電子顯微鏡觀察[5]。PCR與實(shí)時定量PCR的開發(fā)為病原的快速診斷與確定提供了極大的便利。羊口瘡病毒是基因組大小為130～150kb的雙鏈DNA分子，包含約130多個基因，編碼幾十種蛋白[6]。BamH I酶切片段的B2L基因，編碼大小為42ku的病毒囊膜蛋白，可刺激淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)強(qiáng)烈的抗體反應(yīng)[7]。ORFV121編碼一種特異性病毒NF-kB信號通路抑制物，結(jié)合NF-kBp65并抑制其磷酸化和核轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制NF-kB信號通路，從而抑制細(xì)胞凋亡[8]。2016年3月，新疆喀什某地區(qū)綿羊場發(fā)生疑似羊口瘡 ，本實(shí)驗(yàn)以羊口瘡病毒B2L基因和ORFV121基因設(shè)計引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并與其它流行毒株進(jìn)行核苷酸和氨基酸同源性比對以及進(jìn)化樹的分析，以探明喀什等地區(qū)羊場中羊只感染羊口瘡病毒的情況。

1 材料和方法

1.1 樣品采集與處理

樣品采自新疆喀什某羊場疑似ORF的綿羊乳房部結(jié)痂，用高壓滅菌的剪刀將痂皮剪碎，加入青霉素和鏈霉素各1 000 U/mL并研磨，然后加維持液放入4℃冰箱過夜，以6 000 r/min，4℃，離心30min，取上清，過濾除菌后存于-20℃冰箱中備用。

1.2 主要試劑、載體及細(xì)胞

pMD18-T載體、DH5α感受態(tài)細(xì)胞、ExTaq酶、T4DNA連接酶、DNA凝膠回收純化試劑盒、小量質(zhì)粒純化試劑盒購自上海生工有限公司；細(xì)胞培養(yǎng)液及胎牛血清均為Gibco公司。

1.3 病毒分離

取3mL樣品接種于生長密度80%～90%且生長狀態(tài)良好的羊皮膚成纖維細(xì)胞 （goat skin fibroblasts，GSFs），37℃培養(yǎng)2 h，加入含1%雙抗的維持液，37℃下5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4～5 d，同時設(shè)置陰性對照，病毒接種細(xì)胞后傳至第5代，若細(xì)胞一直沒有出現(xiàn)病變，則為陰性，細(xì)胞完全病變后，加入少量的NaHCO3，調(diào)節(jié)溶液的pH值，分裝后放于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank公布的羊口瘡病毒OV-IA82株B2L基因和ORFV121基因全序列，使用Primer5.0軟件 設(shè) 計 如 下 引 物 ，B2L 上 游 為 5’ -ATGTGGCCGTTCTCCTCC -3’，B2L 下 游 為 5’ -ATTTATTGGCTTGCAGAACTCC-3’；ORFV121 上游為 5’-ATGGCTGGCTTCCTAGGC-3’，ORFV121 下游為5’-CAGAACTTCCTCCACTTTGCA-3’，引物由上海生工有限公司合成。

1.5 目的基因的擴(kuò)增、克隆及鑒定

吸取上述1.3中上清200μL，按照DNA提取試劑盒操作說明書提取病毒DNA，加入上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，并回收純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。用T4連接酶將純化的產(chǎn)物連接至pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于加有抗性的LB平板上，37℃溫箱中培養(yǎng)10～12 h挑取挑斑搖菌，將篩選到的陽性克隆，小量質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒送至上海生工有限公司測序。

1.6 ORFV-B2L基因與ORFV121基因的序列分析

對擴(kuò)增的B2L和ORFV121全基因序列利用DNAStar軟件與GenBank中其他不同地區(qū)流行毒株（如表1、表2）進(jìn)行分析，包括核苷酸、氨基酸序列同源性分析，并利用MEGA6.06軟件繪制進(jìn)化樹，對其親緣性進(jìn)行分析。

表1 25株B2L基因病毒分離株

表2 ORFV121基因病毒分離株

2 結(jié)果與分析

2.1 病羊的臨床癥狀

2016年3月，新疆喀什等地區(qū)出現(xiàn)了綿羊疑似感染ORFV病羊表現(xiàn)為口唇、舌、鼻、乳房等部位形成丘疹、水皰、膿皰和結(jié)成疣狀痂。根據(jù)以上初步診斷為ORFV感染。

2.2 病毒的分離

將分離得到的疑似羊口瘡病毒病料在GSFs細(xì)胞上盲傳，盲傳至第5代時出現(xiàn)了明顯的病變，表現(xiàn)為細(xì)胞培養(yǎng)24 h后細(xì)胞逐漸變圓，開始腫脹，72 h后細(xì)胞病變達(dá)到90%，拉網(wǎng)、游離繼而脫落（圖1.A），而對照組細(xì)胞生長緊密（圖1.B）

圖1 盲傳至第5代的病毒在接種GSFs細(xì)胞72 h后出現(xiàn)的病變（10×100）A.接毒72h后出現(xiàn)病變的GSFs細(xì)胞；B.陰性對照組GSFs細(xì)胞

2.3 B2L基因和ORFV121基因的PCR擴(kuò)增

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在1097bp和889bp處均出現(xiàn)明亮條帶，與預(yù)期相符（如圖2、圖3）。

圖2 B2L基因擴(kuò)增 M.DL2000DNA Marker； 1.B2L基因目的條帶

圖3 ORFV121基因擴(kuò)增M.DL2000 DNA Marker；1.ORFV121基因目的條帶

2.4 B2L基因與ORFV121基因序列分析

將測序結(jié)果與其他不同毒株B2L和ORFV121基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)B2L基因和其他25株核苷酸和氨基酸同源性分析分別為94.7%~98.5%、95%~97%，其中與中國疫苗株的核苷酸同源性為97%，且核苷酸序列較為保守。ORFV121基因的核苷酸和氨基酸同源性分別為93.6%~99.1%、87.7%~98.0%，該核苷酸序列第74bp-78b區(qū)段發(fā)生片段缺失，與國外ORFV毒株B029（KF837136.1）、OA-IA82（AY386263.1）和我國毒株NA1/11（KF234407.1）相似（如圖4）。采用MEGA6.06軟件繪制進(jìn)化樹，結(jié)果顯示該分離株B2L基因與其它毒株均不在同一分支，但和印度的兩只分離株（登錄號分別為KU672688.1、KT935590.1）的親緣關(guān)系較近（如圖5），基于ORFV121基因進(jìn)化樹顯示，本研究獲得的ORFV分離株與我國NA1/11分離株（KF234407.1）親緣關(guān)系最近（如圖6）。

圖4 ORFV121基因與其它毒株部分核苷酸比對序列圖

圖5 基于B2L基因的遺傳進(jìn)化樹分析

圖6 基于ORFV121基因的遺傳進(jìn)化樹分析

3 討 論

根據(jù)新疆喀什等地區(qū)羊場羊只發(fā)病的臨床癥狀，初步判斷為羊口瘡病毒感染，為確定病原，本研究通過分離疑似病毒接種于GSFs細(xì)胞，以細(xì)胞培養(yǎng)物產(chǎn)物為模板，擴(kuò)增該分離株的B2L基因和ORFV121基因并進(jìn)行序列分析，該病毒疑似物在GSFs細(xì)胞中盲傳至第五代時出現(xiàn)明顯的病變，PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示均出現(xiàn)了預(yù)期大小的片段，這表明成功分離到一株ORFV，命名為ORFV/XJ-NJ/2017/China，證明了該分離株是羊口瘡病毒感染所致。

羊口瘡是一種重要的人畜共患病，且傳播速度快，波及的范圍廣，對養(yǎng)羊業(yè)造成嚴(yán)重危害。近年來該病在全世界范圍內(nèi)發(fā)生頻率較高，且被感染的宿主范圍不斷擴(kuò)大[9]，并且近年來有報道稱一些羊場采用弱毒疫苗免疫羊只后不能起到有效的保護(hù)作用，推測ORFV流行株在進(jìn)化過程中可能發(fā)生了不同程度的遺傳變異。B2L基因位于羊口瘡病毒第11個完整開放閱讀框，序列高度保守，編碼著病毒囊膜蛋白，承擔(dān)著主要的免疫壓力，是ORFV的保護(hù)性抗原基因。Oem等[10]在對韓國ORFV分離株進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析時發(fā)現(xiàn)，該分離株B2L基因存在著一定的變異，并指出ORFV感染的宿主有從奶山羊向黑山羊過渡的趨勢，因此推測B2L基因的變異可能會導(dǎo)致毒株的變異。ORFV121基因編碼抑制細(xì)胞凋亡的蛋白，劉芳等[8]研究發(fā)現(xiàn)ORFV121基因在發(fā)生突變或者丟失時，抑制細(xì)胞凋亡的作用會減弱或者消失，宿主被羊口瘡病毒感染后，機(jī)體可迅速識別或消滅病毒，而野毒感染的羊群則會長期帶毒。B2L基因核苷酸序列分析表明，該ORFV分離株與其它毒株核苷酸和氨基酸同源性較高，分別為94.7%～98.5%、95%～97%，序列較為保守，與中國疫苗株的核苷酸同源性為97%，遺傳進(jìn)化樹結(jié)果可得，該分離株與印度兩支分離株 （登錄號KU672688.1、KT935590.1）親緣關(guān)系最近，基于ORFV121基因進(jìn)化樹顯示，本研究獲得的ORFV分離株與我國NA1/11分離株（KF234407.1）親緣關(guān)系最近，與其它分離株核苷酸和氨基酸同源性分別為93.6%～99.1%、87.7%～98.0%。提示著該毒株在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了部分氨基酸的變異。

近年來，新疆的養(yǎng)羊業(yè)發(fā)展迅速，規(guī)模化的羊場數(shù)量快速增加，疫苗接種是預(yù)防和控制該病發(fā)生的有效手段，但很多羊場因?yàn)镺RFV弱毒苗免疫后的不確定性及一定的安全問題，不選擇疫苗免疫。由核苷酸序列比較可知該毒株B2L基因較為保守，和疫苗株同源性較高，可推測該病毒株變異不大，疫苗免疫依舊可以用于該地區(qū)的疫情預(yù)防與控制。羊口瘡是新疆養(yǎng)羊業(yè)的主要疫病之一，疫苗免疫的同時也要從飼養(yǎng)、營養(yǎng)、消毒等方面進(jìn)行綜合防控。

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