秋水仙素對金達苜蓿染色體加倍效果的影響

吉仁花，于林清，白淑蘭

(1內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學 林學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010019；2中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

金達苜蓿(MedicagosativaL.cv.Jinda)是由來自伊朗、伊拉克、西班牙和高加索地區(qū)的大量育種材料選育而成的一個新品種，其枝條匍匐生長,分枝密集,抗寒能力強，葉片、花和種子均比一般紫花苜蓿小, 是唯一一種草坪型紫花苜蓿，在我國西北、華北、東北、華東地區(qū)均可種植，用于公路護坡、果園綠化、葡萄園美化以及廣場綠地。

金達苜蓿染色體加倍育種的主要目的是獲得四倍體的純合體，研究不同倍性苜蓿的遺傳特性，在不同倍性間實現(xiàn)基因的流動。紫花苜蓿是天然同源四倍體，雖然其純合個體不表現(xiàn)出優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，但不同種質(zhì)間的雜交表現(xiàn)出較好的雜交優(yōu)勢, 且其雜種優(yōu)勢隨親本遺傳差異的增大而增加[1]。所以將金達苜蓿純合個體應用于雜交育種, 可以最大限度地提高紫花苜蓿的雜合性, 從而增強其抗性，提高產(chǎn)草量，培育出優(yōu)良品質(zhì)的苜蓿品種。

隨著生物技術的迅速發(fā)展，利用秋水仙素人工誘導多倍體的報道較多[2-6]。采用浸種法，利用秋水仙素誘導直立型扁蓿豆、扁蓿豆新品系90-36、清水苜蓿均獲得了多倍體植株[7-9]。但苜蓿離體狀態(tài)下秋水仙素誘導染色體加倍的研究尚較欠缺[10]。本試驗以金達苜蓿種子為材料, 利用秋水仙素結(jié)合組織培養(yǎng)，以獲得金達苜蓿四倍體的純合體，為不同倍性苜蓿的遺傳特性研究及不同倍性間實現(xiàn)基因的流動奠定基礎， 也為苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化研究提供堅實的科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

金達苜蓿種子由中國農(nóng)業(yè)科學院草原研究所育種實驗室提供，經(jīng)鑒定均為二倍體(2n=16)。

1.2 培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件

1.2.1 培養(yǎng)基配方 愈傷組織誘導培養(yǎng)基：SH(Schenk and Hildebrandt medium)+30 g/L蔗糖+7 g/L瓊脂+0.5 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L 6-BA；愈傷組織分化培養(yǎng)基：MSO(MS大量、微量元素、鐵鹽+B5有機)+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂；生根培養(yǎng)基：1/2MS+30 g/L蔗糖+7.5 g/L瓊脂。滅菌前先將各培養(yǎng)基的 pH 值調(diào)至 5.8，121 ℃高壓滅菌 20 min。

1.2.2 培養(yǎng)條件 光周期為16 h/d,光照強度12 500～50 000 μmol/(m2·s)，晝夜溫度24 ℃/18 ℃。

1.3 離體組織染色體加倍試驗方法

1.3.1 種子消毒及無菌苗的培養(yǎng) 選取飽滿的成熟金達苜蓿種子，用砂紙打磨后置于盛有體積分數(shù)70%酒精的三角瓶中消毒45 s,用無菌水沖洗4次，放入2%次氯酸鈉溶液浸泡30 min,不斷搖動三角瓶以充分消毒滅菌，然后置于超凈工作臺內(nèi)，在超凈工作臺倒掉消毒液,用無菌水沖洗5次,最后用滅菌的濾紙吸干種子表面的液體，接種到生根培養(yǎng)基上。

1.3.2 外植體的準備 采用孔舒穎[8]的方法,將生長6～8 d的無菌苗置于已滅菌的濾紙上，用小刀切取幼嫩的子葉,切成3～4 mm的小方塊。將這些小方塊作為外植體分別接種在含0.02，0.07，0.12 mg/mL秋水仙素溶液的愈傷組織誘導培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以接種不添加秋水仙素的相同培養(yǎng)基為對照。每個處理接種6個培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿接種10個外植體，3次重復。

1.3.3 愈傷組織的誘導 將經(jīng)過不同時間(1，3，7 d)培養(yǎng)的外植體接入不添加秋水仙素的同一培養(yǎng)基繼續(xù)誘導，60 d后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，觀察記錄生長狀態(tài)并統(tǒng)計愈傷組織數(shù)，計算愈傷組織誘導率。

1.3.4 誘導愈傷組織分化 將誘導出的正常愈傷組織接入分化培養(yǎng)基中進行誘導，15 d后根據(jù)愈傷組織塊的大小將愈傷組織再切塊進行繼代培養(yǎng)，期間根據(jù)愈傷分化情況多次繼代，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計胚狀體的分化率。

1.3.5 生根培養(yǎng) 將誘導分化出芽的愈傷組織分別轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中,15 d換1次培養(yǎng)基,繼續(xù)生根。誘導生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后即可出現(xiàn)根的突起,35 d左右即可長出短根,以后逐漸形成正常根，直到50 d統(tǒng)計其成苗率。

1.3.6 煉苗與移栽 誘導分化出的再生無菌苗根系充分發(fā)達，在誘導生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)的第55～60天可以煉苗。先在培養(yǎng)箱內(nèi)將三角瓶口打開，2 d后置于光照下培養(yǎng)。在此過程中逐漸通風、增加光照，5 d后從三角瓶中取出幼苗，將根系上的培養(yǎng)基沖洗干凈，再移栽到裝有1/3培養(yǎng)基質(zhì)(m(蛭石)∶m(土)為1∶1)的100 mL塑料小杯中，用保鮮膜保濕，以提高再生植株移栽成活率。因移栽后的幼苗生長發(fā)育需要大量營養(yǎng)，僅靠基質(zhì)中的養(yǎng)分不能滿足幼苗生長的需要，因此必須用人工方法在基質(zhì)中添加完全營養(yǎng)液20 mL/杯，補充幼苗生長所需礦質(zhì)營養(yǎng)，以保證再生小植株生長良好。當幼苗長到50 cm大小移入大花盆內(nèi)，統(tǒng)計移栽成活率。

1.3.7 再生植株的倍性鑒定 形態(tài)學鑒定：觀察秋水仙素處理金達苜蓿幼苗的地徑、葉片形態(tài)和葉色等外部形態(tài)特征,篩選出莖粗、葉片寬且肥厚、葉色濃綠、葉表粗糙的處理幼苗初步鑒定為加倍成功植株。

根尖細胞染色體觀察：移栽幼苗開始分蘗時，取出整個植株，將根系洗凈。從根系中取出新鮮、光滑、白色透明的長度約1.5 cm的根尖，放入8-羥基喹啉中預處理3 h,然后用卡諾固定液(V(體積分數(shù)95%乙醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)固定24 h，1 mol/L HCl解離4 min后，用石炭酸-品紅溶液染色2 h,壓片、鏡檢，觀察染色體，選取分散相好的壓片用Olympus顯微攝影儀照相。每種處理下的加倍再生植株幼苗各取5枚根尖進行壓片觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋水仙素對金達苜蓿愈傷組織形態(tài)特征及生長的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，金達苜蓿外植體誘導的愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)受材料本身和秋水仙素的影響。經(jīng)秋水仙素處理后的愈傷組織生長緩慢，易褐化，且呈不規(guī)則膨大，隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的升高、處理時間的遞增，愈傷組織生長更緩慢，褐化也加重，該類型的愈傷組織在后期長勢也非常弱。根據(jù)本研究情況，秋水仙素處理的愈傷組織形態(tài)結(jié)構(gòu)大致可以分為4大類型：Ⅰ類型為深綠色，結(jié)構(gòu)堅硬，生長緩慢；Ⅱ類型為亮黃色，內(nèi)外有很多綠色顆粒，結(jié)構(gòu)松軟，黏稠狀，生長較快；Ⅲ類型為乳白色或黃色，糨糊狀，無顆粒結(jié)構(gòu)，生長較慢；Ⅳ類型為褐色，結(jié)構(gòu)致密，生長緩慢(圖1)。

對照的外植體誘導出的愈傷組織多數(shù)為類型Ⅱ，生長到后期時還出現(xiàn)較少比例的類型Ⅰ和類型Ⅳ。經(jīng)不同質(zhì)量濃度秋水仙素處理不同時間的愈傷組織中少部分為類型Ⅱ，多數(shù)為類型Ⅲ和Ⅰ，而且在愈傷組織分化時類型Ⅳ占有較大比例。4種類型的愈傷組織中Ⅱ類型的愈傷組織先在葉片邊緣切口處形成淺綠色顆粒狀的愈傷組織，之后逐步擴展到整個切口及全葉，培養(yǎng)到35 d左右，愈傷組織呈亮黃色，直徑可達1.3 cm，多數(shù)為生長狀態(tài)良好、健康的愈傷組織，比其他3種類型的愈傷組織較少出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，為繼代增殖和分化培養(yǎng)的最佳愈傷組織。Ⅲ類型的愈傷組織剛形成時為黃綠色，在后期生長較慢，多數(shù)為黏性，含水率高且個別出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，可再增殖和分化的利用率比Ⅱ類型的愈傷組織低。Ⅱ類型及Ⅲ類型的愈傷組織均能在MSO培養(yǎng)基內(nèi)分化出綠色的芽點,但Ⅲ類型的愈傷組織分化時間較長,其愈傷組織在分化培養(yǎng)基MSO中連續(xù)繼代14次仍未分化產(chǎn)生綠色芽點。Ⅰ類型的愈傷組織也可以連續(xù)繼代培養(yǎng)，但隨著繼代次數(shù)的增加愈傷組織呈不規(guī)則膨大，最終無胚狀體和分化苗的產(chǎn)生；Ⅳ類型的愈傷組織生長后期多數(shù)出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，喪失分化能力。

2.2 秋水仙素對金達苜蓿愈傷組織誘變效果的影響

當采用誘變劑處理植物細胞時,誘變劑的質(zhì)量濃度和處理時間2個因素都會很大程度地影響加倍效果, 因此為獲得較高的誘導率又保持較高的成活率，選擇適當?shù)恼T變劑質(zhì)量濃度和處理時間組合十分重要[11]。從表1可以看出，秋水仙素質(zhì)量濃度及處理時間對金達苜蓿愈傷組織的形成影響較大,隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的升高和處理時間的遞增,愈傷組織的形成受抑制程度明顯加大。當秋水仙素質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL、處理時間為7 d時僅有39.5%的愈傷組織能保持正常生長；而當秋水仙素質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL、處理時間為1 d時，愈傷化程度最高，愈傷組織誘導率為63.5%。多種處理條件下的多數(shù)愈傷組織雖被轉(zhuǎn)入不含秋水仙素的培養(yǎng)基中,但隨著生長時間的延長呈不規(guī)則膨大或者慢慢褐化，最后失去生活力。

本研究參考Saunders等[12]的方法,選擇誘導愈傷組織分化培養(yǎng)基為不添加任何激素的MSO培養(yǎng)基。將誘導出的亮黃色、松軟、較大的愈傷組織轉(zhuǎn)入MSO培養(yǎng)基中進行誘導分化培養(yǎng)。分化結(jié)果可分為兩大類型：① 秋水仙素各處理組合的少數(shù)愈傷組織在MSO培養(yǎng)基內(nèi)繼續(xù)生長一段時間后分化形成綠色芽點。此類型的分化愈傷組織在生長后期利于生根，為最佳分化愈傷組織。② 秋水仙素各處理組合的絕大多數(shù)愈傷組織在MSO培養(yǎng)基內(nèi)表面呈白色毛狀根，布滿白色粉末狀物或變黃，最終無綠色芽點的分化(圖2)。從表1可以看出,隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的升高和處理時間的延長，金達苜蓿愈傷組織分化率表現(xiàn)為逐步降低的趨勢。秋水仙素質(zhì)量濃度為0.12 mg/mL、處理時間為7 d時，愈傷組織分化率僅達到14.71%；秋水仙素質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL、處理時間為1 d時，愈傷組織分化率為最高，達到39.17%。

A.類型Ⅰ;B.類型Ⅱ;C.類型Ⅲ;D.類型Ⅳ A.TypeⅠ;B.TypeⅡ;C.TypeⅢ;D.TypeⅣ圖1 秋水仙素處理后的金達苜蓿愈傷組織類型Fig.1 Callus types of Medicago sativa L.cv.Jinda after colchicine treatment

秋水仙素質(zhì)量濃度/(mg·mL-1)Colchicinequalityconcentration處理時間/dTreatmenttime愈傷組織誘導率/%Callusinductionrate愈傷組織分化率/%Callusregenerationfrequency成苗率/%Regenerationrate0.02163.539.1717.50.07162.028.2125.00.12158.028.7119.00.02361.532.2012.90.07360.533.6324.10.12349.523.336.70.02757.528.048.70.07754.518.1737.50.12739.514.7111.1CK79.054.2846.7

A～B.秋水仙素處理后的愈傷組織分化形成綠色芽點；C～D.秋水仙素處理后的愈傷組織表面呈白色毛狀根，布滿白色粉末狀物或變黃，最終無綠色芽點的分化A-B.Callus differentiation after colchicine treatment forms green buds;C-D.Colchicine treatment of callus surface white hairy roots, covered with white powder or yellowing,and ultimately no differentiation of green buds

觀察發(fā)現(xiàn)，由于秋水仙素的影響，最終僅有極少數(shù)帶有綠色芽點的愈傷組織能夠繼續(xù)生長,且生長緩慢。在誘導生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后出現(xiàn)根的突起，35 d左右可長出短根,以后逐漸形成正常根(圖3)。從表1可以看出，經(jīng)秋水仙素處理的愈傷組織，其再生苗的形成受到不同程度的影響，表現(xiàn)為當秋水仙素質(zhì)量濃度為0.07 mg/mL、處理時間分別為1，3，7 d時成苗率為25.0%，24.1%，37.5%。

A．在誘導生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后出現(xiàn)根的突起，35 d左右可長出短根；B．在誘導生根培養(yǎng)基上逐漸形成正常根A.In the induction of rooting medium for 20 days root protrusions appears and for about 35 d short roots grow out;B.In the induction of rooting medium a normal root gradually forms圖3 秋水仙素處理金達苜蓿愈傷組織分化成苗結(jié)果Fig.3 Effect of colchicine on plant regeneration from Medicago sativa L.cv.Jinda callus

2.3 秋水仙素處理金達苜蓿變異株的倍性鑒定

無論采用何種方法誘導多倍體產(chǎn)生，并不是所有被處理的組織、器官或細胞都能成為2倍于原來的染色體，有的細胞染色體可能未加倍，有的可能重復加倍，形成的一般是混倍體或嵌合體。所以采用形態(tài)鑒定和細胞鑒定相結(jié)合的方法進行倍性鑒定，以篩選出真正的多倍體植株。

形態(tài)學鑒定：一般認為,植物營養(yǎng)器官性狀的變化與基因劑量有關,即隨著基因拷貝數(shù)的增加,基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物量發(fā)生變化,性狀發(fā)生相應變化[13]。經(jīng)秋水仙素誘導處理的金達苜蓿愈傷組織分化總體表現(xiàn)為，植株明顯較對照高大,分枝數(shù)較多,葉片肥厚且變大,葉片表面粗糙,莖間變長,幼根尖端膨大、幼苗生長緩慢、匍匐性變?nèi)?圖4)。根據(jù)這些表型性狀初步鑒定出變異植株。

A.植株：左邊是二倍體植株，右邊是變異植株；B.葉片：左邊是二倍體植株葉片，右邊是變異植株葉片A.Plants:The left is diploid plants,the right is the variation plants;B.Leaves:Leaves on the left side of the diploid plants,the right is the leaves of the variation plants

根尖染色體的觀察：經(jīng)形態(tài)特征鑒定后挑選出的再生植株進行細胞染色體數(shù)目檢測。檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過離體組織細胞染色體加倍方法獲得的變異植株為四倍體與二倍體的混倍體，即根尖細胞中2n=16、2n=32共存。在對照再生植株移栽幼苗根尖的倍性觀察中均未發(fā)現(xiàn)有四倍體(2n=32)的植株(圖5)。

A．二倍體植株根尖細胞染色體；B．混倍體植株根尖細胞染色體A.Chromosomes of root tip cells with diploid plant;B.Chromosomes of root tip cells with mixoploid plant

3 討 論

3.1 加倍植株染色體的混倍性

經(jīng)秋水仙素處理的愈傷組織單細胞分化芽點再生長成幼苗,理論上所誘導形成的再生植株為四倍體的純合體，從而可避免混倍體的出現(xiàn)[14]。本研究通過秋水仙素處理獲得金達苜蓿加倍植株為二倍體與四倍體的混倍體。前人用秋水仙素處理鴨茅、杉木、朝鮮百合和唇形科青蘭屬植物Dracocephalumkotschyi種子或愈傷組織，獲得的也均為二倍體和四倍體的混倍體植株[15-18]，說明在秋水仙素誘導多倍體加倍過程中只是部分細胞得到了加倍。這可能是由于本研究以金達苜蓿葉片為載體，秋水仙素處理愈傷組織的同時不可避免地對葉片也進行了處理，所獲得的再生幼苗有可能是從金達苜蓿葉片直接發(fā)育出來的，即誘導獲得的多倍體再生植株是混倍體。另外，秋水仙素混培法獲得的少量幼苗生長緩慢，隨著再生幼苗的生長發(fā)育，混倍體中多倍體細胞所占比例越來越小，甚至在生長后期一部分含較多多倍體細胞的混倍體恢復成了二倍體[11]，這可能是造成加倍結(jié)果不易獲得純合體，而大量得到混倍體的主要原因。在植株多倍體育種實踐中，還需要在混倍體植株間授粉，經(jīng)過幾代選擇、鑒定，才能獲得真正純合的四倍體株系[19-21]。

3.2 誘導幼苗的移栽成活率

經(jīng)秋水仙素處理獲得的幼苗往往移栽成活率很低，可能是以下3方面因素造成的：首先，大部分再生植株由于根部畸形無法從土壤吸收生長所需的營養(yǎng)，從而停滯生長未能成苗而導致最終死亡[22]。其次，秋水仙素是一種有毒物質(zhì)，再生植株受其毒害作用，不能正常生長發(fā)育。最后，本研究采用的是離體組織染色體加倍技術，處理后的材料進行煉苗、移植，在此過程中誘導幼苗不適應新的培養(yǎng)環(huán)境、移栽操作不恰當?shù)拳h(huán)境和人為因素的影響，損失一部分。提高誘導幼苗的移栽成活率可考慮用更高效、更安全、毒性較低的除草劑取代秋水仙素。

3.3 秋水仙素質(zhì)量濃度與處理時間對愈傷組織誘變的影響

不同材料對秋水仙素的耐受力、敏感度不同。對同一種材料而言，隨秋水仙素質(zhì)量濃度的增大染色體加倍率也會提高[23]。但秋水仙素對細胞的毒害作用也加大，因此秋水仙素質(zhì)量濃度和效果之間并不成正比[24]。本研究中，不同處理組合對金達苜蓿愈傷組織誘導效果差異明顯，隨著秋水仙素質(zhì)量濃度和處理時間的遞增，秋水仙素對愈傷組織的毒害作用加大，愈傷組織產(chǎn)生遲、生長慢，表現(xiàn)明顯的生長抑制現(xiàn)象，從而誘導出形態(tài)結(jié)構(gòu)不同類型的愈傷組織，而且愈傷組織的生長狀態(tài)直接影響其分化出芽。原因可能是，結(jié)構(gòu)致密、硬團狀的愈傷組織，通氣、透水、透光性較差，其生長以及分化受到抑制；而內(nèi)外有很多綠色顆粒、結(jié)構(gòu)松軟、黏稠狀的愈傷組織，通光、透水及透氣性較強，有利于分化形成多個芽點，誘導形成叢生芽的幾率較大。Mori等[25]對二倍體小星辰花(Limoniumbellidifolium)加倍，用0.05%秋水仙素處理72 h時，最高頻率的四倍體和混倍體發(fā)生。

秋水仙素質(zhì)量濃度及處理時間是直接影響處理效果的2個因素[9]。用秋水仙素水溶液處理外植體時，有關質(zhì)量濃度和處理時間的組合問題研究結(jié)論不一。李潔等[26]研究結(jié)果顯示，用0.1%秋水仙素和1%助滲劑DMSO誘導直立型扁蓿豆染色體加倍效果較好。張穎[27]研究結(jié)果顯示，0.03%秋水仙素處理72 h誘導羊草與灰色賴草雜種 F1染色體加倍效果較好。本研究結(jié)果顯示，采用0.07 mg/mL的秋水仙素處理3 d染色體加倍效果較好。本研究結(jié)果與上述2種結(jié)果不同的原因可能是，利用秋水仙素誘導金達苜蓿染色體加倍與秋水仙素質(zhì)量濃度和處理時間不呈正比關系；秋水仙素質(zhì)量濃度過低，處理時間越短，不能產(chǎn)生染色體加倍效應；濃度過高，處理時間越長，則對外植體有毒害作用，從而抑制植物材料的生長甚至死亡。另外，經(jīng)秋水仙素處理后的金達苜蓿愈傷組織，難免受到誘變方法、基因型以及處理溫度等因素的影響，其中任何一項因素的改變，都可能會影響染色體加倍效果。

4 結(jié) 論

利用秋水仙素染色體加倍研究表明，隨著秋水仙素質(zhì)量濃度的升高、處理時間的延長毒害作用隨之增強，0.07 mg/mL秋水仙素處理3 d是獲得多倍體變異苗的最佳條件，愈傷組織的誘導率達到60.5%，愈傷組織分化率為33.63%，誘變幼苗成苗率為24.1%，并且誘導產(chǎn)生混倍體植株，要獲得純合的金達苜蓿四倍體植株，還需進一步深入研究。

志謝：本研究得到了白淑蘭教授、于林清研究員的指導，在此表示感謝。

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