不同種群青楊鎘富集能力的變異特征研究

魏 童，胡希智，黃 雄，何汶椿，張 麗，朱 鵬

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 生態(tài)林業(yè)研究所，四川省林業(yè)生態(tài)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130)

隨著工業(yè)化和城市化的快速發(fā)展，土壤重金屬污染已經(jīng)成為當(dāng)今世界一個(gè)十分嚴(yán)峻的環(huán)境問題。重金屬可以長(zhǎng)期滯留在土壤中，通過土壤-作物系統(tǒng)進(jìn)入人類食物鏈，從而給人類和動(dòng)物的健康帶來巨大的風(fēng)險(xiǎn)[1-3]。鎘(Cd)是土壤重金屬污染中最為危險(xiǎn)的元素之一，其會(huì)給腎臟、骨骼系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)等帶來毒害甚至產(chǎn)生致癌效應(yīng)，世界衛(wèi)生組織和國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)都將其列為須重點(diǎn)研究的食品污染物和人類致癌物[4-5]。近年來，利用超富集植物清除土壤中重金屬的植物修復(fù)(Phytoremediation)技術(shù)，以其成本低廉、生態(tài)友好和清潔等優(yōu)點(diǎn)得到了廣泛關(guān)注和深入研究[2,6]，已有超過400 種植物被鑒定為具有重金屬高富集能力的超富集植物[7-8]，其中天藍(lán)遏藍(lán)菜(Thlaspicaerulescens)[9]、Arabidopsishalleri[10-11]、Thlaspipraecox[12]、圓錐南芥(Arabispaniculata)[13]、Salsolakali[14]、寶山堇菜(Violabaoshanensis)[15]、東南景天(Sedumalfredii)[16]、美國(guó)商陸(Phytolaccaamericana)[17]等8個(gè)物種或其部分種群被發(fā)現(xiàn)是屬于鎘的超富集植物[18]。然而，這些超富集植物大多為生長(zhǎng)緩慢、根系淺、生物量低的草本植物，其生物特征并不十分符合植物修復(fù)理想物種的標(biāo)準(zhǔn)[4,8,19-20]。

鑒于草本超富集植物的生物特性所帶來的局限，許多研究者將目光投向生物體量巨大、根系發(fā)達(dá)的木本植物，尤其是一些生長(zhǎng)迅速的速生木本植物，如楊樹。許多研究發(fā)現(xiàn)，楊樹可以滿足超富集植物的4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)：即植物體內(nèi)尤其是地上部分重金屬含量達(dá)到某一特定水平(鎘大于100 mg/kg)、生物富集系數(shù)大于1、根到地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)大于1、無顯著毒害效應(yīng)[18,21]。Gu等[22]和Zacchini等[23]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)達(dá)到一定鎘處理濃度時(shí)，多個(gè)楊樹無性系的根和地上部分器官都可以達(dá)到100 mg/kg鎘含量的標(biāo)準(zhǔn)，且根中的鎘含量遠(yuǎn)大于地上部分器官，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)在0.3以下。歐美雜交楊(Populusdeltoids×Populusnigra)在較低鎘濃度處理下植株體內(nèi)富集的鎘含量較低，但其轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)和受毒害效應(yīng)(即耐受能力)都達(dá)到或接近了超富集植物的標(biāo)準(zhǔn)[21]。He等[24]在比較6 種楊樹的鎘耐受和富集能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，在200 mol/L高濃度鎘處理下，只有青楊(P.cathayana)根和葉中的鎘含量達(dá)到了100 mg/kg，且轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)在6種楊樹中最大，雖然其值較小，但仍可以認(rèn)為一些楊樹存在一定程度的鎘高富集能力。加上楊樹生長(zhǎng)快速、生物量巨大、根系發(fā)達(dá)等生物特征，以及收獲后容易利用處理等特性，因而具有成為土壤鎘污染植物修復(fù)良好候選物種的潛力。

植物對(duì)重金屬的(超)富集能力在整個(gè)物種水平并不同，研究發(fā)現(xiàn)，超富集模式植物A.halleri的整個(gè)物種雖都具有超富集鋅(Zn)和鎘的能力，但鎘的富集能力在種群間和種群內(nèi)家系間存在很大變異[10,18]。另一種超富集模式植物天藍(lán)遏藍(lán)菜(T.caerulescens)僅對(duì)鋅表現(xiàn)出整個(gè)物種水平的超富集能力，但只有部分種群對(duì)鎘和鎳(Ni)表現(xiàn)出超富集能力[11,18]。Zacchini等[23]在對(duì)多個(gè)楊樹無性系的研究中也發(fā)現(xiàn)，鎘富集能力在物種內(nèi)無性系間存在較大的遺傳差異，如加楊(Populus×canadensisM?nch)、黑楊(Populusnigra)和銀白楊(Populusalba)3種楊樹，其種內(nèi)葉富集鎘含量最大的無性系是最小無性系的2～3倍。掌握物種內(nèi)重金屬富集能力的遺傳變異特征，篩選具有更高重金屬富集能力的無性系或基因型，可以更有效地開展土壤重金屬污染的植物修復(fù)，但目前關(guān)于楊樹種內(nèi)重金屬富集能力變異的研究?jī)H局限在少數(shù)無性系水平，還缺乏基于種群水平的無性系之間的變異情況研究?；诖?，本研究以采自四川省甘孜州康定老榆林村(YL)、阿壩州日隆鎮(zhèn)(RL)、阿壩州牦牛溝(MN)的3個(gè)自然野生青楊種群為材料，通過鎘處理下的扦插盆栽試驗(yàn)，探討鎘脅迫下不同青楊種群鎘富集能力上的變異特征，以期為利用青楊進(jìn)行重金屬土壤修復(fù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

青楊(P.cathayana)，屬楊柳科(Salicaceae)楊屬(Populus)青楊組(Sect.Tacamahaca)，產(chǎn)于華北、西北和遼寧、四川等省區(qū)，自然分布于海拔800～3 000 m溝谷、河岸和陰坡山麓[25]。本試驗(yàn)所用的青楊插條采自四川省甘孜州康定老榆林村(YL)、阿壩州日隆鎮(zhèn)(RL)、阿壩州牦牛溝(MN)等3個(gè)地方的自然野生青楊(圖1)，采集單株分別為13，9和13株。2015年3月在每株青楊上剪取若干1～2年生的萌生枝條，帶回四川農(nóng)業(yè)大學(xué)成都校區(qū)進(jìn)行盆栽扦插試驗(yàn)。試驗(yàn)地屬亞熱帶濕潤(rùn)氣候區(qū)，年均溫15.8 ℃，年平均相對(duì)濕度83%，冬春少雨，夏季多雨，年均降水量約1 124.6 mm，年降水天數(shù)約300 d[26]。

圖1 青楊插條采集點(diǎn)的地理位置示意Fig.1 Sampling locations of P.cathayana cuttings

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將青楊枝條剪成長(zhǎng)約10 cm的插段，挑選粗細(xì)一致的插段進(jìn)行消毒，浸泡生根粉過夜后進(jìn)行扦插。設(shè)置空白對(duì)照(CK)和5 mg/kg(L)、10 mg/kg(H)兩個(gè)鎘含量處理，每處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)扦插1個(gè)插段。盆栽土壤取自校區(qū)外的成都平原沖積土壤，土壤去除石礫后與蛭石、腐殖土按3∶1∶1的質(zhì)量比混合，自然風(fēng)干后，過2 mm篩。稱取8 kg風(fēng)干土，將CdCl2·2.5H2O溶液噴灑于土中，充分?jǐn)嚢杌靹蚝笱b入25 cm×30 cm的容器袋備用。扦插試驗(yàn)于2015年3月初進(jìn)行，扦插后進(jìn)行雜草、病蟲和水分的定期管理。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定 2015年9月初收獲時(shí)，分別用卷尺和游標(biāo)卡尺測(cè)定樹高和地徑。并按根、莖和葉分別進(jìn)行收獲，用自來水沖洗干凈，吸水紙和毛巾吸干表面水分，于105 ℃烘箱中殺青30 min，然后65 ℃烘干至恒質(zhì)量，測(cè)定各器官的生物量。

1.3.2 鎘含量 將烘干的根、莖和葉分別研磨成粉末，其中根在研磨成粉末前，先浸入10 mmol/L EDTA-Na2溶液中交換30 min，以去除根系表面吸附的鎘離子，再用去離子水沖洗3次[16-17]。植物樣品經(jīng)HNO3-HClO4混合酸消化后，用火焰原子吸收分光光度計(jì)(AA-7000，日本島津)進(jìn)行鎘含量的測(cè)定[23]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)和耐受系數(shù)分別反映了植物將重金屬?gòu)母D(zhuǎn)運(yùn)到地上部分的能力和植物生長(zhǎng)在一定重金屬污染土壤中的耐受能力[17,27]，其計(jì)算公式[21]如下：

以巢式方差分析隨機(jī)模型為數(shù)學(xué)模型，根據(jù)方差分析結(jié)果計(jì)算鎘含量差異的來源比例[28]，公式如下：

式中：n為重復(fù)數(shù)，b為種群平均無性系數(shù)，S2為樣本方差，σ2為總體方差。

誤差項(xiàng)分量：σ誤差2=S誤差2。

種群間相對(duì)分量(比例)：

無性系間相對(duì)分量(比例)：

誤差項(xiàng)相對(duì)分量(比例)：

差異顯著性用軟件SPSS 20.0的單因素方差(ANOVA)完成，變異來源用巢式方差分析(Nested ANOVA)進(jìn)行，使用軟件Originlab 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘處理下不同青楊種群生長(zhǎng)響應(yīng)的比較

由表1和表2可以看出，無論是在處理之間還是在種群之間，3個(gè)青楊種群的地徑、樹高、各器官生物量和總生物量等指標(biāo)均未表現(xiàn)出顯著差異。各青楊種群的耐受系數(shù)也基本保持在1左右(表3)，表明本研究設(shè)置的鎘處理水平未對(duì)青楊生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯影響。

表1 鎘處理對(duì)不同青楊種群樹高和地徑的影響Table 1 Effect of cadmium treatments on height and basic radius of different populations of P.cathayana

注：不同小寫字母表示同一處理不同種群間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一種群不同處理間差異顯著(P<0.05)；CK為空白對(duì)照處理，L為低含量鎘處理(5 mg/kg)，H為高含量鎘處理(10 mg/kg)；下表同。

Note:Different lowercase letters represent significant differences (P<0.05) among populations within same treatments,different uppercase letters represent significant differences (P<0.05) among treatments within same populations;CK represents the blank control (0),L represents the Cd treatment of low concentration (5 mg/kg),and H represents the Cd treatment of high concentration (10 mg/kg).The same below.

表2 鎘處理對(duì)不同青楊種群生物量的影響Table 2 Effect of cadmium treatments on biomass of different populations of P.cathayana g

表3 鎘處理青楊種群轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)和耐受系數(shù)的比較Table 3 Comparison of transport factor and tolerance index of different populations of P.cathayana

2.2 鎘處理下青楊種群及種內(nèi)鎘含量的比較

加入外源鎘后，3個(gè)青楊種群鎘含量較空白對(duì)照均顯著增加(圖2)，種群平均鎘含量為3.36～45.01 mg/kg，集中在10～20 mg/kg。針對(duì)2個(gè)鎘處理而言，牦牛溝(MN)種群根、莖、葉中的鎘含量無顯著差異，榆林(YL)種群僅L處理莖中鎘含量顯著高于H處理，而日隆(RL)種群根和葉中鎘含量均表現(xiàn)為L(zhǎng)處理顯著低于H處理，針對(duì)不同種群而言，低含量鎘處理下，根、莖、葉中的鎘含量均表現(xiàn)為榆林和日隆種群顯著大于牦牛溝種群；高含量鎘處理下，根、莖、葉中的鎘含量總體表現(xiàn)為日隆>榆林>牦牛溝，其中，根中的鎘含量差異在3個(gè)種群之間有顯著性，莖中的鎘含量在3個(gè)種群間無顯著性差異，而葉中的鎘含量表現(xiàn)為日隆種群顯著大于榆林和牦牛溝種群。進(jìn)一步比較各器官之間鎘含量的差異(圖3)可以看出，無論是在低含量還是高含量鎘處理下，各青楊種群器官之間的鎘含量均表現(xiàn)出葉>莖>根的趨勢(shì)，差異顯著性在各種群中表現(xiàn)各異，總體而言葉和莖中的鎘含量明顯大于根。表3的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)顯示，鎘處理后各青楊種群的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)都大于1，種群之間表現(xiàn)為牦牛溝>日隆>榆林，其中高含量鎘處理下牦牛溝種群顯著大于日隆和榆林種群。

不同小寫字母表示同一處理不同種群間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示同一種群不同處理間差異顯著(P<0.05)

不同大寫字母表示同一種群不同器官間差異顯著(P<0.05)Different uppercase letters represent significant differences (P<0.05) among organs

2.3 鎘處理下不同青楊種群鎘含量變異的來源

3個(gè)青楊種群鎘含量變異的巢式方差分析(表4)顯示，除空白對(duì)照處理根在種群間無顯著差異外，所有處理根、莖、葉的鎘含量在種群間和無性系間均存在顯著差異。由鎘含量變異在種群和無性系間的分量比例(表4)可知，鎘處理后根和葉中的鎘含量變異主要來源于種群間，其分量比例分別占65.4%～68.9%和50.3%～71.2%；而莖中的鎘含量變異則主要來源于無性系間H處理，分量比例占73.2%，或兩者相近(L處理)。進(jìn)一步分析無性系間的鎘含量分布和變異性(以H處理為例)(圖4和表5)可以看出，無性系間鎘含量變異較大，尤以葉鎘含量的變異最大，其最大值達(dá)到61.26 mg/kg，而總的極差和變異系數(shù)分別達(dá)到了58.55 mg/kg和0.58；在種群之間，以榆林種群內(nèi)的變異性最大，其根、莖、葉鎘含量的極差和變異系數(shù)分別達(dá)到了10.89，15.63，35.31 mg/kg和0.34，0.45，0.46；平均鎘含量最高的日隆種群內(nèi)的變異性次之，其根、莖、葉鎘含量的極差和變異系數(shù)分別達(dá)到了9.27，12.45，33.14 mg/kg和0.21，0.31，0.25；牦牛溝種群內(nèi)的變異性最小。

表4 3個(gè)青楊種群鎘含量變異的巢式方差分析及變異來源的分量比例Table 4 Results of nested ANOVA of cadmium concentrations and sources of the differences for three populations of P.cathayana

注：僅種群間和無性系間均存在顯著性差異(P<0.05)時(shí)，才計(jì)算變異來源的分量比例。

Note:The allocation of differences was calculated only when there are significances among both populations and clones.

圖4 高含量鎘處理下青楊種群無性系的鎘含量分布Fig.4 Distribution of cadmium concentrations of clones within different populations of P.cathayana under high cadmium treatment (H)

種群Population根Root1234莖Shoot1234葉Leaf1234YL9.013.0910.890.3410.734.8015.630.4519.999.2835.310.46RL13.332.789.270.2113.994.4012.450.3145.0111.0633.140.25MN3.450.983.270.2910.832.539.660.2316.574.8219.010.29總計(jì)Total8.064.6217.340.5711.614.1215.630.3525.1514.5058.550.58

注：1、2、3、4分別代表平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、極差(mg/kg)和變異系數(shù)。

Note：1,2,3, and 4 indicate the mean value,sd,range(mg/kg)andCV.

3 討 論

本研究顯示，3個(gè)青楊種群在5和10 mg/kg鎘處理下，其地徑、樹高和生物量等生長(zhǎng)指標(biāo)與對(duì)照相比無顯著差異，這在耐受系數(shù)上也得到了體現(xiàn)，說明該水平的鎘處理未對(duì)青楊的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯影響。馮世靜等[29]研究也顯示，在鎘含量達(dá)到70 mg/kg時(shí)青楊才會(huì)表現(xiàn)出生長(zhǎng)抑制，而在20 mg/kg時(shí)其生長(zhǎng)基本不受任何影響。本研究中，鎘處理后，不同青楊種群各器官所富集的鎘都顯著增加，3個(gè)種群平均鎘含量為3.36～45.01 mg/kg，集中在10～20 mg/kg，未達(dá)到100 mg/kg的超富集植物標(biāo)準(zhǔn)[9]。研究發(fā)現(xiàn)，在較高水平鎘(如50 mol/L或50 mg/kg以上)處理下，楊樹(尤其是其地上部分)所富集的鎘含量可以達(dá)到100 mg/kg的超富集植物標(biāo)準(zhǔn)[22-24]。馮世靜等[29]在研究不同鎘處理對(duì)小青楊(Populuspseudo-simonii)和灰楊(Populus×canescens)的影響時(shí)也發(fā)現(xiàn)，當(dāng)鎘處理含量≥150 mg/kg時(shí)青楊各器官中的鎘才能達(dá)到100 mg/kg。

不同器官富集重金屬的能力差異對(duì)植物的富集能力有著十分重要的影響，且地上部分的富集量大于地下部分是超富集植物的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[2,20]。此外，重金屬富集部位的不同也影響著植物材料收獲后最佳處理技術(shù)的選擇[30-31]。研究發(fā)現(xiàn)，重金屬在楊樹各部位的富集量表現(xiàn)為根部>地上部分，地上部分則表現(xiàn)為莖>葉[22-23,30,32]，但也有研究結(jié)果顯示，楊樹地上部分鎘含量大于地下部分[33]。馮世靜等[29]在研究小青楊時(shí)也發(fā)現(xiàn)，根中的鎘含量總體大于葉和莖，但在個(gè)別處理下也表現(xiàn)為葉>根。本研究中，3個(gè)青楊種群在鎘處理后都表現(xiàn)為地上部分的鎘含量大于地下部分，且基本表現(xiàn)出葉>莖>根的趨勢(shì)，說明青楊具有超富集植物的轉(zhuǎn)運(yùn)能力。從轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)來看，種群的轉(zhuǎn)運(yùn)能力存在一定的差異，如牦牛溝種群在高含量鎘處理下的轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)達(dá)到4.51，顯著大于榆林和日隆種群。

很多研究發(fā)現(xiàn)，植物的重金屬富集能力在物種內(nèi)存在一定程度的變異[10,23]。本研究中，鎘處理后青楊根、莖和葉中的鎘含量在種群之間也存在明顯差異，總體而言表現(xiàn)為日隆和榆林種群大于牦牛溝種群。通過巢式方差分析發(fā)現(xiàn)，鎘含量不僅在種群間存在顯著差異，在種群內(nèi)的無性系間同樣存在顯著差異。據(jù)此分析鎘含量變異在種群間和無性系間的分量比例發(fā)現(xiàn)，鎘處理后根和葉中的鎘含量變異主要來源于種群間，其分量比例占65.4%～68.9%和50.3%～71.2%；而莖中的鎘含量則主要來源于無性系間(H處理)，其分量比例占73.2%，或兩者相近(L處理)。雖然根和葉中的鎘含量變異主要來源于種群間，但由無性系的鎘含量變異性和分布可以看出，無性系間的變異仍然很大，尤其是更能衡量富集能力的地上部分器官(莖和葉)，其中葉中富集效果最好的無性系其鎘含量、極差和變異系數(shù)分別達(dá)到了61.26，58.22 mg/kg和0.58；且以榆林種群無性系間的變異最大，日隆種群次之，牦牛溝種群最小，其中平均鎘含量最高的日隆種群根、莖、葉的鎘含量在種群內(nèi)的極差和變異系數(shù)分別達(dá)到了9.27，12.45，33.14 mg/kg和0.21，0.31，0.25。綜上分析可知，青楊的鎘富集能力在種群間和無性系間都存在明顯的變異性，表明可以通過開展種源/無性系選擇，選育出富集能力更高的基因型，從而提高植物修復(fù)的效率。

本研究中，5和10 mg/kg鎘處理未對(duì)青楊生長(zhǎng)產(chǎn)生實(shí)質(zhì)影響，說明5和10 mg/kg鎘水平對(duì)于青楊而言偏低，因此無法很好地區(qū)分不同青楊種群和個(gè)體的鎘富集能力。在未來的研究中可以嘗試提高鎘處理水平。此外，本研究中參試的無性系數(shù)量也相對(duì)較少，根據(jù)種群遺傳學(xué)和數(shù)量遺傳學(xué)的研究要求，未來研究中也應(yīng)增加參試的無性系數(shù)量(每個(gè)種群≥30個(gè))，以更好地探究青楊鎘富集能力的種群遺傳差異。

4 結(jié) 論

5和10 mg/kg鎘處理未對(duì)青楊生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯影響。鎘處理下3個(gè)青楊種群平均鎘含量為3.36～45.01 mg/kg，集中在10～20 mg/kg，其中日隆和榆林種群鎘含量大于牦牛溝種群。地上部分(莖和葉)鎘富集大于地下部分，且基本表現(xiàn)出葉>莖>根的趨勢(shì)，顯示出較強(qiáng)的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，但其在種群之間存在一定差異。各器官中的鎘含量在種群間和無性系間都存在明顯差異，其中根和葉中的鎘含量變異主要來源于種群間(占65.4%～68.9%和50.3%～71.2%)，而莖主要來源于無性系間(H處理)或者相近(L處理)。就器官而言，無性系間的變異性以葉最大，其最大值、極差和變異系數(shù)分別達(dá)到61.26，58.22 mg/kg和0.58；就種群而言，以榆林種群的變異性最大，日隆種群次之，牦牛溝種群最小。總體而言，青楊表現(xiàn)出了較好的重金屬鎘富集能力，且種群間和無性系間都存在明顯變異，因此在利用青楊進(jìn)行重金屬鎘的植物修復(fù)時(shí)，應(yīng)先做種源/無性系選擇，以選育富集能力更高的基因型或無性系。

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