一種龍須菜寄生真菌的種類鑒定及侵染過程研究?

闕 州， 隋正紅， 米 萍， 商二磊

(中國海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266003)

在淡水中，已發(fā)現(xiàn)有大量寄生于藻類中的游孢子型真菌(zoosporic true fungi)，包括壺菌門(Chytridiomycota)，新美鞭菌門(Neocallimastigomycota)和Blastocladiomycota，此外還有許多類似真菌的生物被發(fā)現(xiàn)寄生在微藻中，包括卵菌(Oomycetes)、擬網(wǎng)黏菌類(Labyrinthulids)、破囊壺菌類(Thraustochytrids)等[1]。然而寄生于海洋藻類的真菌至今了解甚少。藻類養(yǎng)殖業(yè)中由寄生生物引起的疾病會造成大量的經(jīng)濟(jì)損失，在所有寄生生物(原生動物、假菌界、真菌、細(xì)菌、寄生藻類、線蟲和病毒)中，真菌所造成的影響僅次于細(xì)菌[2-3]。關(guān)于藻類寄生真菌的研究主要集中在致病真菌方面，真菌感染特異性和菌藻關(guān)系是菌藻作用的研究重點(diǎn)[4-5]，而真菌的致病機(jī)理和生理反應(yīng)相關(guān)研究則很少涉及，這也是未來研究藻類致病真菌的主要目標(biāo)和方向。

海洋藻類寄生致病真菌主要有三個(gè)綱：壺菌綱(Chytridiomycetes)、子囊菌綱(Ascomycetes)和半知菌綱(Deuteromycetes)[6-7]，已被鑒定的物種包括6種壺菌、31種子囊菌和1種半知菌[5]。6種壺菌為Chytridiumpolysiphoniae，Chytridiummegastomum，Coenomycessp.，Rhizophydiumlittoreum，Olpidiumrostriferum和Thalassochytriumgracilariopsidis。最初的研究表明，Chytridiumpolysiphoniae是一種寄生病原菌，可使紅藻Centrocerasclavulatum(C. Agardh)及褐藻Sphacelariasp.和Pylaiellalittoralis致病[3,8]。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，Chytridium能夠侵染23種褐藻，包括8個(gè)目，19個(gè)屬[9]。Chytridium引起最嚴(yán)重的病害會導(dǎo)致黑頂藻(Sphacelaria)種群消失[3]。Coenomycessp.是一種侵染綠藻Cladophorasp.的寄生菌，然而被侵染的藻體形態(tài)不發(fā)生改變[10]。Olpidiumrostriferum是一種內(nèi)共生壺菌可侵染綠藻Cladophora和Rhizoclonium[3,11]，被侵染的藻體出現(xiàn)細(xì)胞腫大、偏褐色的癥狀[12]。Thalassochytriumgracilariopsidis首次被發(fā)現(xiàn)于龍須菜(Gracilariopsislemaneiformis)中，且是一種龍須菜高度特異的寄生菌，只侵染來自中國青島的龍須菜，對智利江蘺(Gracilariachilensis)、細(xì)枝江蘺(Gracilariatenuistipitata)等其它江蘺物種，甚至美國的龍須菜均沒有侵染性，且對寄主無害處[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)1種龍須菜寄生真菌。基于nucSSU rDNA和nucLSU rDNA的部分序列分析方法建立的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，該真菌屬于壺菌門(Chytridiomycota)，壺菌綱(Chytridiomycetes)，Lobulomycetales目；基于ITS1-5.8S-ITS2序列分析方法建立的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，該真菌不歸屬于Lobulomycetales目內(nèi)任一已知屬，可能是Lobulomycetales目內(nèi)1個(gè)新的屬。是首次發(fā)現(xiàn)寄生于紅藻江蘺的Lobulomycetales目物種。為了研究寄生真菌對龍須菜生長發(fā)育產(chǎn)生的影響，我們通過切片結(jié)合顯微觀察方法研究真菌侵染龍須菜的整個(gè)過程，結(jié)果表明真菌會損害龍須菜生長發(fā)育，會導(dǎo)致龍須菜細(xì)胞出現(xiàn)變形、脫色等癥狀，嚴(yán)重可致龍須菜藻體斷裂。通過PAS、CBB和Nile-red 3種方法染色發(fā)現(xiàn)，真菌富含多糖和蛋白質(zhì)，不含(或少含)脂質(zhì)；3種染色均可作為判斷藻體是否含真菌的方法。本研究為深入闡明菌藻作用提供了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料準(zhǔn)備

通過切片觀察選取含有錐狀/管狀特殊結(jié)構(gòu)(真菌孢子囊)和菌絲體的龍須菜藻體若干株(見圖1)，去除藻體表面雜質(zhì)及附生物，單獨(dú)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件為22 ℃, 15 μmol·m-2·s-1, 鹽度30‰, 12 h：12h 光暗周期。

( a.龍須菜體內(nèi)含真菌孢子囊(箭頭)；b.龍須菜體內(nèi)含真菌菌絲體(箭頭)。a. The sporangium of the fungus(black arrow)；b. The hypha of the fungus(black arrows).)

圖1 帶真菌的龍須菜藻體
Fig.1 The frond ofGp.lemaneiformiscontains endosymbiotic fungi

1.2 序列擴(kuò)增和測序

參照Timothy等[14]CTAB法提取龍須菜基因組DNA。

由于該真菌游孢子含有單鞭毛的特征，所以初步鑒定其屬于壺菌門，選取壺菌門4個(gè)目共10個(gè)物種的18S和28S rDNA序列進(jìn)行ClustalX比對，在 18S rDNA 3’側(cè)和28S rDNA 5’側(cè)各找到一段同源性高的序列，運(yùn)用Primer5.0分別于兩段高同源性序列中設(shè)計(jì)出大小均為23 bp的上游和下游PCR引物，引物序列如下：

正向引物：5′ CGCTA(C/G)TACCGATTGAATGGCTT 3′；

反向引物：5′ TCTTTCCCTCACGGTACTTGTTC 3′。

以提取的基因組DNA為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 5.0 min；94 ℃ 1.0 min，54、56、59、62、65 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1.0 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃10.0 min。擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行PCR產(chǎn)物測序，測序由青島擎科公司負(fù)責(zé)完成。測序采用Sanger雙向測序方法，測序完成后，運(yùn)用ContigExpress軟件對測序結(jié)果進(jìn)行拼接。

1.3 重建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

目標(biāo)序列拼接完成后，與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，選取目標(biāo)序列的18S和28S部分。再用18S+28S序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，找出與目標(biāo)序列的18S+28S同源性較高的門類，下載該門類中所有綱、所有目、所有科、所有屬的物種的18S+28S序列(如果有的話)。運(yùn)用ClustalX軟件進(jìn)行序列比對，比對后的序列采用MEGA軟件Kimura-2模型構(gòu)建ML和NJ進(jìn)化樹。18S+28S序列建樹可將目標(biāo)真菌鑒定到屬。

根據(jù)18S+28S序列的建樹結(jié)果，下載與目標(biāo)真菌進(jìn)化關(guān)系最密切的目中所有種的ITS1-5.8S-ITS2序列，運(yùn)用與上述同樣的方法建樹。ITS1-5.8S-ITS2序列建樹可將目標(biāo)真菌鑒定到種。

1.4 龍須菜寄生真菌侵染過程的觀察

選取帶真菌的龍須菜藻體，利用徒手切片方法對帶真菌藻體進(jìn)行連續(xù)切片觀察。顯微觀察采用 NIKON Eclipse 80i 顯微鏡。

1.5 龍須菜寄生真菌的染色觀察

為了觀察藻體內(nèi)部的真菌菌絲，以及判斷菌絲和孢子囊的化學(xué)組分，我們采用希夫氏高碘酸(PAS)、考馬斯亮藍(lán)(CBB)和尼羅紅(Nile red)方法對其進(jìn)行染色觀察[15-17]。PAS染色多糖為紅色，CBB染色蛋白質(zhì)為深藍(lán)色，尼羅紅可與脂質(zhì)物質(zhì)結(jié)合，結(jié)合后在紫外光激發(fā)下顯示紅色。

2 結(jié)果

2.1 序列擴(kuò)增和測序

PCR結(jié)果顯示5個(gè)退火溫度都擴(kuò)增出一個(gè)較亮的單一條帶，條帶大小為 1 100 bp左右，說明擴(kuò)增條帶特異性強(qiáng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序和拼接獲得1 045 bp的目標(biāo)序列，該序列已提交NCBI，序列編號為KU869767。

2.2 建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

用目標(biāo)序列的18S+28S與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，結(jié)果顯示與該真菌同源性較高的物種都屬于壺菌門(Chytridiomycota)，根據(jù)該真菌具有單鞭毛的特性，也能判定其屬于壺菌門。因此我們選取壺菌門中所有含18S+28S序列的屬，下載其18S+28S序列。選取物種包括壺菌門2個(gè)綱，8個(gè)目，16個(gè)科，22個(gè)屬，23個(gè)物種；同是真菌界的Mucoromycota門3個(gè)物種；以及2個(gè)outgroup物種。構(gòu)建ML樹(見圖2)。結(jié)果顯示，龍須菜寄生真菌(Aim)屬于Lobulomycetales目，是Lobulomycetales目中起源較早的物種，且不歸屬于任一已知屬，可能是Lobulomycetales目一個(gè)新的屬。

為了進(jìn)一步研究該真菌的種的界定，我們選取并下載Lobulomycetales目中所有物種的ITS1-5.8S-ITS2序列。選取的物種包括1個(gè)科，4個(gè)屬，8個(gè)種，以及2個(gè)未確定屬的物種(AF011和AF017)；Lobulomycetales目2個(gè)物種；以及blastocladiomycota門的2個(gè)物種作為outgroup。構(gòu)建ML樹(見圖3)。結(jié)果顯示，目標(biāo)真菌(Aim)與2個(gè)未確定屬(AF011、AF017)的物種進(jìn)化關(guān)系最密切，是Lobulomycetales目中起源較早的物種，且不歸屬于任一已知屬，可能是Lobulomycetales目內(nèi)一個(gè)新的屬。

NJ樹形與ML樹形一致。

圖2 基于18S+28S部分序列建立的ML進(jìn)化樹(Aim為(目標(biāo)真菌))Fig.2 ML phylogenetic tree based on partial 18S+28S sequence (Aim is the purpose fungus)

圖3 基于ITS1-5.8S-ITS2序列建立的ML樹Aim為(目標(biāo)真菌)Fig.3 ML phylogenetic tree based on ITS1-5.8S-ITS2 sequence(Aim is the purpose fungus)

2.3 龍須菜附生真菌侵染過程的觀察

通過切片觀察，我們研究了真菌侵染龍須菜過程。真菌首先侵入龍須菜表面膠質(zhì)層，侵染處形成漏斗狀痕跡(見圖3 a)，然后菌絲通過表皮細(xì)胞間隙進(jìn)入到髓部(見圖3 b)，并在髓部產(chǎn)生孢子囊(見圖3 c)，孢子囊產(chǎn)生大量游動孢子，整個(gè)孢子囊呈黃色(見圖3 d)，孢子囊發(fā)育成熟后開始放散游孢子(見圖3 e)，放散完后孢子囊顏色變淺(見圖3 f)，此時(shí)龍須菜表面出現(xiàn)大量孔洞(見圖3 g)，內(nèi)部細(xì)胞形狀異常甚至破裂(見圖3 h)，嚴(yán)重時(shí)藻體出現(xiàn)斷枝。

2.4 龍須菜寄生真菌的染色觀察

龍須菜寄生真菌菌絲伸入到次表皮細(xì)胞和髓部細(xì)胞中，孢子囊也嵌入藻體內(nèi)部細(xì)胞間。孢子囊較大淺黃或黃色容易觀察(見圖4 a)，而菌絲較細(xì)，顏色與髓部細(xì)胞一樣都偏白色(見圖4 g. 箭頭)，不易觀察。3種染色方法的染色結(jié)果顯示，真菌的孢子囊可以被PAS和CBB染色(見圖4 b、c)，菌絲也可以被PAS和CBB染色(見圖4 e、f. 箭頭)，表明真菌的孢子囊和菌絲都富含多糖和蛋白質(zhì)。Nile red對菌絲和孢子囊染色后，于紫外光激發(fā)下并不顯示紅色，而是顯示藍(lán)色(見圖4 h. 綠色箭頭)，表明真菌孢子囊和菌絲不含脂質(zhì)，而可能含多酚，因?yàn)槎喾游镔|(zhì)能在紫外光激發(fā)下發(fā)藍(lán)光。菌絲被PAS、CBB和Nile red染色后顏色(或熒光)較深，明顯與髓部細(xì)胞區(qū)別開來。當(dāng)真菌侵染龍須菜前期孢子囊并沒有形成時(shí)，只有菌絲存在于藻體內(nèi)部，菌絲顏色淺(見圖4 g. 紅色箭頭)，較難發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用這些染色方法即可有效判斷藻體是否含真菌菌絲(見圖4 h. 紅色箭頭)。

3 討論

壺菌門(Chytridiomycota)是游孢子具有一根后生尾鞭式鞭毛，鞭毛具有“9+2”結(jié)構(gòu)的一類真菌。壺菌門的鞭毛結(jié)構(gòu)也是其區(qū)別于真菌其它門類的主要依據(jù)。多數(shù)水生，少數(shù)兩棲或陸生，腐生、寄生、專性寄生均有。Rhizophydium是壺菌門最早被報(bào)道的種類，Schenk(1858)把Rhizophydium納入Chytridiales目[18]。過去分類學(xué)家根據(jù)菌絲形態(tài)、對稱中心、孢子囊蓋、隔膜等形態(tài)特征把壺菌門分為1個(gè)綱：Chytridiomycetes，3個(gè)目：Chytridiales，Blastocladiales，Monoblepharidales[19]。然而，壺菌門的物種形態(tài)差異較大，隨著越來越多壺菌門的物種被鑒定出來，形態(tài)的多樣性也越來越大，甚至同一屬的物種形態(tài)特征都很難統(tǒng)一，沒有一個(gè)統(tǒng)一的分類標(biāo)準(zhǔn)[20]，而且還有報(bào)道稱即便是同一物種，不同培養(yǎng)環(huán)境下其形態(tài)也會發(fā)生變化[21]。1980年，Barr 用游孢子亞細(xì)胞顯微觀察方法把Spizellomycetales從Chytridiales中分離出來成立一個(gè)新的目[22]，20年后，分子生物學(xué)手段的應(yīng)用支持了游孢子亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析的合理性[23]。近年來綜合運(yùn)用分子生物學(xué)和亞顯微技術(shù)極大推動了壺菌門系統(tǒng)分類研究[14, 23-25]，研究發(fā)現(xiàn)Spizellomycetales和Chytridiales目不是單系群。2006年，Letcher等通過對SSU和LSU rDNA序列分析和游孢子亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察方法，把Rhizophydium分枝從Chytridiales中分離出來單獨(dú)成立一個(gè)新的目Rhizophydiales[26]。而后研究者又從Spizellomycetales分出來一個(gè)新的目Rhizophlyctidales[25]。Sharon等[27]同樣通過對SSU 和 LSU rDNA序列分析和游孢子亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)觀察方法，把Cladochytrium進(jìn)化枝從Chytridiales中分離出來單獨(dú)成立一個(gè)新的目Cladochytriales。Simmons等[28]利用同樣的方法，把Chytridiales的一個(gè)分支C.angularis分離出來另立一個(gè)新目Lobulomycetales。Longcore等[29]把Polychytrium提升為新的目Polychytriales。Karpov等[30]同樣通過亞顯微觀察和rDNA序列分析方法發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)新的目：Gromochytriales和Mesochytriales。此外，分類學(xué)家Hibbett等[31]通過進(jìn)一步分析把原屬Chytridiomycetes綱的Monoblepharidales目提升為一個(gè)新的綱Monoblepharidomycetes；James等[14]把原屬壺菌門的Blastocladiales上升為Blastocladiomycota門。所有這些新目的發(fā)現(xiàn)不但反映了壺菌門種類的豐富多樣性，而且建立了以分子生物學(xué)手段為主的壺菌門分類標(biāo)準(zhǔn)[29]。通過亞顯微觀察和基因序列分析方法在壺菌門分類鑒定中的應(yīng)用，截至目前，壺菌門分為2個(gè)綱和10個(gè)目，2個(gè)綱分別為Chytridiomycetes和Monoblepharidomycetes，Monoblepharidomycetes有1個(gè)目Monoblepharidales，Chytridiomycetes有9個(gè)目為：Chytridiales、Spizellomycetales、Rhizophydiales、Rhizophlyctidales、Cladochytriales、Lobulomycetales、Polychytriales、Gromochytriales、Mesochytriales。

(a.真菌首先侵入龍須菜表面膠質(zhì)層，侵染處形成漏斗狀痕跡(箭頭)，b.然后菌絲通過表皮細(xì)胞間隙(箭頭)進(jìn)入到髓部細(xì)胞，并在髓部細(xì)胞產(chǎn)生孢子囊(c. 箭頭)，孢子囊產(chǎn)生大量游動孢子，整個(gè)孢子囊呈黃色(d)，孢子囊發(fā)育到一定程度后開始放散游孢子(e. 箭頭)，游孢子放散完后孢子囊顏色變淺(f)，此時(shí)龍須菜表面出現(xiàn)大量孔洞(g)，內(nèi)部細(xì)胞形狀異常甚至破裂(h. 箭頭)。Firstly, the fungi entered into the surface ofGp.lemaneiformisto form a funnel-shaped structure (a). The hypha extended through the intercellular space to reach the medullary cell layer (b). The sporangium was produced by the inner part of the hypha (c) and it developed fast through zoospores mitosis (d). Later, the zoospores were released (e) and the color of sporangium turned to pale yellow (f). Meanwhile, for the algae, there were lots of holes in the surface (g) and the inner cells turnedmorphologically abnormal and evenly died (h).)

圖4 龍須菜寄生真菌侵染過程
Fig.4 The endosymbiotic fungal infection process inGp.lemaneiformis

(a.真菌孢子囊；b.PAS染色孢子囊；c.CBB染色孢子囊；d.菌絲(箭頭)；e.PAS染色菌絲(箭頭)；f.CBB染色菌絲(箭頭)；g.孢子囊菌絲(紅色箭頭)和孢子囊(綠色箭頭)；h.Nile red染色后菌絲(紅色箭頭)和孢子囊(綠色箭頭)紫外光觀察。 a.the sporangium; b. the sporangium stained by PAS; c. the sporangium stained by CBB;d. the hypha (black arrow);e. the hypha stained by PAS. f. the hypha stained by CBB;g. the hypha (red arrow) and sporangium (green arrow) before stained by Nile red; h. the hypha (red arrow) and sporangium (green arrow) under the UV-light after stained by Nile red.)

圖5 PAS、CBB和Nile red染色孢子囊和菌絲
Fig.5 The sporangium and the hypha stained by PAS, CBB and Nile red

本研究發(fā)現(xiàn)一種龍須菜寄生真菌，利用nucSSU rDNA和nucLSU rDNA的部分序列建立的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹表明該真菌屬于壺菌門(Chytridiomycota)，壺菌綱(Chytridiomycetes)，Lobulomycetales目；利用ITS1-5.8S-ITS2序列建立的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，該真菌不歸屬于Lobulomycetales目內(nèi)任一已知屬，可能是Lobulomycetales目內(nèi)一個(gè)新的屬。關(guān)于Lobulomycetales目的分類依據(jù)和基本特征研究Simmons等(2009)已經(jīng)對其進(jìn)行了概括[28]。Lobulomycetales目包含4個(gè)屬：Lobulomyces、Clydaea、Maunachytrium、Alogomyces。Lobulomycetales目的物種存在于土壤、淡水和海洋環(huán)境中，甚至于馬糞中也有出現(xiàn)[32-35]。其中，ChytridiumpolysiphoniaeCohn是由Cohn 于1865年發(fā)現(xiàn)并命名的寄生于多管藻Polysiphoniaviolacea的真菌[36]，此后Feldmann[10]和 Sparrow[37]把該菌歸屬于壺菌目(Chytridiales)壺菌科(Chytridiaceae)，但缺乏分子系統(tǒng)進(jìn)化分析。Simmons等[28]通過rDNA序列分析和游孢子亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)Chytridiumpolysiphoniae屬于Lobulomycetales目，這是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)存在于藻類體內(nèi)的Lobulomycetales目的物種，Kupper等[35]的研究還發(fā)現(xiàn)ChytridiumpolysiphoniaeCohn寄生在褐藻中。而本實(shí)驗(yàn)研究的龍須菜共生菌則是第二個(gè)被發(fā)現(xiàn)存在于藻類體內(nèi)的Lobulomycetales目的物種，因此進(jìn)一步增加了藻類共生壺菌的認(rèn)識。

本研究通過切片染色研究真菌的化學(xué)組分，運(yùn)用PAS、CBB和Nile-red 3種方法染色發(fā)現(xiàn)，真菌富含多糖和蛋白質(zhì)，不含(或少含)脂質(zhì)。當(dāng)真菌侵染龍須菜前期孢子囊并沒有形成時(shí)，只有菌絲存在于藻體內(nèi)部，菌絲顏色淺，較難發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用這3種染色方法均可判斷藻體是否含真菌。同時(shí)，通過切片觀察初步研究了真菌侵染龍須菜的過程。發(fā)現(xiàn)真菌侵染的前期(游孢子放散前)，藻體內(nèi)部細(xì)胞和表面形態(tài)都無明顯異常，藻體生長狀態(tài)良好；真菌侵染的后期(游孢子放散后)，藻體內(nèi)部細(xì)胞肥大、褪色，藻體表面出現(xiàn)大量孔洞，嚴(yán)重時(shí)藻體出現(xiàn)斷裂。表明該真菌的侵染會導(dǎo)致龍須菜致病，該真菌對龍須菜的生長發(fā)育有害。與本研究不同的是，Nyvall等[13]研究表明Thalassochytriumgracilariopsidis對龍須菜不產(chǎn)生有害影響，而本研究分離的真菌對藻體有明顯的破壞作用，這豐富了對龍須菜寄生真菌及其影響的認(rèn)識。同時(shí)，龍須菜作為一種重要的經(jīng)濟(jì)海藻，其有害寄生真菌的發(fā)現(xiàn)將會引起學(xué)界對藻類有害菌的更多關(guān)注。過去有學(xué)者初步從生理角度研究寄生真菌對藻類的影響，Gachon等[38]通過測定Chytridiumpolysiphoniae侵染褐藻前后的葉綠素?zé)晒馇€，發(fā)現(xiàn)Chytridiumpolysiphoniae影響寄主褐藻光合作用速率。Thalassochytriumgracilariopsidis侵染龍須菜后，龍須菜體內(nèi)的α-1,4-葡聚糖裂解酶活性明顯升高[13]。而鹽度是寄生菌Olpidiumrostriferum和Coenomycessp.生長的主要影響因子，Raghukumar[12]報(bào)道Olpidiumrostriferum和Coenomycessp.在7—9月的時(shí)候生物量最大，這段時(shí)期是淡水流入海水量最大的時(shí)期。進(jìn)一步從生理和病理的角度研究有害寄生菌的侵染機(jī)理及防治措施，將會有效減少藻類栽培中由寄生真菌造成的經(jīng)濟(jì)損失，也是未來藻類寄生菌的研究方向之一。

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