circRNA、microRNA與低氧性肺動(dòng)脈高壓的相關(guān)性研究進(jìn)展

夏世金 王 堅(jiān) 邰先桃 王厚融

(復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院上海市老年醫(yī)學(xué)研究所，上海 200040)

低氧性肺動(dòng)脈高壓(HPH)是對(duì)人的健康危害極嚴(yán)重、治療難度極大、致死率和致殘率極高的病理生理綜合征，故有“假惡性”腫瘤之稱〔1〕。HPH發(fā)生機(jī)制一直是醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)〔2〕。中國(guó)40歲以上人群中COPD患病率高達(dá)8.2%，大多數(shù)COPD患者(尤其是老年患者)最終由HPH發(fā)展為肺心病〔3〕。HPH是COPD發(fā)展到肺心病的中心環(huán)節(jié)。深入研究并闡明HPH發(fā)生發(fā)展機(jī)制，對(duì)有效防治HPH和預(yù)防COPD進(jìn)展為肺心病具有重大意義。

1 microRNA與HPH

低氧性肺血管結(jié)構(gòu)重建(HPVSR)是HPH形成的基本病理生理特征之一〔4〕，低氧可致肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化、PASMC異常增殖加速和凋亡減慢、肺血管阻力增加和肺動(dòng)脈壓升高。PASMC異常增殖加速和凋亡減緩在HPVSR中起著關(guān)鍵作用。治療HPH策略已從單純舒張血管平滑肌降低肺動(dòng)脈壓力轉(zhuǎn)變到抑制血管異常增生和肺血管結(jié)構(gòu)重建。闡明低氧性PASMC異常增殖與凋亡在HPVSR中的作用與機(jī)制，對(duì)尋求有效防治HPH新策略意義重大。雖然從經(jīng)典遺傳學(xué)角度探索HPH機(jī)制已經(jīng)取得可喜進(jìn)展，但HPH的機(jī)制依然未完全闡明，HPH的有效防治依然未徹底解決，遭遇困境。然而，近年生機(jī)勃勃的表觀遺傳學(xué)將為闡明HPH機(jī)制帶來新希望。表觀遺傳調(diào)控幾乎存在于生物調(diào)控所有環(huán)節(jié)〔5〕。即使去除干預(yù)因素，表觀遺傳修飾也可長(zhǎng)時(shí)間保持穩(wěn)定并維持調(diào)控基因的表達(dá)水平。所以，表觀遺傳學(xué)在闡明疾病發(fā)生機(jī)制方面展示其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和巨大潛力。

當(dāng)前表觀遺傳學(xué)中研究非?；钴S的一個(gè)重要調(diào)控機(jī)制是microRNA(miRNA)。miRNA是一類高度保守的非編碼RNA(ncRNA)。miRNA選擇性結(jié)合到RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體上，并通過堿基互補(bǔ)配對(duì)與靶mRNA 3′非翻譯區(qū)(3′-UTR)特異序列結(jié)合，抑制mRNA翻譯或?qū)⑵浣到猓?fù)性調(diào)控靶基因的表達(dá)〔6，7〕。miRNA在HPH的形成中發(fā)揮著重要作用。在HPH模型大鼠肺中miR-451等表達(dá)上調(diào)和miR-22等表達(dá)下調(diào)〔8〕。miR-145/-143是平滑肌細(xì)胞高表達(dá)的一組miRNA，被稱為血管平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物，是促進(jìn)平滑肌細(xì)胞分化和穩(wěn)定表型的重要分子開關(guān)〔9〕。miR-21在低氧刺激的人PASMC中表達(dá)上調(diào)，通過抑制PDCD4等多個(gè)靶基因促進(jìn)細(xì)胞增殖與遷移〔10〕。在HPH患者血液中miR-23b等表達(dá)顯著上調(diào)，miR-1等表達(dá)明顯下調(diào)〔11〕。然而，用miRNA研究策略試圖闡明HPH發(fā)生機(jī)制依然困難重重?？上驳氖牵罱絹碓絺涫荜P(guān)注的、miRNA的內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)RNA(ceRNA)——環(huán)狀RNA(circRNA)為明確HPH發(fā)生發(fā)展機(jī)制、闡明早期干預(yù)靶點(diǎn)及診斷生物學(xué)標(biāo)志物提供新方法和新策略〔12〕。

2 circRNA與HPH

circRNA是一類特殊的非編碼RNA分子，是RNA家族的新成員和研究最新熱點(diǎn)。近年國(guó)際頂級(jí)刊物Nature發(fā)表了有關(guān)circRNA生物學(xué)功能的論文〔13，14〕，使得研究者對(duì)circRNA高度關(guān)注，掀起研究熱潮。

circRNA由特殊可變剪接產(chǎn)生，存在于真核細(xì)胞胞質(zhì)，呈現(xiàn)組織、時(shí)序和疾病的特異性。circRNA分子由于是封閉的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，所以不受RNA外切酶的影響，表達(dá)更加穩(wěn)定，而且不易降解。circRNA在機(jī)體組織細(xì)胞和血液中表達(dá)〔12〕。circRNA與疾病關(guān)聯(lián)的miRNA發(fā)生相互作用，調(diào)控疾病的發(fā)生，為闡明疾病發(fā)生機(jī)制、確立診斷標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn)提供強(qiáng)有力的手段。circRNA目前最具共識(shí)的是通過吸附miRNA(即miRNA sponge，miRNA海綿)機(jī)制發(fā)揮其功能〔12〕(見圖1)。由于circRNA分子富含miRNA應(yīng)答元件，可通過與miRNA發(fā)生海綿作用，進(jìn)而削弱miRNA對(duì)其下游靶基因的抑制效果，上調(diào)下游靶基因的表達(dá)〔14〕。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA CDR1as具有至少60個(gè)miR-7結(jié)合位點(diǎn)，充當(dāng)miR-7的海綿，可影響miR-7的靶基因活性〔14〕。在發(fā)育的中腦中CDR1as和miR-7有共同高表達(dá)的特征。在斑馬魚胚胎中，CDR1as過表達(dá)造成中腦體積變小，而通過注射miR-7前體后中腦體積得以部分恢復(fù)，表明CDR1as的生物學(xué)功能至少部分是通過CDR1as與miR-7的相互作用而產(chǎn)生〔14〕。CDR1as是miR-7的環(huán)狀抑制劑，負(fù)性調(diào)控miR-7，從而影響腫瘤的發(fā)生〔14〕，發(fā)揮天然miRNA海綿功能〔15〕。CDR1as可能與帕金森病的發(fā)生相關(guān)〔16〕。當(dāng)ciRS-7(也被稱為CDR1as)的海綿功能缺失時(shí)，miR-7表達(dá)上調(diào)，極有可能下調(diào)阿爾茨海默病相關(guān)蛋白(如泛素化蛋白連接酶A)的表達(dá)〔17～19〕。睪丸特異性基因Sry 的circRNA具有16個(gè)miR-138的靶位點(diǎn)，充當(dāng)miR-138海綿〔14〕。circRNA cANRIL是基因INK4/ARF的反義轉(zhuǎn)錄物〔20〕，可通過差異的PcG募集來抑制INK4/ARF表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)控動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生〔21〕。

(A)circRNA作為miRNA的環(huán)狀抑制劑，充當(dāng)miRNA海綿；(B)circRNA與蛋白結(jié)合；(C)circRNA與其他RNA通過堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合圖1 circRNA的主要功能示意圖〔12〕

作者前期研究發(fā)現(xiàn)〔22〕：(1) 芯片篩選實(shí)驗(yàn)：對(duì)HPH模型小鼠肺組織進(jìn)行circRNA芯片篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HPH模型組(與常氧組比較)小鼠肺組織中circRNAs表達(dá)顯著上調(diào)有23個(gè)，顯著下調(diào)有41個(gè)。(2)RT-PCR肺組織驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：接著挑選芯片篩選出的差異表達(dá)circRNAs中上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)相差較大的12個(gè)circRNAs(上調(diào)或下調(diào)各6個(gè))進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：HPH模型組小鼠肺組織中circRNAs表達(dá)顯著上調(diào)(與芯片結(jié)果完全一致)有5個(gè)(mmu_circ_0000410、mmu_circ_0001209、mmu_circ_0000173、mmu_circ_0001898、mmu_circ_0000007)，顯著下調(diào)(與芯片結(jié)果完全一致)有2個(gè)(mmu_circ_0001033、mmu_circ_0001724)(根據(jù)circBase數(shù)據(jù)庫(kù)circRNA ID命名)。這項(xiàng)創(chuàng)新性的研究結(jié)果預(yù)示著circRNA之矛將有可能戳穿HPH發(fā)生機(jī)制之盾。作者的新近研究發(fā)現(xiàn)：(1)RT-PCR細(xì)胞驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)：基于上述芯片結(jié)果，以常氧(對(duì)照)和低氧性的小鼠PASMC標(biāo)本為檢測(cè)對(duì)象，對(duì)上述相同的12個(gè)差異表達(dá)的circRNAs再次進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明，低氧性PASMC中circRNAs表達(dá)顯著上調(diào)有3個(gè)(mmu_circ_0000410、mmu_circ_0000173、mmu_circ_0000007)、顯著下調(diào)也有3個(gè)(mmu_circ_0001033、mmu_circ_0001724、mmu_circ_0000543)，與芯片檢測(cè)和肺組織RT-PCR驗(yàn)證的高度一致。(2)circRNA過表達(dá)慢病毒構(gòu)建與轉(zhuǎn)染小鼠PASMC實(shí)驗(yàn)：成功構(gòu)建了mmu_circ_0001033過表達(dá)慢病毒載體，并且成功高效轉(zhuǎn)染入小鼠PASMC，運(yùn)用CCK-8法檢測(cè)PASMC增殖，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的mmu_circ_0001033 可顯著抑制低氧所誘導(dǎo)的PASMC異常增殖。(3)circRNA、miRNA和mRNA三者之間關(guān)系研究：利用生物信息學(xué)技術(shù)和HPH相關(guān)miRNAs文獻(xiàn)整合分析發(fā)現(xiàn)，能夠與mmu_circ_0001033和mmu_circ_0000410結(jié)合的miRNAs有5條，預(yù)測(cè)這5條miRNAs的結(jié)合力最強(qiáng)的靶基因有30個(gè)，構(gòu)建了circRNA-miRNA-mRNA三者之間關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合circRNAs預(yù)測(cè)吸附的與HPH高度相關(guān)的miRNAs，綜合分析，從上述差異表達(dá)的circRNAs中，作者最終精選出mmu_circ_0001033和mmu_circ_0000410作為重點(diǎn)研究對(duì)象。

整合上述研究積累、HPH研究進(jìn)展與作者前期相關(guān)研究的結(jié)果，凝煉出關(guān)鍵科學(xué)問題：circRNA是否參與HPH的發(fā)生？circRNA調(diào)節(jié)HPH的機(jī)制是什么？circRNA所吸附的miRNA的下游與HPH發(fā)生相關(guān)的靶基因有哪些？進(jìn)而提出假設(shè)：(1)circRNA可調(diào)節(jié)HPH的發(fā)生；(2)circRNA可通過miRNA海綿(吸附miRNA)，以降低miRNA對(duì)其下游靶基因mRNA和蛋白表達(dá)的調(diào)控，發(fā)揮circRNA調(diào)節(jié)HPH的作用機(jī)制(見圖2)。為驗(yàn)證上述假設(shè)，進(jìn)而解決關(guān)鍵科學(xué)問題，擬制定的研究?jī)?nèi)容：(1)建立HPH小鼠和低氧性PASMC模型，構(gòu)建circRNA的shRNA或過表達(dá)慢病毒載體，從而下調(diào)或上調(diào)目的circRNAs表達(dá)，觀察慢病毒轉(zhuǎn)染后小鼠HPH特征及細(xì)胞增殖與凋亡等變化，明確circRNA調(diào)節(jié)HPH的生物學(xué)功能；(2)運(yùn)用RIP-PCR等方法明確circRNA與miRNA的結(jié)合關(guān)系，以及觀察circRNA/miRNA內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)影響miRNA下游靶基因的表達(dá)變化與信號(hào)通路調(diào)控，明確circRNA、miRNA和mRNA三者的關(guān)系，探明circRNA的miRNA海綿機(jī)制；(3) 利用熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)等探索circRNA、miRNA和mRNA之間的直接結(jié)合情況，深度闡明circRNA調(diào)節(jié)HPH的分子機(jī)制；(4)運(yùn)用HPH患者的血標(biāo)本驗(yàn)證目的circRNAs，確定HPH生物標(biāo)志物。為闡明HPH的機(jī)制、確定臨床診斷生物標(biāo)志物和干預(yù)靶點(diǎn)提供依據(jù)。

圖2 circRNA通過miRNA海綿調(diào)節(jié)miRNA下游靶基因表達(dá)從而調(diào)節(jié)HPH假設(shè)圖

總之，circRNA、microRNA與HPH三者之間具有密切的聯(lián)系，深入闡明circRNA和microRNA在HPH發(fā)生發(fā)展中的作用，為明確HPH發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新策略和新方法。

1McLaughlin VV，Archer SL，Badesch DB，etal.ACCF/AHA 2009 expert consensus document on pulmonary hypertension a report of the American College of Cardiology Foundation Task Force on Expert Consensus Documents and the American Heart Association developed in collaboration with the American College of Chest Physicians；American Thoracic Society，Inc.；and the Pulmonary Hypertension Association〔J〕.J Am Coll Cardiol，2009；53(17)：1573-619.

2Stenmark KR，F(xiàn)agan KA，F(xiàn)rid MG.Hypoxia-induced pulmonary vascular remodeling：cellular and molecular mechanisms〔J〕.Circ Res，2006；99(7)：675-91.

3Zhong N，Wang C，Yao W，etal.Prevalence of chronic obstructive pulmo-nary disease in China：a large，population-based survey〔J〕.Am J Respir Crit Care Med，2007；176(8)：753-60.

4Xia S，Tai X，Wang Y，etal.Involvement of Gax gene in hypoxia-induced pulmonary hypertension，proliferation，and apoptosis of arterial smooth muscle cells〔J〕.Am J Respir Cell Mol Biol，2011；44(1)：66-73.

5Zhao S，Xu W，Jiang W，etal.Regulation of cellular metabolism by protein lysine acetylation〔J〕.Science，2010；327(5968)：1000-4.

6Liu X，Park JK，Jiang F，etal.Dicer-1，but not Loquacious，is critical for assembly of miRNA-induced silencing complexes〔J〕.RNA，2007；13(12)：2324-9.

7Huntzinger E，Izaurralde E.Gene silencing by microRNAs：contributions of translational repression and mRNA decay〔J〕.Nat Rev Genet，2011；12(2)：99-110.

8Caruso P，MacLean MR，Khanin R，etal.Dynamic changes in lung microRNA profiles during the development of pulmonary hypertension due to chronic hypoxia and monocrotaline〔J〕.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010；30(4)：716-23.

9Cordes KR，Sheehy NT，White MP，etal.miR-145 and miR-143 regulate smooth muscle cell fate and plasticity〔J〕.Nature，2009；460(7256)：705-10.

10Sarkar J，Gou D，Turaka P，etal.MicroRNA-21 plays a role in hypoxia-mediated pulmonary artery smooth muscle cell proliferation and migration〔J〕.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2010；299 (6)：861-71.

11Wei C，Henderson H，Spradley C，etal.Circulating miRNAs as potential marker for pulmonary hypertension〔J〕.PLoS One，2013；8(5)：e64396.

12夏世金，高 文，胡明冬，等.環(huán)狀RNA的研究現(xiàn)狀及展望〔J〕.中華肺部疾病雜志(電子版)，2014；7(6)：55-8.

13Memczak S，Jens M，Elefsinioti A，etal.Circular RNAs are a large class of animal RNAs with regulatory potency〔J〕.Nature，2013；495(7441)：333-8.

14Hansen TB，Jensen TI，Clausen BH，etal.Natural RNA circles function as efficient microRNA sponges〔J〕.Nature，2013；495(7441)：384-8.

15Hentze MW，Preiss T.Circular RNAs：splicing′s enigma variations〔J〕.EMBO J，2013；32(7)：923-5.

16Ghosal S，Das S，Sen R，etal.Circ2Traits：a comprehensive database for circular RNA potentially associated with disease and traits〔J〕.Front Genet，2013；4：283.

17Lukim WJ.Circular RNA (circRNA) in Alzheimer′s disease (AD)〔J〕.Front Genet，2013；4：307.

18Bingol B，Sheng M.Deconstruction for reconstruction：the role of proteolysis in neural plasticity and disease〔J〕.Neuron，2011；69(1)：22-32.

19Lonskaya I，Shekoyan AR，Hebron ML，etal.Diminished parkin solubility and co-localization with intraneuronal amyloid-beta are associated with autophagic defects in Alzheimer′s disease〔J〕.J Alzheimers Dis，2013；33(1)：231-47.

20Salzman J，Chen RE，Olsen MN，etal.Cell-type specific features of circular RNA expression〔J〕.PLoS Genet，2013；9(9)：e1003777.

21Burd CE，Jeck WR，Liu Y，etal.Expression of linear and novel circular forms of an INK4/ARF-associated non-coding RNA correlates with atherosclerosis risk〔J〕.PLoS Genet，2010；6(12)：e1001233.

22夏世金，邰先桃，李 炳，等.低氧性肺動(dòng)脈高壓小鼠肺的環(huán)狀RNA表達(dá)譜研究〔J〕.中華肺部疾病雜志(電子版)，2015；8(1)：40-4.