適制烏龍茶品種新梢主要品質(zhì)化學輪廓的模式識別研究

陳 林，宋振碩，陳 鍵，王麗麗，余文權(quán)，尤志明*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所，福建 福安 355015；2.國家茶樹改良中心福建分中心，福建 福安 355015)

福建是烏龍茶的主產(chǎn)區(qū)和發(fā)祥地，擁有豐富多樣的烏龍茶種質(zhì)資源。適制烏龍茶鮮葉一般采摘自頂芽形成駐芽的中、小開面二至四葉茶樹嫩梢，這與其他茶類對鮮葉原料的嫩度要求存在較大差異。普遍認為，葉質(zhì)硬而脆、角質(zhì)層較厚、葉下表皮具有分泌功能的腺鱗結(jié)構(gòu)是適制烏龍茶鮮葉的必要物理指標[1]。楊偉麗等[2]根據(jù)17個茶樹品種鮮葉的烏龍茶適制性研究認為，葉片寬、梗粗、節(jié)間短、葉長/葉寬值小、梗粗/節(jié)長值大、葉片厚、上表皮厚和柵欄組織厚等8項性狀是烏龍茶品種鮮葉的重要形態(tài)結(jié)構(gòu)特征。此外，嚴學成[3]通過8個烏龍茶品種不同葉位葉片的解剖結(jié)構(gòu)和葉綠體色素含量測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著葉位的增加，葉綠體結(jié)構(gòu)逐漸分化，葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和類胡蘿卜素含量增加，并伴隨著脂肪性質(zhì)球增多，葉綠體中的淀粉顆粒擴大，且較老葉片葉肉細胞常見油滴或造油體。雖然已有報道初步描述了適制烏龍茶鮮葉的基本理化特性[4]，但鮮見樣品制備方法的具體說明或無一致的新梢采制標準[5, 6]。據(jù)筆者前期研究表明，鐵觀音、黃棪等4個烏龍茶品種茶鮮葉在春季新梢伸育過程中主要品質(zhì)成分相較其在清香型烏龍茶加工過程發(fā)生了更為明顯的起伏變化[7]。烏龍茶品種常為多茶類兼制用種，為揭示其鮮葉主要品質(zhì)化學輪廓的基本特征，本試驗以國家或省級審(認、鑒)定綠茶品種春季鮮葉為對照，對福建代表性烏龍茶品種春季和秋季鮮葉的主要品質(zhì)生化成分進行了檢測分析及可視化模式識別，以期為烏龍茶品種生化鑒定和種質(zhì)資源的創(chuàng)新利用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試鮮葉均采自集中分行種植于福建省茶樹資源圃4～5齡試驗茶園(北緯27°13′57″，東經(jīng)119°34′31″)的10個綠茶品種春季第一輪新梢與10個烏龍茶品種春季和秋季第一輪新梢。春茶和秋茶樣品采摘時間分別為3月26日～5月3日，10月9日～10月24日。綠茶品種包括：(1)國家認(鑒)定綠茶品種：福鼎大白茶、福鼎大毫茶、福安大白茶、福云6號、福云7號、福云10號和霞浦春波綠；(2)福建省審定綠茶品種：九龍大白茶、霞浦元宵茶和早春毫。烏龍茶品種按產(chǎn)地來源可劃分為：(1)閩北品種：肉桂、水仙、大紅袍和矮腳烏龍；(2)閩南品種：鐵觀音、黃棪、梅占和白芽奇蘭；(3)閩東新品種：茗科1號(金觀音)和黃觀音。采摘標準：一芽二、三葉(簡稱幼嫩鮮葉)和中、小開面二至四葉(簡稱成熟鮮葉)。標準品：沒食子酸單水合物(純度>99%)和咖啡因(USP/BP級)，Aladdin試劑；L-谷氨酸(BR級，純度≥98.5%)和葡萄糖(分析純)，滬試試劑。甲酸溶液(49%～51%，HPLC級，F(xiàn)luka 試劑)、甲醇和乙腈(HPLC級，Sigma-Aldrich試劑)。除特殊要求外，其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶樣制備 將電熱式碧螺春烘干機升溫至180℃，開啟風機，投入鮮葉150～180 g，進行熱風殺青[先悶后透，10 min(≥100℃)]，再將茶樣轉(zhuǎn)入電熱烘箱，80℃烘至足干，冷卻后真空密封包裝，于-20℃冷凍保存?zhèn)溆肹8]。各供試茶樣的具體編碼及其鮮葉來源見表1。

表1 茶樣編碼及其鮮葉來源

(續(xù)表1)

表1 茶樣編碼及其鮮葉來源

1.2.2 茶樣檢測 水浸出物(WEs)含量：參照GB/T8305-2013，采用重量法測定；茶多酚(TPs)含量：參照GB/T 8313-2008，采用福林酚(Folin-Ciocalteu)比色法測定；游離氨基酸(FAAs)總量：參照GB/T 8314-2013，采用茚三酮比色法測定；可溶性糖(WSSs)總量：采用蒽酮比色法測定[9]?？Х纫?CAF)含量：采用TSKgel ODS-100Z 色譜柱(150 mm×4.6 mm I. D.，粒徑：5 μm，日本Tosoh公司)，以0.2%甲酸水溶液(v/v)和甲醇為流動相進行高效液相色譜檢測分析[10]。

1.2.3 統(tǒng)計分析 將WEs、TPs和FAAs等主要品質(zhì)生化成分檢測結(jié)果及其組合變量[酚氨比(RPA)[11]、苦澀成分(TPs+CAF)/鮮甜成分(FAAs+WSSs)比值(RNP)]導入到ChemPattern 2017[科邁恩(北京)科技有限公司]進行基于主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)的可視化模式識別，并采用SIMCA 15.0.2(德國Sartorius Stedim Biotech集團)對建立的PLS-DA分類模型進行質(zhì)量評價[包括潛變量個數(shù)的確定、交叉驗證預測殘差的方差分析(CV-ANOVA)和置換檢驗(Permutation test)等]。另應用IBM SPSS Statistics 24.0(美國IBM公司)，通過雙因素方差分析(Tow-way ANOVA)考察了各茶樹品種的適制特性、采摘季節(jié)和芽葉嫩度對供試茶樣主要品質(zhì)生化成分的內(nèi)在影響及不同類群供試茶樣主要品質(zhì)生化成分的含量差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 烏龍茶和綠茶品種春季鮮葉主要品質(zhì)化學輪廓的模式識別

基于春季供試茶樣WEs、TPs和FAAs等主要品質(zhì)生化成分檢測結(jié)果及其組合變量(RPA和RNP)的主成分分析(PCA)結(jié)果表明，綠茶品種春季成熟鮮葉樣主要品質(zhì)成分的化學模式在前2個主成分(PC1×PC2)二維視圖的平面分布較為離散，但不同來源春季鮮葉樣并無明顯的類群區(qū)分(圖1-A)。進一步采用基于偏最小二乘判別分析(PLS-DA)的模式識別結(jié)果顯示，全部春季供試茶樣主要品質(zhì)成分的化學模式可用2個潛變量來刻畫，其方差貢獻度分別為38.55%(LV1)和25.28%(LV2)，累積方差貢獻度為63.83%。40份春季供試茶樣主要品質(zhì)成分的化學模式在潛變量(LV1×LV2)二維視圖的平面分布中可按不同茶樹品種(適制特性×芽葉嫩度)劃分成相互獨立的4個類群，即綠茶品種春季幼嫩鮮葉樣(YGS)、綠茶品種春季成熟鮮葉樣(MGS)、烏龍茶品種春季幼嫩鮮葉樣(YOS)和烏龍茶品種春季成熟鮮葉樣(MOS)(圖1-B)，其中R2X、R2Y和Q2Y[12]分別為0.638、0.493、0.455。另由主成分載荷可以看出，CAF、RNP和FAAs，F(xiàn)AAs、WEs和TPs，WSSs和RPA分別是YOS、YGS、MGS有別于其他茶樣類群的主要相關(guān)因子。交叉驗證預測殘差的方差分析和置換檢驗(n=200)對模型的有效性檢驗結(jié)果顯示，該模型具良好的預測能力(p=3.60×10-9)，且不存在過擬合現(xiàn)象。

圖1 基于綠茶品種和烏龍茶品種春季鮮葉主要品質(zhì)成分的模式識別Fig.1 Pattern recognition based on functional constituents in spring shoots of green tea and oolong tea cultivars注：變量采用UV-scaling標度化預處理。A：主成分分析；B：偏最小二乘判別分析。下同。

不同茶樹品種基于(適制特性×芽葉嫩度)的雙因素方差分析結(jié)果表明，春季綠茶和烏龍茶品種鮮葉樣的TPs、CAF和WSSs含量有極顯著差異；幼嫩鮮葉和成熟鮮葉的CAF含量存在顯著性差異，而WEs、TPs、FAAs和WSSs含量則達到極顯著差異。此外，不同茶樹品種(適制特性×芽葉嫩度)對CAF含量有明顯的互作效應。多重比較分析結(jié)果顯示，YGS有較高的WEs和TPs含量；MGS有較高的WSSs和較低的CAF、FAAs含量；YOS有較高的FAAs和較低的WSSs含量；MOS有較高的CAF和較低的WEs、TPs含量(見表2)。

2.2 烏龍茶品種春季和秋季鮮葉主要品質(zhì)化學輪廓的模式識別

由基于烏龍茶品種供試茶樣WEs、TPs和FAAs等主要品質(zhì)生化成分檢測結(jié)果及其組合變量(RPA和RNP)的主成分分析(PCA)結(jié)果可以看出，40份烏龍茶品種供試茶樣主要品質(zhì)成分的化學模式在前2個主成分(PC1×PC2)二維視圖的平面分布中可按(采摘季節(jié)×芽葉嫩度)劃分成相互獨立的4 個類群，即烏龍茶品種春季幼嫩鮮葉樣(YOS)、烏龍茶品種春季成熟鮮葉樣(MOS)、烏龍茶品種秋季幼嫩鮮葉樣(YOA)和烏龍茶品種秋季成熟鮮葉樣(MOA)(圖2-A)?；谄钚《伺袆e分析(PLS-DA)的模式識別結(jié)果顯示，全部烏龍茶品種供試茶樣主要品質(zhì)成分的化學模式可用3 個潛變量來刻畫，其方差貢獻度分別為34.32%(LV1)、37.46%(LV2)和14.49%(LV3)，累積方差貢獻度為86.27%；通過潛變量(LV1×LV2)二維視圖可進一步放大上述4個茶樣類群的組間差異(圖2-B)，其中R2X、R2Y和Q2Y分別為0.863、0.559、0.483。另由潛變量載荷可以看出，F(xiàn)AAs和RNP，TPs和WEs，RPA和WSSs分別是YOS、YOA和MOA區(qū)別于其他茶樣類群的主要相關(guān)因子。交叉驗證預測殘差的方差分析和置換檢驗(n=200)對模型的有效性檢驗結(jié)果顯示，該模型具良好的預測能力(p= 1.07×10-6)，且不存在過擬合現(xiàn)象。

圖2 基于烏龍茶品種鮮葉主要品質(zhì)成分的模式識別Fig.2 Pattern recognition based on functional constituents in shoots harvested from oolong tea cultivars

不同烏龍茶品種基于(采摘季節(jié)×芽葉嫩度)的雙因素方差分析結(jié)果表明，春季和秋季鮮葉樣的TPs含量有顯著性差異，且WEs、FAAs和WSSs含量達到極顯著差異；幼嫩鮮葉和成熟鮮葉的WEs、TPs、FAAs和WSSs含量均有極顯著差異。此外，不同烏龍茶品種的(采摘季節(jié)×芽葉嫩度)對WEs、FAAs含量存在明顯的互作效應。多重比較分析結(jié)果顯示，YOA有較高的WEs、TPs和CAF含量；MOA有較高的WSSs和較低的CAF含量(見表2)。

表2 不同類群茶樣的主要品質(zhì)生化成分含量

注：同一列數(shù)值右上方標注有不同小寫字母表示差異達顯著性水平(p<0.05)，標注有不同大寫字母表示差異達極顯著水平(p<0.01)。

3 討論

在茶樹新品種區(qū)域試驗過程中，主要通過選擇合適的對照種(如綠茶為福鼎大白茶，烏龍茶為黃棪，紅茶為英紅1號)，對新選品種的形態(tài)特征、生物學特性、產(chǎn)量、抗性以及主要化學成分含量、茶類適制性和茶葉品質(zhì)特點等進行長達6～7年的系統(tǒng)觀測[13]。然而這種基于單一或少數(shù)對照種以評價其他新選品種(系)的茶樹品種選育和鑒定模式，較難體現(xiàn)候選品種與已審(認、鑒)定品種群體性狀的總體差異和應用推廣價值。因此，選用多個已審(認、鑒)定品種為對照，通過統(tǒng)計模式識別將能更為客觀地反映候選品種(系)個體或群體的性狀特征和分類歸屬。茶葉生化組成復雜多樣，多變量和單變量統(tǒng)計模式識別系群體樣本多指標分析和關(guān)鍵指標篩選的常用化學計量方法。單變量統(tǒng)計分析側(cè)重于衡量單一指標變化，多變量統(tǒng)計分析則能同時考察所有指標，并可尋找出各指標間的相互聯(lián)系[14]。烏龍茶和綠茶屬福建主產(chǎn)茶類，通過茶鮮葉(一芽二、三葉)兒茶素類和嘌呤堿HPLC指紋圖譜檢測，并基于主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)可對綠茶和烏龍茶品種進行良好的類群區(qū)分[8]。從本試驗可以看出，在生長樹齡、自然環(huán)境和栽培管理條件相較一致的條件下，基于偏最小二乘判別分析(PLS-DA)能有效刻畫出不同嫩度綠茶和烏龍茶品種春季鮮葉主要品質(zhì)化學輪廓的群體差異，另基于主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)均可直觀呈現(xiàn)采摘季節(jié)和芽葉嫩度對烏龍茶品種鮮葉主要品質(zhì)化學輪廓的影響。由此可見，雖然烏龍茶品種鮮葉(一芽二、三葉)亦可加工成其他茶類產(chǎn)品，但其鮮葉主要品質(zhì)化學輪廓仍有其獨立的群體特征。選用多個綠茶品種為對照，通過不同嫩度春季茶鮮葉主要品質(zhì)生化成分的檢測分析，并結(jié)合基于線性變換的多維統(tǒng)計模式識別將可作為一種烏龍茶品種篩選和鑒定的有效方法。