三峽庫(kù)區(qū)常見(jiàn)豆科植物對(duì)鉻污染生理響應(yīng)的FTIR研究

李 新，劉正學(xué)，余順慧*，張 靜，包欣月，何昕航

(1.重慶三峽學(xué)院 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，重慶 萬(wàn)州 404100；2.重慶市萬(wàn)州第二高級(jí)中學(xué)，重慶 萬(wàn)州 404100；3.重慶信息技術(shù)職業(yè)學(xué)院，重慶 萬(wàn)州 404100)

【研究意義】隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境中的重金屬總量顯著增加，大量重金屬被廣泛的分布于大氣、水體、土壤、生物體中。重金屬污染主要包括：鉛(Pb)污染、鎘(Cd)污染、汞(Hg)污染、鉻(Cr)污染、銅(Cu)污染、鎳(Ni)污染、鋅(Zn)污染等。其中，鉻(Cr)作為“七大元素”之一，具有明顯的“三致”作用，土壤Cr污染己對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類(lèi)健康造成了嚴(yán)重的威脅[1]，是典型的環(huán)境污染物之一。三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)屏障區(qū)作為重點(diǎn)的生態(tài)環(huán)境治理區(qū)域，其區(qū)域內(nèi)的土壤重金屬污染改如何處理，以及如何有效篩選耐重金屬農(nóng)作物，在保障移民經(jīng)濟(jì)收入的同時(shí)，改善庫(kù)區(qū)土壤生態(tài)安全，在當(dāng)前具有十分重要的實(shí)踐意義。【前人研究進(jìn)展】植物修復(fù)技術(shù)作為當(dāng)前理土壤重金屬污染的重要技術(shù)之一，其修復(fù)核心是篩選耐重金屬富集的植物。各國(guó)環(huán)境科學(xué)工作者在篩選耐鉻植物方面做了大量工作。如發(fā)現(xiàn)了超積累植物李氏禾，以及具有修復(fù)潛力的植物如：蘆竹和農(nóng)作物芥菜型油菜四川黃籽等。李氏禾適用于修復(fù)被鉻污染的人工濕地，但其余幾種植物用于修復(fù)鉻污染的土壤，還沒(méi)有大規(guī)模的應(yīng)用。豆科植物黃豆(Glycinemax)及綠豆(Phaseolusradiatus)是我國(guó)三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)屏障區(qū)常見(jiàn)的一年生農(nóng)作物，具有生長(zhǎng)快，生物量大，固氮，不用施肥、適應(yīng)性和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)。用豆科植物作為對(duì)重金屬污染地修復(fù)的先鋒植物的可能性研究在國(guó)際上成為一個(gè)新的熱點(diǎn)。傅立葉紅外光譜(FTIR)是一種基于化合物中官能團(tuán)和極性鍵振動(dòng)的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，其特點(diǎn)是靈敏度高、快速及操作簡(jiǎn)單等[2]。FTIR能夠提供生物大分子特定的振動(dòng)吸收普帶，從而敏銳地測(cè)定這些分子的相對(duì)含量以及構(gòu)象等變化的信息，現(xiàn)在已經(jīng)被應(yīng)用于許多研究領(lǐng)域。目前,報(bào)道較多的是用于植物對(duì)重金屬的耐性機(jī)制研究[3-4]。而對(duì)修復(fù)土壤重金屬污染的豆科植物各組分進(jìn)行FTIR的研究鮮有報(bào)道?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)選對(duì)土壤污染較大的常見(jiàn)重金屬鉻為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以其不同濃度處理綠豆幼苗，利用FTIR研究植物各組分官能團(tuán)的變化, 探討其對(duì)重金屬的吸附性和耐受性,同時(shí)研究及植物對(duì)鉻富集效應(yīng)。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以期為利用綠色生態(tài)修復(fù)技術(shù)控制土壤污染、改善土壤環(huán)境提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

采用水培方法，選取生長(zhǎng)一致的綠豆幼苗，其根系先后用自來(lái)水、去離子水洗凈，移栽到200 mL廣口瓶中進(jìn)行水培(用自來(lái)水)，每個(gè)廣口瓶?jī)?nèi)移栽30株綠豆幼苗。Cr6+以K2Cr2O7形式加入，Cr6+濃度分別為0、5、10、50、100 mg/L，每個(gè)濃度處理3個(gè)平行。所有處理溶液的pH值保持在(6.5±0.1)，并保持 24 h 連續(xù)通氣。處理 11 d 后，收獲綠豆幼苗植株。用自來(lái)水和去離子水洗凈，分離根、莖、葉，在105 ℃烘箱殺青 30 min，然后于80 ℃烘箱中干燥 48 h。剪碎，置于磨砂研缽內(nèi)研磨至粗細(xì)均勻的粉末，過(guò)200目篩[5]。

1.2 傅里葉紅外光譜(FTIR)分析

傅立葉紅外光譜儀(日本島津制造IRPrestige-21，光譜范圍4000～400 cm-1，分辨率16 cm-1，測(cè)定黃豆根、莖、葉組織樣品的光譜信息。

1.3 微波消解樣品測(cè)定其重金屬Cr6+含量

精確稱(chēng)取各樣品0.2000 g，加入酸液(濃HNO3∶濃H2SO4=4∶1)，同時(shí)做空白組；將以上溶液在MARS240微波消解系統(tǒng)消解后，冷卻、過(guò)濾。濾液在25 mL容量瓶中定容，移入塑料瓶中保存，用AA-6300原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定樣品中Cr6+含量(mg/kg干重)[5]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理，根據(jù)綠豆幼苗吸收峰的吸光度值的特點(diǎn)篩選出多個(gè)比較典型的吸收峰,并記錄不同波數(shù)的吸光度。原始數(shù)據(jù)采用ORIGIN 7.0 軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度鉻處理對(duì)綠豆幼苗生長(zhǎng)的影響

圖1 不同濃度鉻處理對(duì)綠豆生物量的影響Fig.1 Effects of different concentrations of Cr on the biomass of Phaseolus radiatus L.

如圖1所示，隨著Cr6+處理濃度的增加，綠豆根、莖、葉的生物量呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)。但不同鉻處理?xiàng)l件下綠豆都能生長(zhǎng)正常(能完成植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程)，不同鉻處理?xiàng)l件下生物量差異不顯著(P>0.05)。這表明綠豆對(duì)鉻有較強(qiáng)的耐性。鉻不是是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量營(yíng)養(yǎng)元素[6]，但低濃度的Cr6+會(huì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，但高濃度的Cr6+會(huì)抑制植物的生長(zhǎng)。然而，受植物遺傳學(xué)特性、生態(tài)學(xué)特性等因素所決定，不同植物對(duì)Cr6+污染的忍耐性是不同的。因此，對(duì)植物生長(zhǎng)有利的鉻濃度范圍要根據(jù)植物的種類(lèi)而定[7]。有研究表明隨著Cr6+處理的增加時(shí)抑制紫花苜蓿、高羊茅、白花三葉草的生長(zhǎng)[8]。研究表明，在Cr6+處理濃度<10 mg/L時(shí)促進(jìn)綠豆生長(zhǎng)，而Cr6+處理濃度>10 mg/L時(shí)抑制綠豆的生長(zhǎng)，高濃度鉻(100 mg/L)處。從形態(tài)上觀察，高濃度Cr6+脅迫后植株表現(xiàn)矮小，上胚軸彎曲，根部出現(xiàn)發(fā)黑，葉稍微卷曲的特征[9]，這可能是因?yàn)樵诟邼舛茹t處理?xiàng)l件下綠豆幼苗對(duì)鉻污染的一種生理響應(yīng)。

2.2 不同濃度鉻處理對(duì)綠豆幼苗的FTIR分析

a: Control; b: 5 mg/L; c: 10 mg/L;d:50 mg/L; e: 100 mg/L圖2 不同濃度Cr6+處理下綠豆幼苗根的傅里葉紅外光譜圖(400～4000 cm-1)Fig.2 Absorption FTIR spectra in the roots of P. radiatus L. under different concentrations of Cr6+

圖3 不同濃度Cr6+處理下綠豆幼苗莖的傅里葉紅外光譜圖(400～4000 cm-1)Fig.3 Absorption FTIR spectra in the stems of P. radiatus L. under different concentrations of Cr6+

應(yīng)用FTIR 對(duì)綠豆幼苗的根、莖、葉測(cè)定分別得到紅外光譜圖(圖2～4)。3217～3278 cm-1處的譜帶是典型的締合OH伸縮振動(dòng)吸收峰以及蛋白質(zhì)、氨基酸、核酸、維生素等物質(zhì)中N-H鍵的伸縮振動(dòng)吸收的疊加，主要反映植物所含蛋白質(zhì)、核酸等在光譜中的貢獻(xiàn)[10-12]，2924～2934 cm-1附近是甲基伸縮振動(dòng)[13]，主要來(lái)自于各種膜及細(xì)胞壁及維生素等成分。1610～1655 cm-1附近是N-H酰胺的彎曲振動(dòng)峰，其中1645 cm-1左右的峰值為酰胺化合物的吸收Ⅰ帶(包括 %-CONH-中的C= O 伸縮振動(dòng))[12, 14]，是蛋白質(zhì)的特征紅外光譜。1411～1453 cm-1處是羧酸根離子(COO-)的特征吸收峰, 是由于羧酸中C-O伸縮振動(dòng)引起的，主要來(lái)自于果膠質(zhì)等成分[12]。1355～1366 cm-1處是含油脂化合物(各種膜和細(xì)胞壁)的組織中甲基C-H的變形振動(dòng)峰[15-16]。1054～1064 cm-1附近是醇、酯基、醚基或酚類(lèi)等化合物C-O鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰[17]。

圖4 不同濃度Cr6+處理下綠豆幼苗葉的傅里葉紅外光譜圖(400～4000 cm-1)Fig.4 Absorption FTIR spectra in the leaves of P. radiatus L. under different concentrations of Cr6+

表1 不同濃度Cr6+處理下綠豆幼苗的特征峰變化

對(duì)不同濃度重金屬處理前后的綠豆幼苗的根、莖、葉進(jìn)行了紅外光譜分析，結(jié)果顯示各組分在重金屬處理前后的峰形基本保持不變，只有某些參與重金屬吸附的官能團(tuán)的吸收峰發(fā)生了不同程度的位移，沒(méi)有參與重金屬吸附的官能團(tuán)的吸收峰位移均較小[12]，如2924～2934，1054～1064 cm-1等的吸收帶。變化較明顯的有羥基(3217～3278 cm-1)、羧基(1411～1453 cm-1)、酰胺基(1610～1655 cm-1)等的吸收峰。原因可能是植物吸收重金屬后，羧基與重金屬發(fā)生了離子交換或絡(luò)合，最大吸收峰波數(shù)略有降低；酰胺峰是蛋白質(zhì)的特征譜帶，在后，羧基與重金屬發(fā)生了離子交換或絡(luò)合，最大吸收峰波數(shù)略有降低；酰胺峰是蛋白質(zhì)的特征譜帶，在附重金屬后，其吸收峰的位置和強(qiáng)度發(fā)生了變化[12]，表明在吸附過(guò)程中蛋白質(zhì)作為運(yùn)輸重金屬離子的載體或與其螯合的大分子物質(zhì)起到了重要作用[18-19]。植物對(duì)重金屬脅迫的反應(yīng)表現(xiàn)于生理特征上，而核酸、碳水化合物等有機(jī)物特征峰的變化可反映植物在重金屬污染下的生理情況，耐重金屬毒害的植物與重金屬敏感型植物在重金屬耐性上的差異主要也是由于其體內(nèi)生理生化代謝存在著差異的緣故[19-20]。

由表1可知，綠豆幼苗根、莖、葉紅外光譜特征峰的吸收強(qiáng)度隨重金屬濃度的增加表現(xiàn)趨勢(shì)有所不同。根在高濃度重金屬處理后大多數(shù)特征峰都比對(duì)照低，在同一濃度同一特征峰下根的吸收強(qiáng)度也比莖、葉低，這可能是因?yàn)閷⒂泻﹄x子積累于根部是植物阻止其對(duì)光合作用及新陳代謝活性毒害的一種策略[10,19]，或是根的向上運(yùn)輸作用。在3217～3278，1610～1655，1411 ～1453 cm-1等處，綠豆幼苗根吸收峰的吸光度表現(xiàn)為高濃度比中低濃度高，說(shuō)明高濃度的重金屬可誘導(dǎo)它產(chǎn)生大量的蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)，通過(guò)滲透調(diào)節(jié)來(lái)增強(qiáng)抗逆性,提供氮源，減輕重金屬毒害[18]，穩(wěn)定內(nèi)部環(huán)境。在重金屬處理后，綠豆幼苗莖、葉的特征峰都比對(duì)照高或接近于對(duì)照。這可能是由于綠豆幼苗對(duì)重金屬的耐性高的緣故[18]。

2.3 Cr6+脅迫對(duì)綠豆幼苗中重金屬分布的影響

由表2可知，隨著Cr6+濃度的增大該植物地上部分根、地下部分的Cr6+積累量增加，各處理間差異顯著(P<0.05)，其具體表現(xiàn)為地下部分根>地上部分。并且濃度越大，增長(zhǎng)的幅度也越大，積累的量越大。地上部分(莖、葉)積累Cr6+的量明顯低于根部，說(shuō)明根部所積累的Cr6+只有部分轉(zhuǎn)移到了地上部分。當(dāng)處理Cr6+濃度為100 mg/L時(shí)，此時(shí)該植物呈現(xiàn)出明顯傷害癥狀，其積累Cr6+含量仍然最高。根、莖、葉中Cr含量(mg/kg)分別是：3518.34±2.59a，903.99±5.52a，994.08±5.13a。

3 結(jié) 論

表2 Cr6+脅迫對(duì)綠豆幼苗中重金屬分布

注：同列具有不同字母上標(biāo)者為差異顯著(P< 0.05)。

Note： Different letters superscript in same column indicate the significant difference at 0.05 level.

(1)不同濃度鉻處理?xiàng)l件下(鉻濃度低于100 mg/L) ，綠豆幼苗均能正常生長(zhǎng)，雖然在100 mg/L鉻處理件下，生物量又略顯降低，但是生物量在不同處理?xiàng)l件下差異不顯著，這表明綠豆幼苗具有較強(qiáng)的鉻耐性。

(2)重金屬并未破壞植物器官本身的結(jié)構(gòu)，是因?yàn)榫G豆幼苗根、莖、葉各組分在重金屬處理前后的紅外光譜峰形基本保持不變，而發(fā)生較大位移的吸收峰(3217～3278，1411～1453，1610～1655 cm-1)與參加重金屬吸附的官能團(tuán)有關(guān)，這說(shuō)明作為運(yùn)輸重金屬離子的載體及與其螯合的大分子物質(zhì)與重金屬發(fā)生了離子交換、絡(luò)合。

(3)植物體內(nèi)生理與代謝變化與綠豆幼苗紅外光譜有機(jī)物特征峰的變化有關(guān)，根隨重金屬濃度增加而降低反映核酸、碳水化合物等有機(jī)物變化的特征峰的吸收強(qiáng)度。而植物莖、葉對(duì)重金屬有較強(qiáng)的耐性，因?yàn)樗鼈冊(cè)诟鳚舛戎亟饘偬幚硐屡c植物生理有關(guān)的化學(xué)成分的特征峰大多數(shù)都比對(duì)照高或接近于對(duì)照。

(4)很多重金屬元素能夠積累在植物體內(nèi)，綠豆幼苗對(duì)Cr6+的積累地上部分(莖、葉)積累的Cr6+量明顯低于根部，因此，根是最容易受Cr6+毒性影響的部位，根部Cr6+含量的變化是植物受Cr6+毒性影響的重要指標(biāo)之一。

(5)雖然綠豆不是 Cr6+的超積累植物，但從耐Cr6+能力、地上部分對(duì)Cr6+的富集量等多方面綜合考慮，綠豆幼苗受Cr6+污染的土壤中植物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，擁有潛在的利用價(jià)值。

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