通心絡(luò)對高糖培養(yǎng)下心肌成纖維細(xì)胞增殖和凋亡的影響

于婷，王小梅

（錦州醫(yī)科大學(xué) 1. 研究生學(xué)院； 2. 附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科特需病房，遼寧 錦州 121001）

心肌纖維化 （myocardial fibrosis，MF） 是指心肌間質(zhì)中的心肌成纖維細(xì)胞 （cardiac fibroblasts，CFs）過度增殖和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積的病理變化。MF的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，糖尿病時體內(nèi)的高糖環(huán)境是引起MF的一個重要原因［1］。CFs是MF的主要作用細(xì)胞，在某些因素刺激下可過度增殖并分泌大量膠原蛋白，從而引起MF［2］。因此，尋找能夠抑制CFs過度增殖的藥物對治療MF的意義重大。據(jù)目前多項研究［3］表明，通心絡(luò) （tongxinluo，TXL） 在治療MF方面效果顯著。糖尿病MF大鼠經(jīng)過TXL的治療后，其心功能及心肌超微結(jié)構(gòu)得到明顯改善，心肌組織間的膠原纖維沉積顯著降低，MF得到有效控制。但TXL對CFs的影響目前國內(nèi)外少有研究。本研究旨在用高糖培養(yǎng)模擬誘發(fā)MF的病理內(nèi)環(huán)境，觀察TXL對高糖培養(yǎng)下CFs增殖和凋亡的影響，探討TXL治療MF的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1～3日齡的新生SD大鼠，雌雄不限 （錦州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供） ；TXL超微粉 （中國河北以嶺藥業(yè)提供） ，DMEM培養(yǎng)基 （美國Hyclone公司） ，胎牛血清 （美國Gibco公司） ，EDTA胰酶、MTT、DMSO（美國Sigma公司） ，鼠抗波形蛋白抗體 （中國漢博士德生物工程有限公司） ，BCA蛋白定量試劑盒 （美國Pierce公司） ，抗bax、Bcl-2、GAPDH多克隆抗體 （英國Abcom公司） ，HRP結(jié)合的二抗 （北京中杉公司） ；恒溫CO2培養(yǎng)箱 （美國Thermo Electron公司） ，離心機(jī) （德國Eppendorf 公司） ，HJ-3數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（鞏義市子華儀器有限責(zé)任公司） ，顯微鏡 （德國蔡司公司） ，酶標(biāo)儀DNM-9602G，BIO-RAD電泳槽、Gel Doc凝膠成像分析系統(tǒng) （美國Bio-Rad公司） 。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制：稱取0.1 g TXL超微粉溶于100 mL無血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，超聲促溶30 min，5 000g離心10 min，收集上清液，0.22 μ m 微孔濾器過濾除菌，將所得所有沉淀于60 ℃加熱烘干，計算實際溶于培養(yǎng)基的藥物重量，制成TXL母液，分裝后于-20℃貯存?zhèn)溆茫?］。

1.2.2 CFs的原代和傳代培養(yǎng)：取生后1～3 d的新生SD大鼠，無菌開胸取心臟，D-Hank’s液洗3次后移至小燒杯，加適量0.08%胰酶后剪成1 mm3碎塊，加入磁力攪拌子，置于恒溫 （37 ℃） 磁力攪拌器上水浴消化。第1次消化10 min，棄上清；以后每次消化8 min，吸取上清至離心管 （預(yù)加血清終止消化） ，1 000 r/min離心8 min。棄上清，留取所有離心沉淀，加入含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，150目篩網(wǎng)過濾重懸，接種于斜頸培養(yǎng)瓶后置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中差速貼壁1.5 h［5-6］。1.5 h后吸棄培養(yǎng)液 （含有未貼壁的雜質(zhì)細(xì)胞） ，更換含15%胎牛血清的新鮮培養(yǎng)液后于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，以后每2 d更換1次培養(yǎng)液，待細(xì)胞長滿后傳代培養(yǎng)。

1.2.3 CFs免疫熒光鑒別：波形蛋白正常情況下表達(dá)于成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞中，在心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中不表達(dá)，所以可根據(jù)波形蛋白表達(dá)陽性來鑒別CFs［7］。取第2代CFs接種于放有無菌蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，2 d后吸棄培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定，0.1% Triton X-100室溫封閉30 min，5%BSA室溫?fù)u床封閉30 min。加1∶200鼠抗波形蛋白抗體4 ℃過夜。加1∶200 FITC標(biāo)記的IgG二抗室溫避光孵育30 min。熒光淬滅劑封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 MTT檢測CFs的增殖活力：

1.2.4.1 高糖培養(yǎng)CFs作用時間的篩選 實驗分為低糖組和高糖組，每組取對數(shù)生長期的CFs接種于96孔培養(yǎng)板中，低糖組用低糖DMEM （葡萄糖濃度5.5 mmol/L） 分別培養(yǎng)6、12、24、48、72 h，高糖組用高糖DMEM （葡萄糖濃度25 mmol/L） 培養(yǎng)至相同時間點，每組各時間點設(shè)3個復(fù)孔，各組到達(dá)相應(yīng)處理時間點后，加入5 mg/mL的MTT 20 μ L繼續(xù)孵育，4 h后吸去培養(yǎng)液，加入100 μ L DMSO于搖床振蕩10 min，在酶標(biāo)儀490 nm波長下測定各孔吸光度 （optical density，OD） ，篩選出高糖培養(yǎng)CFs的最佳作用時間。

1.2.4.2 TXL作用于高糖培養(yǎng)CFs的增殖活力檢測按文獻(xiàn)［8］篩選出TXL最佳作用濃度，以最佳作用時間干預(yù)，分組如下：對照組 （低糖DMEM培養(yǎng)） 、模型組 （高糖DMEM培養(yǎng)） 、20 μ g/mL TXL組 （高糖DMEM+20 μ g/mLTXL培養(yǎng)） 、80 μ g/mL TXL組 （高糖DMEM+80 μ g/mLTXL培養(yǎng)） 、320 μ g/mL TXL組 （高糖DMEM+320 μ g/mLTXL培養(yǎng)） ，每組設(shè)3個復(fù)孔，MTT法檢測每組CFs相應(yīng)時間點的OD值，操作過程同上。

1.2.5 ELISA檢測各組上清中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的含量：CFs以適宜濃度接種于24孔培養(yǎng)板，低糖DMEM培養(yǎng)。待細(xì)胞長至70%～80%時，分組并更換各組相應(yīng)條件培養(yǎng)基，作用24 h后收集各組上清液，按照試劑盒說明用ELISA檢測各組上清液中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的含量。

1.2.6 Western blotting檢測bax和bcl-2蛋白的表達(dá)：各組細(xì)胞相應(yīng)條件培養(yǎng)24 h后分別于冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液，BCA法測定蛋白質(zhì)含量；取適量上清加入上樣緩沖液充分混合，煮沸10 min，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE） 。轉(zhuǎn)膜1 h，封閉1 h。一抗孵育過夜，TBS-T緩沖液洗脫3次。加入二抗于搖床上室溫孵育1 h，TBS-T緩沖液洗脫3次。ECL顯色，GAPDH為內(nèi)參，凝膠分析軟件分析各蛋白條帶的OD值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CFs的一般形態(tài)學(xué)觀察

大部分CFs培養(yǎng)1.5 h后貼壁，細(xì)胞成梭形或三角形，均勻散在分布。CFs生長迅速，約2～3 d即呈現(xiàn)融合狀態(tài)，細(xì)胞增多，胞體增大，細(xì)胞排列密集，未見細(xì)胞搏動。見圖1。

2.2 CFs的免疫熒光鑒定結(jié)果

對第2代CFs進(jìn)行波形蛋白免疫熒光染色，可見波形蛋白抗原表達(dá)呈陽性，符合實驗要求。見圖2。

2.3 高糖培養(yǎng)CFs作用時間的篩選結(jié)果

MTT測得的OD值可以反映CFs的增殖活力。組內(nèi)比較顯示，低糖組和高糖組的OD值均隨時間逐漸升高，但低糖組于48 h達(dá)峰值；而高糖組于24 h達(dá)峰值。2組間比較顯示，高糖組各時間點的OD值均高于低糖組，且以24 h最為明顯。說明高糖環(huán)境可以增強(qiáng)CFs的增殖活力，且以作用24 h時的增殖活力最強(qiáng)。見表1。

圖2 CFs免疫熒光鑒定 ×200Fig.2 CFs identification using immunofluorescence ×200

2.4 TXL作用于高糖培養(yǎng)CFs的增殖活力檢測結(jié)果

模型組OD值與對照組相比顯著升高 （P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義；TXL濃度分別為80 μ g/mL 和320 μ g/mL 的TXL處理組OD值與模型組相比均顯著下降（P均＜0.05） ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.5 ELISA檢測各組Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的含量結(jié)果

表1 低糖組和高糖組各時間點OD值 （±s）Tab.1 OD values for the low- and high-glucose groups at each time point （±s）

表1 低糖組和高糖組各時間點OD值 （±s）Tab.1 OD values for the low- and high-glucose groups at each time point （±s）

1） compared with the 6 h OD in each group，P ＜ 0.05； 2） compared with the 12 h OD in each group，P ＜ 0.05；3） compared with the 24 h OD in each group， P ＜ 0.05；4） compared with the 48 h OD in each group，P ＜ 0.05；5） compared with the 72 h OD in each group，P ＜ 0.05；6） compared with the low glucose group at the same time point， P ＜ 0.05.

Group n 6 h 12 h 24 h 48 h 72 h Low-glucose group 3 0.242 1±0.014 93），4），5） 0.289 9±0.021 03），4），5） 0.348 6±0.023 31），2），4） 0.438 5±0.021 91），2），3），5） 0.353 8±0.009 81），2），4）High-glucose group 3 0.296 1±0.023 52），3），4），6） 0.412 6±0.035 31），3），4），6） 0.616 0±0.035 11），2），4），5），6） 0.502 6±0.043 41），2），3），5），6） 0.406 8±0.056 51），3），4）

表2 各組CFs的OD值比較 （±s）Tab.2 OD values for each group （±s）

表2 各組CFs的OD值比較 （±s）Tab.2 OD values for each group （±s）

Group n OD Control group 3 0.346 4±0.023 42），3），4），5）Model group 3 0.619 9±0.020 41），4），5）20 μ g/mL TXL group 3 0.574 3±0.044 11），4），5）80 μ g/mL TXL group 3 0.509 8±0.009 31），2），3），5）320 μ g/mL TXL group 3 0.459 8±0.013 31），2），3），4）

1） compared with the control group，P＜ 0.05；2） compared with the model group，P＜ 0.05；3） compared with the 20 μ g/mL TXL group，P＜ 0.05；4）compared with the 80 μ g/mL TXL group，P＜ 0.05；5） compared with the 320 μ g/mL TXL group，P＜ 0.05.

模型組Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白含量明顯高于對照組 （P＜ 0.05） ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；而TXL濃度分別為20、80、320 μ g/mL 的TXL處理組的Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白含量與模型組相比均顯著降低（P均＜0.05） ，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

2.6 Western blotting檢測各組bax和bcl-2的表達(dá)

與對照組相比，模型組促凋亡的bax表達(dá)減少、抗凋亡的bcl-2表達(dá)顯著增加。TXL濃度分別為20、80、320 μ g/mL 的TXL處理組與模型組相比，bax的表達(dá)明顯上調(diào)、bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)。見圖3。

表3 ELISA檢測各組Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的含量 （±s）Tab.3 Collagen types I and III content in each group，detected by ELISA （±s）

表3 ELISA檢測各組Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白的含量 （±s）Tab.3 Collagen types I and III content in each group，detected by ELISA （±s）

Compared with control group，1） P ＜ 0.05；compared with model group，2） P ＜ 0.05；compared with 20 μ g/mL TXL group，3） P ＜ 0.05；compared with 80 μ g/mL TXL group，4） P ＜ 0.05；compared with 320 μ g/mL TXL group，5） P ＜ 0.05.

GroupnTypeⅠcollagen （μ g/L）Type Ⅲ collagen （ng/L）Control group 3 0.774 5±0.247 52），3），4） 184.288 2±24.668 52），3），4），5）Model group 3 6.999 0±0.429 31），3），4），5） 783.407 9±16.847 41），3），4），5）20 μ g/mL TXL group 3 3.879 5±0.388 21），2），4），5） 541.959 0±12.655 51），2），4），5）80 μ g/mL TXL group 3 2.200 3±0.357 01），2），3），5） 438.438 7±10.653 11），2），3），5）320 μ g/mL TXL group 3 1.403 3±0.412 32），3），4） 318.448 7±13.637 11），2），3），4）

3 討論

TXL是由人參、赤芍、水蛭、全蝎、土鱉蟲、蟬蛻、蜈蚣、冰片組成的復(fù)方制劑。人參皂甙可以促進(jìn)葡萄糖的有氧氧化和胰島素的釋放，還可通過減少組織內(nèi)氧自由基、保護(hù)線粒體等作用來調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白bcl-2和bax的表達(dá)［9］；赤芍、水蛭、全蝎、土鱉蟲具有抗凝、抑制血栓形成的功能；蟬蛻、蜈蚣、冰片則具有活血散瘀、通經(jīng)祛風(fēng)等功效。近年來，TXL在治療心血管疾病尤其是MF、糖尿病微血管病變等方面已取得良好成效。

圖3 Western blotting檢測各組bax和bcl-2蛋白表達(dá)水平Fig.3 Detection of bax and bcl-2 protein expression by Western blotting

鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠在TXL治療后，心臟病變有了明顯改善。心臟的重量指數(shù)明顯降低，左心室收縮壓顯著升高，左心室舒張末壓顯著降低，左心室內(nèi)壓最大上升速率和左心室內(nèi)壓最大下降速率都升高，且左心室內(nèi)壓最大下降速率比左心室內(nèi)壓最大上升速率升高明顯，表明TXL可以改善糖尿病心肌病大鼠心臟舒縮功能障礙，尤其是舒張功能［10］。TXL還能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β、基質(zhì)金屬蛋白酶9、組織金屬蛋白抑制因子1三者的平衡以及TGF-β/Smad信號通路防治糖尿病大鼠的MF［11］。

本研究是在已有的動物實驗的基礎(chǔ)上，將TXL直接作用于與MF的發(fā)展密切相關(guān)的CFs，從細(xì)胞學(xué)角度進(jìn)一步探究TXL防治MF的可能機(jī)制。CFs在某些病理因素的刺激下可過度增殖并轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞［12］，后者可分泌大量的Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白以增加心臟的僵硬度，進(jìn)而影響心臟的舒縮功能，最終導(dǎo)致MF［13］。糖尿病時體內(nèi)所形成的高糖環(huán)境是誘發(fā)MF的主要因素之一，其機(jī)制主要與氧化應(yīng)激、晚期糖基化終產(chǎn)物的積累和激活蛋白激酶C有關(guān)［14-15］。本研究以高糖培養(yǎng)CFs模擬誘發(fā)MF的病理內(nèi)環(huán)境，以低糖培養(yǎng)CFs作對照，對比觀察不同劑量TXL干預(yù)后CFs的增殖和分泌情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高糖培養(yǎng)可以誘導(dǎo)CFs增殖并增強(qiáng)其分泌Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的能力，而TXL可以抑制CFs在高糖環(huán)境中的增殖，還能減弱膠原蛋白的分泌。CFs的過度增殖也意味著其凋亡程序的減弱，因此，CFs凋亡的減少有可能也是構(gòu)成MF的重要原因。Bcl-2家族是最重要的凋亡調(diào)控基因之一，既含有抗凋亡的bcl-2，又含有促進(jìn)凋亡的bax，兩者共同調(diào)控細(xì)胞的凋亡［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，CFs在高糖環(huán)境中bcl-2表達(dá)增加、bax表達(dá)減少，凋亡減弱；而TXL具有通過降低bcl-2的表達(dá)、上調(diào)bax的表達(dá)未誘導(dǎo)CFs凋亡的作用。

目前，TXL治療MF方面的實驗研究大多以動物實驗為主，而TXL對CFs的作用國內(nèi)外實驗少有研究和報道。本研究從細(xì)胞實驗的角度證實了TXL可以通過抑制高糖環(huán)境中CFs的增殖和分泌，誘導(dǎo)CFs凋亡等途徑發(fā)揮防治MF的作用，這不僅為TXL治療MF提供了新的理論依據(jù)，更為糖尿病MF的治療提供了新的思路。

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