萬壽菊生物熏蒸對連作蘋果幼苗和土壤微生物的影響*

王曉芳 徐少卓 王 玫 段亞楠 王海燕 盛月凡 毛志泉?

（1 作物生物學(xué)國家重點實驗室/山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安 271018）

（2 山東省果樹研究所，山東泰安 271000）

連作障礙（Hazard posed by continuous cropping to replanting）在全世界蘋果主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生［1］。近年來，越來越多的研究證實土傳病蟲害是導(dǎo)致連作障礙的主要原因，如真菌中的柱孢屬（Cylindrocarpon）、絲核菌屬（Rhizoctonia）、疫霉屬（Phytophthora）、腐霉屬（Pythium）及鐮刀菌屬（Fusarium）等［2-4］，各主產(chǎn)區(qū)的致病菌種差異很大；某些線蟲也可能與連作障礙相關(guān)，如穿刺根腐線蟲（Pratylenchus penetrans）［5］。因此，研究建立防治土傳病蟲害的措施是緩解蘋果連作障礙的根本。土壤熏蒸（消毒）是破解連作障礙這一難題的有效措施，目前主要依靠化學(xué)熏蒸劑，如溴甲烷、棉隆和氯化苦等。溴甲烷能高效、廣譜地殺死各種有害生物，但其嚴(yán)重影響地球環(huán)境和人類健康，已被淘汰；其他化學(xué)藥劑雖尚未淘汰，但長期大量使用會對環(huán)境和農(nóng)作物產(chǎn)生污染，危害人類健康［6］，而且化學(xué)熏蒸導(dǎo)致土壤酶活性顯著下降，極大地降低了農(nóng)業(yè)土壤的可持續(xù)生產(chǎn)力［7-8］。因此，發(fā)展可行的替代技術(shù)抑制土傳病蟲害并進(jìn)行有效病蟲害管理成為當(dāng)前研究的熱點，生物熏蒸（Biofumigation）應(yīng)運(yùn)而生。

生物熏蒸是利用動植物的有機(jī)質(zhì)在分解過程中產(chǎn)生的揮發(fā)性殺生氣體抑制或殺死土壤中有害生物的方法。Smolinska等［9］研究表明，埃塞俄比亞芥菜（Brassica carinata）、黑芥子（B. nigra）和芥菜（B. juncea）含有較高的硫代葡萄糖苷（GSLs）能釋放出異硫氰酸酯（ITCs），對土壤中的尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）病原體有很好的抑制作用。目前，菊科植物、綠肥、家禽糞便等均被用作生物熏蒸材料以有效防治土傳病害及植物根結(jié)線蟲［10-11］，但關(guān)于生物熏蒸的報道主要是使用蕓薹屬植物。本研究前期室內(nèi)抑菌試驗發(fā)現(xiàn)萬壽菊（Tateges erecta）具有較強(qiáng)的抑菌效果。萬壽菊為菊科萬壽菊屬一年生草本植物，其含有的揮發(fā)性成分具有抗菌、抑菌及殺蟲等多種生物活性。范志宏等［12］研究表明，萬壽菊根提取物對西瓜枯萎病菌有明顯的抑制作用，其中以精油類的抑菌效果最好，且能促進(jìn)植株生長，有效減輕西瓜枯萎病菌對植株的毒害作用。作為一種商業(yè)化色素的新來源，萬壽菊的種植面積日益增長，對于萬壽菊鮮花的利用研究較多，并已用于工業(yè)生產(chǎn)中。但對于萬壽菊秸稈及葉子，采收后的萬壽菊植株大部分被隨意拋棄或就地焚燒，造成資源浪費且焚燒產(chǎn)生大量有害氣體，對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染［13］。尋求高效、經(jīng)濟(jì)的萬壽菊廢棄植株利用途徑是值得研究的課題，用萬壽菊作為生物熏蒸劑克服蘋果連作障礙尚未見報道。本研究用萬壽菊風(fēng)干粉末對老齡蘋果園土壤進(jìn)行熏蒸，探討萬壽菊生物熏蒸對蘋果幼苗及連作土壤環(huán)境的影響，以期為生產(chǎn)中利用生物熏蒸防治蘋果連作障礙提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2015年4月—2016年12月在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院、國家蘋果工程技術(shù)研究中心及作物生物學(xué)國家重點實驗室進(jìn)行。

試驗用土取自山東省泰安市滿莊鎮(zhèn)小王莊村25 a生老齡蘋果園，取自距樹干80 cm，去表層土后深10～40 cm的區(qū)域，多點隨機(jī)取樣，混勻備用。土壤類型為棕壤。土壤基本理化性質(zhì)如下：硝態(tài)氮銨態(tài)氮有效磷9.3 mg kg-1，速效鉀90.6 mg kg-1，有機(jī)質(zhì)5.3 g kg-1。

供試植物材料為實生平邑甜茶（M a l u shupehensisRehd.）蘋果幼苗，種子于4℃層積30 d左右，待種子露白后，于2015年12月9日播種于育苗基質(zhì)中，幼苗長至6片真葉，備用。

熏蒸用萬壽菊（Tateges erecta）為播種繁育的盆栽試材，于2015年4月中旬播種，8月中旬收集全株，用自來水沖洗干凈后，自然風(fēng)干，以粉碎機(jī)粉碎，過30目篩，裝入封口袋備用。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置5個處理，分別為：①老齡蘋果園土壤對照（未作處理，CK）；②覆膜（未拌入萬壽菊，F(xiàn)）；③萬壽菊1.5 g kg-1+覆膜（1.5T+F）；④萬壽菊6.0 g kg-1+覆膜（6.0T+F）；⑤萬壽菊15.0 g kg-1+覆膜（15.0T+F）。

2016年1月10日進(jìn)行熏蒸處理，在每個泥瓦盆盆底（盆直徑23 cm，高18 cm）放置濾紙，將不同添加量的萬壽菊（0、1.5、6、15 g kg-1）與老齡蘋果園土壤拌勻后裝盆，每盆裝3.0 kg混合土，澆透水，覆膜熏蒸，15 d后，去膜晾7 d。選取長勢一致的6葉平邑甜茶幼苗進(jìn)行移栽。每處理20盆，每盆2株幼苗，隨機(jī)排列，正常肥水管理，每個月施1次復(fù)合肥（氮磷鉀復(fù)混肥料15-15-15），每盆施用6 g，施肥后澆水，每3天澆水1次，每次澆水500 ml。

栽植幼苗生長120 d取樣測定相關(guān)指標(biāo)。土壤樣品采集：每個處理取3盆作為3次重復(fù)，去掉表層土壤和盆周圍的土壤，取根際土，并將土壤裝入黑色塑料袋帶回實驗室，過12目篩（1.70 mm）取大約500 g分裝至3個封口袋保存，一份4℃冷藏備用，用于土壤微生物數(shù)量的測定；一份風(fēng)干，用于土壤酶測定；一份-20℃冰箱保存，用于提取DNA，進(jìn)行末端限制性片段長度多態(tài)性（Terminal restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）分析及實時熒光定量分析。植物樣品整株采集，輕輕抖落根部土壤，用清水沖洗干凈，將樣品及時帶回實驗室進(jìn)行處理，測定株高、干重等指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)及方法

生物量測定采用常規(guī)稱重方法。

根系形態(tài)指標(biāo)測定：將平邑甜茶幼苗根系用清水洗凈，放于盛有水的硬塑料盒中，在水中平鋪展開，使用專業(yè)版WinRHIZO（2007年版）根系分析系統(tǒng)處理樣品圖像，記錄根長度、根系表面積和根體積。

土壤酶測定參照關(guān)松蔭［14］的方法。脲酶測定采用比色法，以24 h后1 g土壤中NH3-N的質(zhì)量（mg）表示脲酶活性，用NH3-N mg g-1d-1表示。過氧化氫酶采用容量法，以1 g土壤的 0.1 mol L-1高錳酸鉀毫升數(shù)表示過氧化氫酶活性，用ml g-1表示。磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法，以1 g土壤的酚毫克數(shù)表示磷酸酶活性，用mg g-1d-1表示。蔗糖酶測定采用比色法，以24 h后1 g土壤中葡萄糖的質(zhì)量（mg）表示蔗糖酶活性，用mg g-1d-1表示。

土壤微生物測定：細(xì)菌、真菌、放線菌均用平板涂抹法測定，測定前計算水分系數(shù)。細(xì)菌采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌采用馬丁氏培養(yǎng)基，放線菌采用高氏一號培養(yǎng)基［15］。

樣品基因組總DNA的提取及純化按照E. Z.N.A. Soil DNA Kit說明書進(jìn)行操作，用于T-RFLP技術(shù)分析和實時熒光定量核酸擴(kuò)增檢測系統(tǒng)（qPCR）。

T-RFLP分析：①ITS-PCR擴(kuò)增。用于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（Internal transcribed spacer，ITS）片段擴(kuò)增的引物采用帶羧基熒光素（FAM）熒光標(biāo)記的真菌通用引物ITS1-F-FAM和ITS4，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。ITS1-F-FAM（5′→3′）：CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA；ITS4（5′→3′）：TCCTCCGCTTATTGATAGC。ITS擴(kuò)增反應(yīng)體系為：12.5 μl 2 × Taq MasterMix，1 μl DNA模板，ITS1-F和ITS4（10 μmol L-1）各1.5 μl，加dd H2O至25 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性60 s，51℃退火60 s，72℃延伸60 s，共34個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。取5 μl ITS-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按照 PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，-20℃保存?zhèn)溆?。②酶切。用限制性?nèi)切酶Hha I對上述PCR純化產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切反應(yīng)體系為30 μl：含10 μl ITS-PCR純化產(chǎn)物、2 μl Hha I（10 U μl-1）、2 μl 10×Buffer，加dd H2O至30 μl。置于37℃水浴中溫育4 h，酶切完畢后65℃水浴20 min終止反應(yīng)。將酶切產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份公司進(jìn)行測序。對測序結(jié)果進(jìn)行真菌群落多樣性分析（多樣性指數(shù)、優(yōu)勢度指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)）、聚類分析和主成分分析［16］。

實時熒光定量采用CFX ConnectTMReal-Time System（Bio-Rad，美國）對土壤中層出鐮孢菌基因拷貝數(shù)進(jìn)行絕對定量分析。實時熒光定量PCR體系依據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMKit TaKaRa試劑盒說明步驟完成。25 μl PCR反應(yīng)體系：DNA模板1.5 μl；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 12.5 μl；引物各1 μl；ddH2O 9 μl。層出鐮孢菌PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s；60℃退火30 s；共計40個循環(huán)［17］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003進(jìn)行計算和作圖，通過SPSS 19.0進(jìn)行方差分析，采用鄧肯（Duncan’s）新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢測，用Origin 8.5完成對試驗數(shù)據(jù)的制圖。

2 結(jié) 果

2.1 萬壽菊生物熏蒸對平邑甜茶幼苗生長的影響

與對照相比，不同添加量的萬壽菊生物熏蒸處理均對蘋果幼苗生長有促進(jìn)作用，均使平邑甜茶幼苗生物量有所增加（表1）。其中以6.0T+F處理的效果最好，其株高、地徑、地上部及根系干重分別為對照的3.6倍、1.5倍、8.1倍和13.1倍，與對照差異顯著。1.5T+F處理的分別為對照的2.1倍、1.1倍、3.9倍、5.8倍；15.0T+F處理的分別為對照的1.9倍、1.3倍、4.8倍、6.4倍（表1）。單獨覆膜處理對平邑甜茶幼苗生長有促進(jìn)作用，各項指標(biāo)分別為對照的1.3倍、1.2倍、2.2倍和3.1倍。

2.2 萬壽菊生物熏蒸對平邑甜茶幼苗根系的影響

與對照相比，不同添加量的萬壽菊生物熏蒸處理均對蘋果幼苗根系生長起到明顯促進(jìn)作用（表2）。其中以6.0T+F處理的效果最好，平邑甜茶幼苗的根長度、根表面積、根體積及根尖數(shù)顯著增加，分別較對照增加了226.5%、333.0%、548.4%和142.7%，與對照差異顯著。1.5T+F處理的分別增加了52.4%、45.9%、82.8%、43.9%；15.0T+F處理的分別增加了42.4%、98.3%、178.9%、18.4%。單獨覆膜處理對平邑甜茶幼苗根系生長也有促進(jìn)作用，各項指標(biāo)分別較對照增加33.4%、41.4%、73.9%和3.2%，但與對照差異不顯著。

2.3 萬壽菊生物熏蒸對蘋果連作土壤酶活性的影響

與對照相比，不同添加量的萬壽菊生物熏蒸處理顯著提高了連作土壤酶活性（圖1）。其中，脲酶、磷酸酶活性以6.0T+F處理的效果最好，分別較對照高103.6%、77.6%（圖1A、圖1B）；蔗糖酶活性以15.0T+F處理的最高，較對照高302.0%，6.0T+F處理的較對照高200.4%（圖1C）。過氧化氫酶活性以6.0T+F和15.0T+F處理的活性最高，均較對照高64.6%（圖1D）。單獨覆膜處理使脲酶、磷酸酶、蔗糖酶、過氧化氫酶活性分別提高37.7%、20.3%、88.9%和10.8%。

表1 萬壽菊生物熏蒸下平邑甜茶幼苗生長指標(biāo)Table 1 Growth indices of Malus hupehensis Rehd. seedlings in soils biofumigated with Tateges erecta powder

表2 萬壽菊生物熏蒸下平邑甜茶單株幼苗根系的生長Table 2 Growth of Malus hupehensis Rehd. seedling roots in soils biofumigated with Tateges erecta powder

2.4 萬壽菊生物熏蒸對土壤微生物數(shù)量的影響

與對照相比，連作土壤中加入不同量的萬壽菊熏蒸后，各處理土壤中的真菌數(shù)量明顯減少，細(xì)菌、放線菌數(shù)量顯著增加，細(xì)菌/真菌比值變大（表3）。以6.0T+F處理的效果最好，細(xì)菌/真菌比值為219.9，是對照的5.6倍；其次是15.0T+F處理的（137.0），為對照的3.5倍。說明萬壽菊生物熏蒸明顯改善了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，使連作土壤真菌減少、細(xì)菌增加，向細(xì)菌型土壤轉(zhuǎn)化，微生物環(huán)境優(yōu)化，有利于根系生長發(fā)育和植株生長。

2.5 不同處理土壤真菌群落結(jié)構(gòu)

通過多樣性指數(shù)、聚類分析和主成分分析（PCA）比較萬壽菊生物熏蒸對土壤真菌多樣性的影響，了解連作蘋果園土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)特征變化。與對照相比，老齡蘋果園土壤加入萬壽菊生物熏蒸處理后，土壤真菌群落的多樣性、均勻度和豐富度指數(shù)均有所下降，但優(yōu)勢度指數(shù)明顯增加（表4）。由此可見，萬壽菊生物熏蒸處理改變了土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)，使土壤真菌群落的豐富度、多樣性和均勻度降低，某種真菌優(yōu)勢度明顯增加。

由圖2聚類分析可以看出，不同添加量萬壽菊生物熏蒸的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與連作土壤完全獨立開來，說明萬壽菊生物熏蒸處理后明顯改變了連作蘋果園土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)。其中，6.0T+F處理和15.0T+F處理間關(guān)系較近，F(xiàn)和1.5T+F間關(guān)系較近。

圖1 萬壽菊生物熏蒸對連作條件下脲酶（A）、磷酸酶（B）、蔗糖酶（C）和過氧化氫酶（D）活性的影響Fig. 1 Effects of biofumigation with Tateges erecta powder on soil enzyme activities（urease activity（A），phosphatase activity（B），invertase activity（C），and catalase activity（D））in soils under continuous cropping

表3 萬壽菊生物熏蒸下土壤微生物數(shù)量Table 3 Population of soil microorganisms in soils biofumigated with Tateges erecta powder

表4 萬壽菊生物熏蒸對土壤真菌多樣性的影響Table 4 Effects of biofumigation with Tateges erecta powder on the soil fungal diversity

圖2 不同處理間真菌末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）圖譜的聚類分析Fig. 2 Cluster analysis of T-RFLP patterns of fungi in the soil relative to treatment

根據(jù)不同處理間的末端限制性片段（T-RFs）在圖譜中的分布及豐度進(jìn)行主成分分析（PCA）。根據(jù)主成分的提取原則，被選的主成分所代表的主軸總長度占所有主軸長度之和的大約85%即可，對各樣品獲得的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，前2個主成分特征值的貢獻(xiàn)率總和為 99.16%，所以選取2個主成分來進(jìn)行分析。從圖3可以看出，萬壽菊生物熏蒸處理與老齡蘋果園土壤對照完全分開，說明萬壽菊生物熏蒸處理明顯改變了老齡蘋果園土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)。

2.6 不同處理土壤層出鐮孢菌數(shù)量

圖3 不同處理間真菌T-RFLP 圖譜的主成分分析Fig. 3 Principal component analysis of T-RFLP patterns of fungi in the soil relative to treatment

徐文鳳［18］在中國環(huán)渤海蘋果重茬園中分離出大量鐮孢屬真菌，分別為尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、層出鐮孢菌（F. proliferatum）、腐皮鐮孢菌（F. solani）和串珠鐮孢菌（F. moniliforme）。致病性測定結(jié)果表明，層出鐮孢菌和串珠鐮孢菌致病性最強(qiáng)［18］。利用實時熒光定量技術(shù)（Real-time PCR）對層出鐮孢菌（F. proliferatum）的基因拷貝數(shù)進(jìn)行絕對定量分析（圖4）。結(jié)果表明，萬壽菊生物熏蒸處理的層出鐮孢菌基因拷貝數(shù)均低于CK，1.5T+F、6.0T+F、15.0T+F處理分別較對照低49.3%、57.9%、50.6%。單獨覆膜處理較對照降低了27.2%。說明萬壽菊生物熏蒸能夠顯著減少層出鐮孢菌的數(shù)量。

圖4 不同處理層出鐮孢菌的基因拷貝數(shù)Fig. 4 Gene copy number of Fusarium proliferatum in the soil relative to treatment

3 討 論

土壤添加劑可以改善土壤結(jié)構(gòu)，影響土壤微生物群落，促進(jìn)植物生長發(fā)育，增強(qiáng)植物自身抗性，提高農(nóng)作物的品質(zhì)與產(chǎn)量，所以，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中使用土壤添加劑已成為作物土傳病蟲害生態(tài)防治的重要措施之一［19-20］。蘋果連作土壤中添加芥菜籽粉和白芥子粉等綠肥后，能明顯促進(jìn)嘎拉/M26幼樹生長［21］。本研究發(fā)現(xiàn)，添加6.0 g kg-1的萬壽菊粉末進(jìn)行生物熏蒸可顯著增加平邑甜茶幼苗的株高及生物量，尤其是對根系生長促進(jìn)作用明顯。Arnault等［22］發(fā)現(xiàn)以洋蔥和韭菜加工廢料作為土壤生物熏蒸劑可明顯改善土壤結(jié)構(gòu)，促進(jìn)草莓和蘆筍生長，可使草莓和蘆筍增產(chǎn)15%～20%，與芥菜處理的效果相當(dāng)。研究中發(fā)現(xiàn)萬壽菊低濃度（1.5 g kg-1）和高濃度（15.0 g kg-1）添加量的促生效果略差，1.5 g kg-1因為添加量不足，熏蒸效果不理想，15.0 g kg-1雖然添加量大，但效果卻不是最理想的，室內(nèi)的抑菌試驗發(fā)現(xiàn)萬壽菊粉末加水后黏性較大，因此，施入土壤的量太大會導(dǎo)致土壤透氣性不良，土壤黏結(jié)，不利于根系生長。

土壤酶是土壤中動植物殘體分解、植物根系分泌和土壤微生物代謝的產(chǎn)物，是一類具有生物化學(xué)催化活性的特殊物質(zhì)，參與土壤中許多重要的生物化學(xué)過程，是土壤中最活躍的部分，直接影響著土壤的代謝性能，且能活化土壤有機(jī)質(zhì)，將其轉(zhuǎn)化為植物可吸收的無機(jī)物，其活性大小在一定程度上代表土壤肥力的高低，較高的酶活性水平，能在一定程度上保證作物在土壤肥力貧瘠的土地上生長良好［23］。谷巖等［24］研究發(fā)現(xiàn)，大豆重茬使土壤脲酶和轉(zhuǎn)化酶活性均顯著降低。蘋果連作土壤的過氧化氫酶、脲酶、蔗糖酶和中性磷酸酶活性降低，可能是連作使土壤環(huán)境惡化的表現(xiàn)之一，而澆灌3%濃度的有機(jī)物料發(fā)酵液可提高蘋果連作土壤的酶活性［25］。本研究中，老齡蘋果園土壤中加入萬壽菊粉末生物熏蒸后，土壤酶活性顯著提高，綜合蔗糖酶、脲酶、磷酸酶、過氧化氫酶活性測定結(jié)果看，以6.0 g kg-1處理的效果最好，這說明適宜量的萬壽菊粉末施入土壤后不僅具有良好的抑菌或滅菌作用，而且其植物組織腐爛分解后可能改良土壤的理化性質(zhì)特別是持水性、有機(jī)質(zhì)含量、肥力及通透性等，改善土壤的營養(yǎng)條件，促進(jìn)植物生長和增產(chǎn)。這與王艷芳等［26］在連作土壤中添加適量甲殼素能提高土壤中蔗糖酶、脲酶、磷酸酶和過氧化氫酶活性的研究結(jié)果較為一致。

土壤微生物是土壤中活的有機(jī)體，是最活躍的土壤肥力因子之一［27］。土壤微生物種群在很大程度上決定著土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的分解、循環(huán)和能量流動，通過調(diào)節(jié)土壤環(huán)境可以改變土壤微生物的種群組成和多樣性，影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能［28］。植物連作后，由于長期受同一類根系分泌物的影響，土壤微生物群落會發(fā)生選擇性富集，導(dǎo)致土壤微生物群落數(shù)量發(fā)生變化，擾亂了土壤微生物生態(tài)平衡，連作后土壤中細(xì)菌的數(shù)量總體下降，真菌的數(shù)量顯著上升，病原菌數(shù)量急劇增加，土壤微生物從細(xì)菌主導(dǎo)型向真菌主導(dǎo)型轉(zhuǎn)化，使病原菌更容易侵染植物而引發(fā)各種土傳病害［29］。因此，尋找適宜的控制土傳病蟲害措施可有效防控連作障礙。隨著環(huán)保意識的增強(qiáng)，各國學(xué)者致力于研究環(huán)保型熏蒸措施對土壤中致病病原菌或線蟲的抑制或殺生作用。Lazzeri等［30］研究發(fā)現(xiàn)，芥子科植物（芥菜、芝麻菜等）作為殺生性綠肥顯著減少了腐霉菌屬繁殖體的數(shù)目。將高GSLs含量的蕓薹屬植物組織風(fēng)干制成殺生小球，施入土壤澆水熏蒸處理后發(fā)現(xiàn)，該處理與用純硫代葡萄糖苷和黑芥子酶處理同樣對腐霉菌（Pythiumspp.）和立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）有很好的熏蒸效果［31］。

本研究用平板涂布法結(jié)合末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）技術(shù)研究萬壽菊生物熏蒸對連作蘋果園土壤中微生物數(shù)量和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響?；赥-RFLP圖譜，運(yùn)用多樣性指數(shù)和主成分分析比較了不同處理間真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，老齡蘋果園土壤采取萬壽菊生物熏蒸處理后土壤中的真菌數(shù)量明顯減少而細(xì)菌、放線菌數(shù)量顯著增加，細(xì)菌/真菌比值顯著增加，以6.0 g kg-1處理的效果最好，細(xì)菌/真菌比值為219.9，土壤類型由真菌型向細(xì)菌型轉(zhuǎn)變。同時，萬壽菊生物熏蒸對連作土壤中真菌種類及豐度均產(chǎn)生了一定的影響，萬壽菊生物熏蒸使老齡蘋果園土壤中真菌的多樣性、均勻度和豐富度降低，優(yōu)勢度增加，這與本實驗室以往的研究結(jié)果［26］不一致，可能是因為萬壽菊生物熏蒸使某些真菌數(shù)量明顯增加，處于優(yōu)勢地位，也可能是因為萬壽菊植株內(nèi)存在著具有殺菌效果的內(nèi)生真菌。有研究［32］表明，有些植物內(nèi)生真菌具有顯著的生物熏蒸效果，具體原因有待于進(jìn)一步深入研究。Hollister等［33］最早利用高通量測序法分析芥菜籽粕（SM，釋放烯丙基異硫氰酸酯）對土壤真菌和細(xì)菌群落的影響，發(fā)現(xiàn)芥菜籽粕顯著影響土壤真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，使真菌多樣性降低60%，與真菌病害相關(guān)的細(xì)菌類群豐富度增加（如芽孢桿菌屬、假單胞桿菌屬和鏈霉菌屬等），有效抑制了真菌病害發(fā)生。Hu等［34］研究發(fā)現(xiàn)，烯丙基型異硫氰酸酯使真菌數(shù)量減少85%，不同類型的異硫氰酸酯使真菌群落組成發(fā)生明顯改變，如烯丙基型異硫氰酸酯處理土壤后腐質(zhì)霉屬（Humicola）真菌增加，丁基型異硫氰酸酯處理土壤后被孢霉屬（Mortierella）真菌增加，但不同的異硫氰酸酯化合物對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)影響較小。Weerakoon等［35］研究也發(fā)現(xiàn)，芥菜籽粉不僅對連作蘋果園土壤中腐霉屬（Pythiumspp.）病原菌具有抑制作用，而且改變連作土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)，這種土壤中原有真菌群落結(jié)構(gòu)的調(diào)整，很可能有助于芥菜籽粉抑制腐霉菌對蘋果根系的侵染，進(jìn)而緩解蘋果連作障礙 。Yim等［36］研究發(fā)現(xiàn)，芥菜生物熏蒸能夠促進(jìn)連作土壤中蘋果樹的生長，且改變了土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，對真菌的影響較細(xì)菌明顯。Ascencion等［37］研究發(fā)現(xiàn)，在三種試驗土壤中施用蕪菁、甘藍(lán)型油菜、芥菜熏蒸均能有效抑制白菜立枯絲核菌，抑制率分別為96.7%～100%、86.7%～100%、40%～100%，同時顯著改變了土壤中微生物的數(shù)量和種群結(jié)構(gòu)，3種物質(zhì)熏蒸后土壤中的細(xì)菌數(shù)量明顯增加，真菌數(shù)量減少。

本研究在設(shè)置試驗時，同時設(shè)置了單獨覆膜處理，單獨覆膜處理有一定的熏蒸作用，對幼苗及根系生長有促進(jìn)作用，但促進(jìn)效果不明顯，與對照差異不顯著。因此，在生產(chǎn)應(yīng)用中，連作土壤中添加適量的萬壽菊粉澆水覆膜可使連作土壤由真菌型向細(xì)菌型轉(zhuǎn)變，而且也有利于維持土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，緩解連作障礙，促進(jìn)連作條件下蘋果幼苗生長發(fā)育。

萬壽菊風(fēng)干粉末生物熏蒸對緩解蘋果連作障礙有較好的效果，為使生產(chǎn)上操作性更強(qiáng)，應(yīng)對萬壽菊適宜劑型進(jìn)行試驗，并配套相應(yīng)的技術(shù)措施。近年發(fā)展起來的高通量測序技術(shù)，對深入研究連作對土壤微生物群落組成和功能變化是較好的技術(shù)手段，該技術(shù)能夠分析某些特定的菌群，如細(xì)菌、氨氧化細(xì)菌、真菌及一些植物病原菌（鐮刀菌類、茄科勞爾氏菌）的變化情況，測定的微生物種類和數(shù)量更加多樣、豐富，結(jié)果也會更加可靠［27］。因此，下一步應(yīng)采用該測定技術(shù)深入研究萬壽菊生物熏蒸處理后土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化和萬壽菊的抑菌機(jī)理。

4 結(jié) 論

老齡蘋果園土壤中添加適量的萬壽菊進(jìn)行熏蒸有助于增加有益細(xì)菌的數(shù)量，抑制土壤中病原真菌的繁殖，且有利于維持土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性，這些變化有利于連作土壤朝著穩(wěn)定健康的方向發(fā)展，促進(jìn)連作條件下蘋果幼苗生長發(fā)育，達(dá)到緩解蘋果連作障礙的目的。

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