離子型及Ⅰ型代謝型谷氨酸受體對大鼠溫度過敏的調(diào)節(jié)作用

謝俐萍，金幼虹，葉芳，羅玉，楊娟霞，陳霞

（南昌大學(xué)附屬口腔醫(yī)院牙周科，江西省口腔生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330006）

谷氨酸 （glutamate，Glu） 是脊椎動物主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛存在于感覺神經(jīng)末梢和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，通過激活2種位于突觸后脊髓背角神經(jīng)元及突觸前末梢傳入纖維內(nèi)的離子型和代謝型Glu受體起作用。離子型Glu受體包括N-甲基-D-天冬氨酸 （N-methyl-D-aspartic acid，NMDA） 受體、α-氨基-3羥基-5甲基-4異惡唑［ （RS） -α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid hydrobromide，AMPA］受體，它們與離子通道耦聯(lián)形成受體通道復(fù)合物，介導(dǎo)快信號傳遞；代謝型Glu受體與膜內(nèi)G-蛋白耦聯(lián)，這些受體被激活后通過G-蛋白效應(yīng)酶、腦內(nèi)第二信使等組成的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)起作用，產(chǎn)生較緩慢的生理反應(yīng)［1-2］。

本研究將離子型Glu受體作用藥Glu、NMDA、AMPA、Ⅰ型代謝型Glu受體作用藥［ （S） 3，5-dihydroxyphenylglycine， （S） -DNPG］、非競爭性NMDA受體拮抗劑［ （+） -MK801 maleate，MK-801］、競爭性AMPA受體拮抗劑 （6-cyano-7-nitroquinoxaline-2，3-dione，CNQX） 和選擇性Ⅰ型代謝型Glu受體拮抗劑 （7-hydroyiminocyclopropan［b］chromen-1a-carboxylic acid ethyl ester，cpccoEt） 分別注射入假手術(shù)和脊髓神經(jīng)結(jié)扎大鼠的左側(cè)足底皮下，觀察動物對輻射熱的反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與試劑

選取132只健康成年雄性SD大鼠，6月齡，體質(zhì)量200～300 g，由南昌大學(xué)動物科學(xué)部提供。Glu、NMDA、AMPA、 （S） -DHPG、MK801、CNQX、cpccoEt和戊巴比妥鈉均購自日本大阪Wako Pure化學(xué)公司；Hamilton syringe購自美國Reno公司；Plantar Test Model 7370購自意大利Ugo Basile公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組：132只大鼠均自由活動，自主攝取食物和水，所有實(shí)驗(yàn)步驟都被記錄并且經(jīng)過南昌大學(xué)動物保護(hù)和使用委員會同意，遵守國際組織對疼痛研究的指南［3］。將60只大鼠進(jìn)行L5～6脊神經(jīng)結(jié)扎術(shù)，隨機(jī)分成10組，分別為生理鹽水組、Glu 1.5 μ mol組、Glu 5 μ mol組、NMDA 1.5 μ mol組、NMDA 5 μ mol組、AMPA 1.5 μ mol組、 （S） -DHPG 1.5 μ mol組、MK-801 50 nmol組、CNQX 250 nmol組及cpccoEt 100 nmol組；余下的72只進(jìn)行假手術(shù)，隨機(jī)分成12組，除了上述10組，增加AMPA 5 μ mol組和 （S） -DHPG 5 μ mol組，術(shù)后第14天注射生理鹽水及上述藥物于假手術(shù)和脊神經(jīng)結(jié)扎動物足底部皮下組織中，并于15 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h和6 h行足底逃避閾值測試。

1.2.2 建立脊神經(jīng)結(jié)扎組和假手術(shù)組動物模型：手術(shù)過程參照KIM等［4］的方法。所有大鼠用戊巴比妥鈉麻醉 （40 mg/kg，腹腔注射） ，L4～S2部位皮膚下做小型切口，掀開脊柱旁的肌肉露出脊椎橫突。脊神經(jīng)結(jié)扎組大鼠去掉部分橫突暴露左側(cè)的L5和L6脊神經(jīng)，然后用6號絲線在每根神經(jīng)背根神經(jīng)節(jié)末端緊緊結(jié)扎，傷口分層縫合，假手術(shù)組大鼠除不結(jié)扎脊神經(jīng)外其余手術(shù)過程相同。藥物注射方法：將大鼠預(yù)先放在一個(gè)小盒子內(nèi)，在無麻醉的情況下，從大鼠左側(cè)后足中點(diǎn)的近心端刺入，將藥物或生理鹽水注入皮下組織。在檢測之前，大鼠至少有14 d愈合時(shí)間，術(shù)后觀察大鼠的精神狀態(tài)、進(jìn)食、飲水、傷口愈合情況和大鼠安靜時(shí)的運(yùn)動能力。

1.2.3 熱痛閾測定：觀察逃避反應(yīng)及逃避閾值的情況。逃避閾值比按下列公式計(jì)算。逃避閾值比=（ 藥物給予側(cè)的逃避閾值/對照側(cè)的逃避閾值） ×100%。參照文獻(xiàn)［5-6］方法，通過足底實(shí)驗(yàn)檢查大鼠對輻射熱的敏感性。具體方法為將動物放置于小玻璃盒子內(nèi)，可以自由活動，一束輻射熱照射于足底表面，控制輻射熱的強(qiáng)度在能夠引起逃避反射的范圍（ 1～24 s） ，且不會導(dǎo)致足底損傷。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包行單向方差分析，結(jié)果用±s表示，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 手術(shù)后2組大鼠一般行為學(xué)比較

假手術(shù)組大鼠術(shù)后行為學(xué)表現(xiàn)較術(shù)前無明顯改變，而脊神經(jīng)結(jié)扎組大鼠術(shù)后隨時(shí)間進(jìn)展逐漸出現(xiàn)術(shù)側(cè)后肢足趾并攏、足外翻以及反復(fù)舔舐術(shù)側(cè)后肢等癥狀；當(dāng)注射Glu、NMDA、AMPA和 （S） -DHPG后，假手術(shù)組大鼠出現(xiàn)反復(fù)舔舐注射側(cè)后肢的癥狀，而脊神經(jīng)結(jié)扎組大鼠無明顯改變；當(dāng)注射MK-801、CNQX和cpccoEt后，假手術(shù)組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)無明顯改變，而脊神經(jīng)結(jié)扎組大鼠反復(fù)舔舐術(shù)側(cè)后肢的癥狀消失。

2.2 手術(shù)后2組大鼠對輻射熱變化的比較

假手術(shù)組大鼠左右后足的熱逃避閾值無明顯差別，左足 （11.7±0.29 ） s，右足 （11.5±0.4 ） s，但是在脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠組，術(shù)后9～28 d，熱逃避閾值顯著下降 （P＜ 0.05） ，術(shù)后32～63 d，熱逃避閾值恢復(fù)至手術(shù)前的水平，見圖1A。術(shù)后14 d，在6 h內(nèi)的反復(fù)熱刺激中，假手術(shù)組大鼠左后足的熱逃避閾值始終保持在100%，而脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠組則保持65.1%±1.6%（P＜ 0.05） ，證明造模成功，見圖1B。

圖1 2組大鼠手術(shù)后逃避閾值的比較 （n = 6）Fig.1 Comparison of rats’ paw withdrawal latency between the two groups after the operation （n = 6）

2.3 足底注射谷氨酸后動物對輻射熱反應(yīng)變化的比較

在假手術(shù)組，與生理鹽水相比，Glu導(dǎo)致熱逃避閾值下降，最大下降值發(fā)生在注射后15～120 min （P＜0.05） ，見圖2A。在脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠組，與生理鹽水相比，無論是1.5 μ mol還是5 μ mol的Glu均沒有導(dǎo)致熱逃避閾值的繼續(xù)降低，見圖2B。

2.4 足底注射NMDA受體作用劑和拮抗劑后動物對輻射熱反應(yīng)變化的比較

圖2 2組大鼠谷氨酸注射后逃避閾值的比較 （n = 6）Fig.2 Comparison of rats’ paw withdrawal latency between the two groups treated with glutamate （n = 6）

在假手術(shù)組，與生理鹽水相比，NMDA 1.5 μ mol組和5 μ mol組均導(dǎo)致熱逃避閾值下降，最大下降值發(fā)生在注射后15～60 min，見圖3A；在脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠組，與生理鹽水相比，無論是1.5 μ mol還是5 μ mol的NMDA均沒有導(dǎo)致熱逃避閾值的繼續(xù)降低，見圖3B。在假手術(shù)組，與生理鹽水相比，MK-801 （50 nmol）熱逃避閾值沒有變化，見圖3C；在脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠組，與生理鹽水相比，MK-801 （50 nmol） 熱逃避閾值顯著增加，注射后15 min開始增加，持續(xù)時(shí)間超過6 h（P＜ 0.05） ，見圖3D。

2.5 足底注射AMPA受體作用劑和拮抗劑后動物對輻射熱反應(yīng)變化的比較

在假手術(shù)組，與生理鹽水相比，AMPA 1.5 μ mol組和5 μ mol組均導(dǎo)致熱逃避閾值下降，最大下降值發(fā)生在注射后15～180 min，見圖4A；在脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠組，與生理鹽水相比，1.5 μ mol的AMPA沒有導(dǎo)致熱逃避閾值的繼續(xù)降低，見圖4B。在假手術(shù)組，與生理鹽水相比，CNQX （250 nmol） 熱逃避閾值沒有變化，見圖4C；在脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠組，與生理鹽水相比，CNQX （250 nmol） 熱逃避閾值顯著增加，注射后15 min開始增加，持續(xù)時(shí)間超過4 h （P＜ 0.05） ，見圖4D。

圖3 2組大鼠NMDA和MK801注射后逃避閾值的比較 （n = 6）Fig.3 Comparison of rats’ paw withdraw latency between the two groups treated with NMDA and MK801 （n = 6）

2.6 足底分別注射Ⅰ型代謝性谷氨酸受體作用劑和拮抗劑后動物對輻射熱反應(yīng)變化的比較

在假手術(shù)組，與生理鹽水相比， （s） -DHPG 1.5 μ mol組和5 μ mol組均導(dǎo)致熱逃避閾值下降，從注射15 min后開始降低，持續(xù)時(shí)間超過6 h （P＜ 0.05） ，見圖5A；在脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠組，與生理鹽水相比，1.5 μ mol的 （s） -DHPG沒有導(dǎo)致熱逃避閾值的繼續(xù)降低，見圖5B。在假手術(shù)組，與生理鹽水相比，cpccoEt （100 nmol） 熱逃避閾值沒有變化，見圖5C；在脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠組，與生理鹽水相比，注射cpccoEt （100 nmol） 后的15～60 min熱逃避閾值顯著增加 （P＜ 0.05） ，見圖5D。

3 討論

Glu作為重要的神經(jīng)遞質(zhì)參與疼痛發(fā)生，外源性給予Glu可使正常動物產(chǎn)生疼痛行為，而由其誘導(dǎo)出現(xiàn)的痛覺過敏現(xiàn)象可被NMDA受體拮抗劑阻止［7］。研究［8-10］證實(shí)，許多慢性痛動物模型內(nèi)，由傷害性感受器釋放的Glu通過激活離子型Glu和與G蛋白偶聯(lián)的代謝型谷氨酸受體介導(dǎo)痛覺過敏。

圖4 2組大鼠AMPA和CNQX注射后逃避閾值的比較 （n = 6）Fig.4 Comparison of rats’ paw withdraw latency between the two groups treated with AMPA and CNQX （n = 6）

圖5 2組大鼠 （S） -DHPG和cpccoEt注射后逃避閾值的比較 （n = 6）Fig.5 Comparison of rats’ paw withdraw latency between the two groups treated with （S） -DHPG and cpccoEt （n = 6）

假手術(shù)組大鼠術(shù)后一般行為學(xué)表現(xiàn)較術(shù)前無明顯改變，而脊神經(jīng)結(jié)扎組大鼠術(shù)后隨時(shí)間進(jìn)展逐漸出現(xiàn)術(shù)側(cè)后肢足趾并攏、足外翻以及反復(fù)舔舐術(shù)側(cè)后肢等癥狀，這一研究結(jié)果與李曉倩等［11］的坐骨神經(jīng)結(jié)扎術(shù)后所觀察到的一般行為學(xué)相似。注射Glu 、NMDA 、AMPA和 （S） -DHPG后，假手術(shù)組大鼠出現(xiàn)反復(fù)舔舐注射側(cè)后肢的癥狀，說明所注射藥物引起了大鼠明顯的疼痛反應(yīng)。注射MK-801、CNQX和cpccoEt后，脊神經(jīng)結(jié)扎組大鼠反復(fù)舔舐術(shù)側(cè)后肢的癥狀消失，表明MK-801、CNQX和cpccoEt發(fā)揮了鎮(zhèn)痛作用 。

因?yàn)轶w外微滲析顯示一側(cè)坐骨神經(jīng)結(jié)扎的小鼠大腦皮質(zhì)層S1區(qū)細(xì)胞外Glu含量明顯增加［12］，坐骨神經(jīng)部分結(jié)扎模型中的大鼠腦脊液中的Glu含量持續(xù)增加［13］，所以推測本研究脊神經(jīng)結(jié)扎組大鼠神經(jīng)末梢Glu含量也會持續(xù)增加，增加的Glu激活了位于神經(jīng)末梢的Glu受體，從而導(dǎo)致熱敏感性的上升，足底注射離子型Glu受體拮抗劑 （MK-801，CNQX） 和Ⅰ型代謝型Glu拮抗劑 （cpccoEt） 后明顯抑制了脊神經(jīng)結(jié)扎組大鼠的熱敏感行為，有力地說明了外周Glu受體參與和維持了動物的神經(jīng)病理性疼痛行為。但是外源性的Glu受體作用劑Glu，NMDA，AMPA和 （s） -DHPG可以增加假手術(shù)組大鼠的溫度敏感，卻不能再次加大脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠的溫度敏感，推測可能是由于脊神經(jīng)結(jié)扎大鼠神經(jīng)末梢游離的Glu已經(jīng)與其受體達(dá)到了飽和結(jié)合狀態(tài)，沒有多余的Glu受體再與外源性的Glu作用劑相結(jié)合。

本研究的結(jié)果顯示，Glu受體作用劑Glu、NMDA、AMPA和 （s） -DHPG增加了假手術(shù)組大鼠的溫度敏感，但不能改變脊神經(jīng)結(jié)扎組大鼠的熱逃避閾值。另一方面，Glu受體拮抗劑MK-801、CNQX和cpccoEt則可以明顯抑制脊神經(jīng)結(jié)扎組大鼠的熱敏感，但對假手術(shù)組大鼠無效，表明外周Glu受體在疼痛的產(chǎn)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。

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