CaM突變體質(zhì)粒的構(gòu)建、表達(dá)純化及活性鑒定

蘇敬陽，王蓉蓉，袁媛，李松霖，朱正南，黃露婷，封瑞，邵冬雪，孫雪菲，郝麗英

（中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥物毒理學(xué)教研室，沈陽 110122）

鈣調(diào)蛋白 （calmodulin，CaM） 是體內(nèi)一種重要的Ca2+感受器和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，廣泛存在于各種真核生物細(xì)胞中［1-2］。Ca2+誘導(dǎo)激活的CaM介導(dǎo)調(diào)控多種Ca2+依賴性生理過程［3］，并參與調(diào)節(jié)心肌離子通道活性，如調(diào)節(jié)CaV1.2鈣通道、NaV1.5鈉通道、KV1.5鉀通道和蘭尼堿受體 （ryanodine receptor 2，RyR2） 等。CaM基因突變可導(dǎo)致多種嚴(yán)重心血管疾病［4-8］，并能改變基因表達(dá)［9］，如長QT綜合征 （long QT syndrome，LQTS）、兒茶酚胺介導(dǎo)的多形性室速 （catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia，CPVT）、心肌肥厚、心律失常、原發(fā)性心室纖顫等。其中LQTS是一種危害極大的心血管系統(tǒng)疾病，CaM由3個不同的基因 （CALM1，CALM2，CALM3） 編碼，其中任何1個基因發(fā)生突變都有可能導(dǎo)致LQTS［5，7-8］。LQTS是指心室肌細(xì)胞動作電位復(fù)極過程紊亂，心電圖QT間期延長，臨床表現(xiàn)為暈厥、癲癇、猝死，而心臟結(jié)構(gòu)卻無任何異常。目前，所有被發(fā)現(xiàn)的與LQTS有關(guān)的CaM突變體都能降低CaM與Ca2+的親和力，抑制CaV1.2鈣通道的鈣離子依賴性失活 （calcium dependent inactivation，CDI） 作用［5，7，10-11］。研究［6，12］表明，導(dǎo)致LQTS的CaM基因突變有D96V、 D130G、 D130V、 F142L、E141G幾個位點，其中E141G是最為重要的一個突變點，因為CaME141G是目前被研究發(fā)現(xiàn)的第一個既影響CaV1.2鈣通道又影響成年人NaV1.5鈉通道的突變體，而其他突變位點只影響心肌CaV1.2鈣通道的調(diào)節(jié)作用，并不影響成年人NaV1.5鈉通道，也不影響RyR2。因此，本研究選取CaME141G為研究對象，構(gòu)建CaME141G質(zhì)粒，并提取純化CaME141G蛋白，進(jìn)行活性鑒定，為CaM突變體與心肌CaV1.2鈣通道的相互作用研究奠定基礎(chǔ)，進(jìn)而為CaM與心血管系統(tǒng)疾病關(guān)系的進(jìn)一步探索提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-6p-3/CaM質(zhì)粒由日本鹿兒島大學(xué)KAMEy-AMA教授惠贈；pGEX-6p-3/CaME141G質(zhì)粒由武漢金開瑞生物工程有限公司定點突變及提供；氨芐西林（ ampicillin，Amp）、溶菌酶、異 丙基硫代-β-D半乳糖苷、二硫蘇糖醇（ dithiothreitol，DTT） ，甲叉雙丙烯酰胺，過硫酸銨均購自美國Sigma公司。Glutathione-Sepharose 4B beads（ GS-4B beads）、PreScission Protease購自英國GE Healthcare公司；SDS、PBS磷酸鹽緩沖液粉末均購自美國Solarbio公司；NaCl、CaCl2購自北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司；胰蛋白胨、酵母提取物購自英國OXOID公司。

1.2 方法

1.2.1 BL21感受態(tài)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：應(yīng)用42 ℃精確熱激法將CaME141G質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21感受態(tài)細(xì)胞。無菌條件下操作，取50 μ LE.coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，加入pGEX-6p-3/CaME141G質(zhì)粒40 ng，混勻后冰浴30 min。42 ℃水浴鍋熱擊45 s，然后快速轉(zhuǎn)移至冰浴中2 min。向離心管中加入500 μ L無菌1×LB培養(yǎng)基（ 不含抗生素） ，混勻后置于37 ℃水浴200 r/min振蕩培養(yǎng)l h，使細(xì)菌復(fù)蘇。根據(jù)實驗要求，3 000 r/min離心2 min后棄掉300 μ L上清，重懸細(xì)菌，取出50 μ L均勻涂在含Amp的LB固體瓊脂培養(yǎng)板上，直至液體被吸收，置于37 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h。取單克隆菌種接種于裝有3 mL含Amp（ 50 mg/mL）的 LB培養(yǎng)液的15 mL離心管中，37 ℃、120 r/min培養(yǎng)12～16 h。保留菌種（ 50%甘油200 μ L +菌液800 μ L） ，置于1.5 mL高壓滅菌EP管中，混勻并凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 GST-CaME141G融合蛋白的誘導(dǎo)及表達(dá)：取100 μ L菌種加入到裝有400 mL含50 μ g/mL Amp的LB培養(yǎng)液的錐形瓶中，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)12～16 h。當(dāng)OD600nm為0.6～1.0范圍內(nèi)時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG 400 μ L，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)。

1.2.3 CaME141G的提取純化：菌液4 000 r/min離心10 min，棄上清。用PBS重懸沉淀（ 每400 mL菌液離心后的沉淀用20 mL PBS重懸） ，加入20 mg/mL溶菌酶和1 mol/L DTT各200 μ L，混勻后冰上處理30 min，超聲破碎30 min。15 000 r/min 離心10 min，取上清置于15 mL EP 管中，與PBS預(yù)先洗過的300 μ L GS-4B beads于4 ℃孵育搖晃過夜。第二日清晨800 r/min離心，棄上清，用5 mL Tris buffer（ pH8.0） 清洗beads 3次，然后轉(zhuǎn)移至2 mL EP管中，加495 μ L Tris buffer、5 μ L Pre-Scission蛋白酶，室溫旋轉(zhuǎn)5 h，去除GST標(biāo)簽。800 r/min離心3 min，上清即是提取純化的CaME141G蛋白，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 CaME141G質(zhì)粒DNA的酶切鑒定：重組質(zhì)粒具有SalⅠ和NotⅠ 2個限制性酶切位點。質(zhì)粒DNA經(jīng)雙酶切后，行1.0%瓊脂糖電泳鑒定。

1.2.5 CaME141G分子量和純度的鑒定：將純化的CaME141G經(jīng)5×SDS loading buffer蛋白上樣緩沖液室溫處理后，進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳，檢測其相對分子量和純度。

1.2.6 CaME141G濃度的測定：參照碧云天Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，測定CaME141G的濃度。

1.2.7 CaME141G生物活性的鑒定：采用pull-down實驗檢測純化后的CaME141G的活性。取連接于GS-4B beads的GST-PreIQ融合蛋白40 μ L置于2 mL EP管中，加入0.001 mol/L CaCl23 μ L （［Ca2+］10 μ mol/L），CaME141G（終濃 度 分 別 為0.7，1.4，2.1，3.5，7.0，10.0 μ mol/L） ，用Tris buffer （pH8.0） 補至總體系300 μ L。4 ℃，孵育4 h。800 r/min，離心3 min，轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管中，Tris buffer （10 μ mol/L Ca2+） 清洗beads 2次，加入15 μ L 5×SDS loading buffer洗脫處理，取上清行15%SDSPAGE電泳，鑒定純化后的蛋白是否具有生物活性。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

質(zhì)粒pGEX-6P-3約為4 900 bp，SalⅠ和NotⅠ之間的堿基全長約為10 bp，CaME141G約為470 bp，質(zhì)粒pGEX-6P-3經(jīng)SalⅠ和NotⅠ雙酶切插入CaME141G后，重組質(zhì)粒全長約為5 360 bp。pGEX-6p-3/CaME141G重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后應(yīng)得到2個堿基片段，即1個約為4 890 bp的大分子量DNA和1個約為470 bp的小分子量DNA。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在4 890 bp和470 bp處均出現(xiàn)明顯條帶，結(jié)果與理論值相符，說明pGEX-6p-3/CaME141G融合蛋白質(zhì)粒構(gòu)建成功。見圖1。

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmids digested by restriction endonuclease

2.2 重組質(zhì)粒的DNA測序結(jié)果

DNA測序結(jié)果顯示，CaM重組質(zhì)粒是含有470 bp的 DNA片段，CaM片段中的第422個堿基由A突變?yōu)镚，所對應(yīng)的第141個氨基酸由谷氨酸E突變?yōu)楦拾彼酖，即CaME141G重組質(zhì)粒?；蛲恍员容^為100%，氨基酸同一性比較為100%，且插入方向正確，讀碼框架正確，無移碼突變，進(jìn)一步證明構(gòu)建重組質(zhì)粒成功。見圖2。

2.3 純化后蛋白的分子量和純度的鑒定

CaME141G蛋白的表觀分子量約為16 700。GSTCaME141G融合蛋白經(jīng)PreScission蛋白酶酶切后，上清即是CaME141G蛋白。將GST-CaME141G融合蛋白、酶切之后的沉淀beads、CaME141G蛋白分別進(jìn)行15%SDSPAGE電泳后，可觀察到在表觀分子量約為42 700（GST-CaME141G）、 26 000 （GST） 和16 700 （CaME141G） 處出現(xiàn)明顯條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，且lane3中其他雜蛋白較少，表明提取純化獲得純度較高的CaME141G蛋白。見圖3。

2.4 純化后蛋白的濃度測定

采用 Bradford蛋白濃度測定試劑盒方法測定提純后的蛋白濃度，計算CaME141G蛋白的濃度為1.39 mg/mL。

2.5 CaME141G蛋白活性的鑒定

用pull-down實驗檢測CaME141G的蛋白活性，在10 μ mol/L Ca2+條件下，將提純后的蛋白與PreIQ蛋白片段相互作用，15%SDS-PAGE凝膠電泳，在表觀分子量約16 700處出現(xiàn)明顯條帶，見圖4。且隨著CaME141G蛋白濃度的增加，結(jié)合量也呈遞增趨勢，見圖5。以上結(jié)果說明提取純化的CaME141G蛋白具有與鈣通道蛋白結(jié)合的能力，即具有生物活性。

3 討論

CaM通過傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)換Ca2+信號來調(diào)節(jié)幾個不同的離子通道 （鈣通道、鈉通道、鉀通道等） 活性。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高時，CaM會結(jié)合4個Ca2+，在與CaM靶蛋白相互作用的區(qū)域維持一個開放的構(gòu)象。研究發(fā)現(xiàn)，CaME141G突變體與Ca2+的親和力比野生型CaM與Ca2+的親和力降低了11倍，主要發(fā)生在CaM的C-lobe上。與之前報道［4-5，10］的其他與LQTS或者CPVT相關(guān)的CaM突變體與Ca2+的親和力降低的特性一致。表明，CaM與Ca2+結(jié)合特性發(fā)生變化是CaM突變體導(dǎo)致LQTS的病理機(jī)制的共性。

圖2 CaM及CaME141G的DNA測序結(jié)果Fig.2 DNA sequence identification of CaM and CaME141G

圖3 純化后CaME141G 蛋白的SDS-PAGE 電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of purified CaME141G

心肌CaV1.2鈣通道通過與CaM的結(jié)合作用調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，CaME141G突變體與Ca2+的親和力降低直接影響心肌CaV1.2鈣通道的CDI作用。這是由于Ca2+與CaM結(jié)合特性發(fā)生變化，會損害CaV1.2鈣通道的CDI作用。除了CaV1.2鈣通道，CaM也參與調(diào)節(jié)心肌NaV1.5鈉通道失活作用［13］。yIN等［11］研究發(fā)現(xiàn)與LQTS相關(guān)的CaM突變體 （D96V、D130G和F142L）不影響NaV1.5鈉通道作用，但后來發(fā)現(xiàn)CaMD130G會導(dǎo)致胎兒心肌NaV1.5鈉通道晚期電流增加7.5倍。他們推測這種現(xiàn)象可能是因為CaM基因突變導(dǎo)致LQTS都發(fā)生在年幼時期，所以CaMD130G僅影響胎兒的鈉離子通道。然而，接下來的研究表明，CaME141G突變體會影響成年人的心肌鈉離子通道，導(dǎo)致NaV1.5鈉通道晚期電流增加1.7倍，因此CaME141G是目前被發(fā)現(xiàn)的第1個既影響CaV1.2鈣通道又影響成年人NaV1.5鈉通道的突變體。此外，之前有報道［14］稱，導(dǎo)致CPVT的CaM突變體N98S也有激活RyR2的作用，并且可能導(dǎo)致LQTS。表明與LQTS相關(guān)的CaM突變體不影響RyR2，而與CPVT相關(guān)的CaM突變體則會擾亂RyR2的生理作用。

圖 4 CaME141G與GST-PreIQ結(jié)合的SDS-PAGE 電泳圖Fig.4 SDS-PAGE of CaME141G binding with GST-PreIQ

圖5 CaME141G與GST-PreIQ結(jié)合的濃度依賴性Fig.5 Concentration-dependent binding of CaME141G to GSTPreIQ

CaM的基因突變會導(dǎo)致多種心血管系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重威脅人類生命健康，關(guān)于CaM基因突變的研究大多是膜片鉗技術(shù)測量電流變化和臨床案例的探究，而對于導(dǎo)致這些疾病的機(jī)制還沒有明確，仍需要進(jìn)一步研究。

［1］ KURSULA P. The many structural faces of calmodulin：a multitasking molecular jackknife ［J］. Amino Acids，2014，46 （10） ：2295-2304.DOI：10.1007/s00726-014-1795-y.

［2］ HALLING DB，LIEBESKIN BJD，HALL AW，et al. Conserved properties of individual Ca2+-binding sites in calmodulin ［J］. Proc Natl Acad Sci USA，2016，113 （9） ：E1216-E1225. DOI：10.1073/pnas.1600385113.

［3］ BEN-JOHNy M，yUE DT. Calmodulin regulation （calmodulation）of voltage-gated calcium channels ［J］. J Gen Physiol，2014，143 （6） ：679-692. DOI：10.1085/jgp.201311153.

［4］ NyEGAARD M，OVERGAARD MT，SONDERGAARD MT，et al.Mutations in calmodulin cause ventricular tachycardia and sudden cardiac death ［J］. Am J Hum Genet，2012，91 （4） ：703-712. DOI：10.1016/j.ajhg.2012.08.015.

［5］ CROTTI L，JOHNSON CN，GRAF E，et al. Calmodulin mutations associated with recurrent cardiac arrest in infants ［J］. Circulation，2013，127 （9） ：1009-1017. DOI：10.1161/CIRCULATIONAHA.112.001216.

［6］ MARSMAN RF，BARC J，BEEKMAN L，et al. A mutation in CALM1 encoding calmodulin in familial idiopathic ventricular fibrillation in childhood and adolescence ［J］. J Am Coll Cardiol，2014，63 （3） ：259-266. DOI：10.1016/j.jacc.2013.07.091.

［7］ MAKITA N，yAGIHARA N，CROTTI L，et al. Novel calmodulin mutations associated with congenital arrhythmia susceptibility ［J］. Circ Cardiovasc Genet，2014，7 （4） ：466-474. DOI：10.1161/CIRCGENETICS.113.000459.

［8］ REED GJ，BOCZEK NJ，ETHERIDGE SP，et al. CALM3 mutation associated with long QT syndrome ［J］. Heart Rhythm，2015，12 （2） ：419-422. DOI：10.1016/j.hrthm.2014.10.035.

［9］ FRIEDRICH FW，BAUSERO P，SUN y，et al. A new polymorphism in human calmodulinⅢgene promoter is a potential modifier gene for familial hypertrophic cardiomyopathy ［J］. Eur Heart J，2009，30 （13） ：1648-1655. DOI：10.1093/eurheartj/ehp153.

［10］ LIMPITIKUL WB，DICK IE，JOSHI-MUKHERJEE R，et al. Calmodulin mutations associated with long QT syndrome prevent inactivation of cardiac L-type Ca （2+） currents and promote proarrhythmic behavior in ventricular myocytes ［J］. J Mol Cell Cardiol，2014，74：115-124. DOI：10.1016/j.yjmcc.2014.04.022.

［11］ yIN G，HASSAN F，HAROUN AR，et al. Arrhythmogenic calmodulin mutations disrupt intracellular cardiomyocyte Ca2+ regulation by distinct mechanisms ［J］. J Am Heart Assoc，2014，3 （3） ：e000996.DOI：10.1161/JAHA.114.000996.

［12］ BOCZEK NJ，GOMEZ-HURTADO N，yE D，et al. Spectrum and prevalence of CALM1-，CALM2-，and CALM3-encoded calmodulin variants in long QT syndrome and functional characterization of a novel long QT syndrome-associated calmodulin missense variant，E141G ［J］. Circ Cardiovasc Genet，2016，9 （2） ：136-146. DOI：10.1161/CIRCGENETICS.115.001323.

［13］ GEORGE AL JR. Inherited disorders of voltage-gated sodium channels ［J］. J Clin Invest，2005，115 （8） ：1990-1999. DOI：10.1172/JCI25505.

［14］ HWANG HS，NITU FR，yANG y，et al. Divergent regulation of ryanodine receptor 2 calcium release channels by arrhythmogenic human calmodulin missense mutants ［J］. Circ Res，2014，114 （7） ：1114-1124. DOI：10.1161/CIRCRESAHA.114.303391.