小鼠肝硬化—肝癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究

孫洪利

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院膽道血管外科，沈陽 110004）

原發(fā)性肝癌是常見惡性腫瘤，由于起病隱匿，早期無癥狀或癥狀不明顯。病情進(jìn)展迅速，確診時(shí)大多數(shù)患者已經(jīng)達(dá)到局部晚期或發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，治療困難，預(yù)后很差，嚴(yán)重威脅身體健康和生命安全。由于肝癌的早期診斷對(duì)于有效治療和長期生存至關(guān)重要，因此應(yīng)十分重視肝癌的早期篩查和早期監(jiān)測(cè)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 （epithelial mesenchymal transition，EMT） 是將具有極性的上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)換成為具有移行能力的間質(zhì)細(xì)胞并獲得侵襲和遷移能力的過程，它存在于人體多個(gè)生理和病理過程中。EMT在惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用［1-2］。研究EMT的始發(fā)因素及其下游通路在腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用，阻斷這一機(jī)制的發(fā)生發(fā)展，對(duì)惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移前的早期診斷、早期治療有著非常重要的意義。本研究的目的是探索在肝癌發(fā)病過程中調(diào)節(jié)EMT過程的相關(guān)因子表達(dá)情況，通過相關(guān)因子的表達(dá)譜，對(duì)E-鈣黏蛋白、β3整聯(lián)蛋白、波形蛋白和纖維連接蛋白等的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，從分子水平判定患者的肝硬化—肝癌發(fā)病過程，從而早期發(fā)現(xiàn)肝硬化、檢測(cè)肝癌發(fā)生，早期治療，改善患者預(yù)后生存。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用雄性小鼠90只，體質(zhì)量60～90 g，購自長春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，隨機(jī)分為肝硬化組（40只） 、肝癌組 （40只） 和正常對(duì)照組 （10只） 。肝硬化組：6周齡健康雄性小鼠40只，20%四氯化碳油溶液 （四氯化碳∶橄欖油為1∶4） ，劑量為2.5 mL/kg，腹腔注射，1次/周，注射2周，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。肝癌組：在肝硬化組基礎(chǔ)上加5%乙醇飲水，10周后改為正常飲水，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)［3-4］。正常對(duì)照組：普通飲用水和標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)。

1.2 建立動(dòng)物模型

小鼠肝臟組織在誘導(dǎo)后8、10、12、14、16、18、20周開腹獲取肝組織，觀察腹水情況，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死4只小鼠。各時(shí)間點(diǎn)肝組織一部分液氮冷凍保存，一部分逐級(jí)乙醇脫水、石蠟包埋，4 μ m切片，HE染色進(jìn)行病理學(xué)檢查。

1.3 免疫組化

采用免疫組化方法，測(cè)定E-鈣黏蛋白、β3整聯(lián)蛋白、波形蛋白和纖維連接蛋白的表達(dá)水平。

1.4 HE染色及免疫組化觀察

高倍顯微鏡 （×400） 下觀察細(xì)胞著色情況，對(duì)每張切片的陽性細(xì)胞率及陽性細(xì)胞著色強(qiáng)度分別進(jìn)行分級(jí)計(jì)分，然后根據(jù)2項(xiàng)之和確定其陽性表達(dá)強(qiáng)度。每張切片任意選5個(gè)視野，觀察其細(xì)胞著色強(qiáng)度，無表達(dá)為陰性 （0分） ，陽性顆粒呈淺黃色為可疑陽性 （1分） ，淺棕色為弱陽性 （2分） ，棕黃色為陽性（3分） ，棕褐色為強(qiáng)陽性 （4分） 。計(jì)算陽性細(xì)胞率 （5個(gè)視野的平均數(shù)） ，無表達(dá)為陰性 （0分） ，1%～15%為可疑陽性 （1分） ，16%～50%為弱陽性 （2分） ，51%～85%為陽性 （3分） ，86%～100%為強(qiáng)陽性 （4分） 。計(jì)算標(biāo)本的表達(dá)強(qiáng)度指數(shù)，表達(dá)強(qiáng)度指數(shù) （%） =陽性細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)度×陽性細(xì)胞率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。分類資料率的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠肝硬化和肝癌模型的建立與鑒定

肝硬化組小鼠藥物誘導(dǎo)8周后，90%小鼠逐漸出現(xiàn)毛雜亂、無光澤，活動(dòng)差，消瘦，腹水；存活小鼠肝硬化誘導(dǎo)成功率100%，病死率30%。肝癌組小鼠藥物誘導(dǎo)14周后，85%小鼠毛色欠佳，并伴有厭食、消瘦、體質(zhì)量減輕，10%小鼠出現(xiàn)消化道出血，10%出現(xiàn)血性腹水；存活小鼠肝癌誘導(dǎo)成功率100%，病死率40%。

2.2 肝組織病理

小鼠肝硬化誘導(dǎo)過程中18周出現(xiàn)肝臟細(xì)胞變性，硬化肝臟表面顆粒結(jié)節(jié)，質(zhì)硬，鏡下肝纖維化，假小葉形成，匯管區(qū)炎癥，典型肝硬化病理表現(xiàn)。小鼠肝癌誘導(dǎo)過程中8周肝臟出現(xiàn)肝細(xì)胞變性、壞死和纖維化，肝細(xì)胞變大，18周時(shí)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，腫瘤位于肝臟多個(gè)肝葉，腫瘤灰白色，表面有腫瘤滋養(yǎng)血管；核仁異型性明顯，肝癌形成；病理性核分裂，核仁變大變紅，典型肝癌病理表現(xiàn)。見圖1。

2.3 免疫組化結(jié)果

本研究共對(duì)90只小鼠模型中的52只進(jìn)行了取材，獲得正常對(duì)照組4例、肝硬化組15例、肝癌組14例的肝組織樣本。

2.3.1 E-鈣黏蛋白的表達(dá)：E-鈣黏蛋白在正常肝組織中陽性表達(dá)，多呈棕黃色顆粒，主要定位于上皮細(xì)胞及細(xì)胞膜上，尤其是細(xì)胞與細(xì)胞交界處，少數(shù)在細(xì)胞質(zhì)中亦可著色。E-鈣黏蛋白在肝硬化及肝癌組織中呈異常表達(dá)，多數(shù)癌組織中E-鈣黏蛋白僅少量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，而在細(xì)胞膜上的染色減少或消失。肝硬化組織與肝癌組織比較，E-鈣黏蛋白染色增強(qiáng) （圖2） 。正常對(duì)照組中3例E-鈣黏蛋白陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為75.0% （3/4） ，而肝硬化組和肝癌組中分別有7例和1例E-鈣黏蛋白陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率分別為46.7% （7/15） 和7.1% （1/14） 。肝硬化組、肝癌組與正常對(duì)照組比較，E-鈣黏蛋白陽性表達(dá)率降低。肝硬化組和肝癌組比較，E-鈣黏蛋白陽性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05） 。見表1。

2.3.2 β3整聯(lián)蛋白的表達(dá)：β3整聯(lián)蛋白在正常肝組織中陽性表達(dá)，多呈棕黃色顆粒，主要定位于上皮細(xì)胞及細(xì)胞膜上。β3整聯(lián)蛋白在肝硬化及肝癌組織中呈異常表達(dá)，多數(shù)癌組織中β3整聯(lián)蛋白僅少量表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。肝硬化組織與肝癌組織比較，β3整聯(lián)蛋白染色增強(qiáng) （圖2） 。正常對(duì)照組中3例β3整聯(lián)蛋白陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為75.0% （3/4） ，而在肝硬化組和肝癌組中分別有6例和1例β3整聯(lián)蛋白陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率分別為40.0% （6/15） 和7.1% （1/14） 。肝硬化組、肝癌組與正常對(duì)照組比較，β3整聯(lián)蛋白陽性表達(dá)率降低。肝硬化組和肝癌組比較，β3整聯(lián)蛋白陽性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05） 。見表1。

圖1 3組小鼠肝臟大體組織和HE染色 ×400Fig.1 Gross observation and HE staining of liver tissues in three groups ×400

圖2 肝纖維化組和肝癌組中E-鈣黏蛋白、β3整聯(lián)蛋白、波形蛋白和纖維連接蛋表達(dá)的變化 ×400Fig.2 Comparison of the E-cadherin，β3-integrin，vimentin，and fibronectin expression patterns between the cirrhosis and liver cancer models ×400

2.3.3 波形蛋白的表達(dá)：波形蛋白染色后細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，正常肝組織的上皮結(jié)構(gòu)中一般檢測(cè)不到其表達(dá)。肝硬化組織與肝癌組織比較，波形蛋白染色減弱 （圖2） 。正常對(duì)照組中無波形蛋白陽性表達(dá)，肝硬化組和肝癌組中分別有3和6例波形蛋白陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率分別為13.6% （3/15） 和40.0%（8/14）。肝硬化組、肝癌組與正常對(duì)照組比較，波形蛋白陽性表達(dá)率增高。肝硬化組與肝癌組比較，波形蛋白陽性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05） 。見表1。

2.3.4 纖維連接蛋白的表達(dá)：纖維連接蛋白表達(dá)產(chǎn)物定位于細(xì)胞質(zhì)，部分細(xì)胞核也有著色，呈棕黃色至深褐色彌散性分布。肝硬化組織與肝癌組織比較，纖維連接蛋白染色減弱 （圖2） 。正常對(duì)照組中有1例纖維連接蛋白陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率為25.0%（1/4） ，肝硬化組和肝癌組中分別有3和8例纖維連接蛋白陽性表達(dá)，陽性表達(dá)率分別為20.0% （3/15） 和57.1% （8/14） 。肝癌組與正常對(duì)照組比較，纖維連接蛋白蛋白陽性表達(dá)率增高。肝硬化組與肝癌組比較，纖維連接蛋白陽性表達(dá)率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05） 。見表1。

表1 3組中E-鈣黏蛋白、β3整聯(lián)蛋白、波形蛋白、纖維連接蛋白的表達(dá)Tab.1 Assessment of E-cadherin，β3-integrin，vimentin，and fibronectin expression in three groups

3 討論

EMT過程中存在具有重要作用的生物分子標(biāo)志物。在肝癌形成的理論研究中，EMT過程是目前最主要的一個(gè)研究方向。通過挑選若干生物分子標(biāo)志物作為肝癌進(jìn)展過程中的監(jiān)測(cè)指標(biāo)，能夠?qū)Ω伟┑陌l(fā)生、發(fā)展及時(shí)提出警報(bào)，從而提高患者的健康意識(shí)，增大肝癌的檢出率，盡早為患者提供合適的治療手段，延長患者生命。

鈣黏蛋白是一種同親型結(jié)合、Ca2+依賴的細(xì)胞黏著糖蛋白，對(duì)胚胎發(fā)育中的細(xì)胞識(shí)別、遷移和組織分化以及成體組織器官構(gòu)成具有重要作用。研究［5-8］表明鈣黏蛋白下調(diào)與胰腺癌、胃癌、食管鱗癌、前列腺癌相關(guān)。整聯(lián)蛋白又稱整合素，整聯(lián)蛋白屬整合蛋白家族，具有聯(lián)系細(xì)胞外部作用與細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的作用。整聯(lián)蛋白下調(diào)強(qiáng)烈影響膠質(zhì)細(xì)胞遷移的速度和方向［9］。波形蛋白負(fù)責(zé)控制從溶酶體傳送由低密度脂蛋白衍生的膽固醇至酯化位點(diǎn)，它還能維持細(xì)胞的形狀、細(xì)胞質(zhì)的完整性及穩(wěn)定細(xì)胞骨架內(nèi)的相互作用。BALASUNDARAM和MENKO等［10-11］研究發(fā)現(xiàn)波形蛋白上調(diào)和人類乳腺癌EMT密切相關(guān)，并且這個(gè)過程和細(xì)胞轉(zhuǎn)移有協(xié)同作用，波形蛋白有助于人類乳腺上皮細(xì)胞遷移。HANDRA-LUCA等［12］在胰腺導(dǎo)管腺癌腫瘤上皮細(xì)胞觀察到波形蛋白表達(dá)上調(diào)。

細(xì)胞纖維連接蛋白是一種細(xì)胞外糖蛋白，在許多重要的生理過程中起著關(guān)鍵性作用，如胚胎生成、傷口愈合、止血和血栓形成。纖維連接蛋白表達(dá)的改變、降解以及組合與大量的病理發(fā)生密切相關(guān)，包括癌癥［13］。纖維連接蛋白參與體內(nèi)眾多生理作用和功能，如各種細(xì)胞間的吸附和遷移、細(xì)胞骨架組裝、酪氨酸磷酸化和腫瘤轉(zhuǎn)移等。SCHITTEN-HELM等［14］研究顯示在胃腸道癌癥、膀胱癌中，纖維連接蛋白上調(diào)表達(dá)。SHARMA等［15］研究顯示纖維連接蛋白通過細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和ρ激酶的信號(hào)刺激人類肺癌細(xì)胞增殖，抑制p21的表達(dá)。

本研究成功制備小鼠肝硬化、肝癌動(dòng)物模型，免疫組化結(jié)果顯示，小鼠肝硬化組織與肝癌組織比較，E-鈣黏蛋白、β3整聯(lián)蛋白低表達(dá)，波形蛋白、纖維連接蛋白高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜ 0.05）。進(jìn)一步說明E-鈣黏蛋白、β3整聯(lián)蛋白的低表達(dá)以及波形蛋白、纖維連接蛋白的高表達(dá)與肝硬化向肝癌轉(zhuǎn)化有關(guān)。檢測(cè)E-鈣黏蛋白、β3整聯(lián)蛋白、波形蛋白和纖維連接蛋白的表達(dá)對(duì)判斷及預(yù)測(cè)肝硬化是否轉(zhuǎn)化為肝癌有重要意義，有助于從分子水平判定患者的肝硬化—肝癌發(fā)病過程，對(duì)肝硬化患者早期發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)肝癌的發(fā)生，早期治療，提高預(yù)后生存具有重要意義。

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