金蕎麥藥酒對膠原誘導關節(jié)炎大鼠凋亡基因及基質蛋白酶的影響

潘朝旺 王 偉 萬進軍

(鄂州職業(yè)大學醫(yī)學院藥學系，湖北 鄂州 436000)

王慶等〔1〕研究表明老年風濕性關節(jié)炎患者自我管理行為與自我效能有明顯相關性，但藥物治療具有更重要的地位。金蕎麥具有清熱解毒，潤肺補腎，健脾止瀉，祛風濕之功效。本實驗研究金蕎麥藥酒對Ⅱ型膠原誘導關節(jié)炎(CIA)模型大鼠血清基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、滑膜細胞相關凋亡基因caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表達、脾臟淋巴細胞凋亡率及膝關節(jié)滑膜巨噬細胞密度的影響。

1 材料與方法

1.1動物 18月齡雌性SD大鼠80只，體重(390±30)g，SPF級，由三峽大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(鄂)2011-0012。

1.2藥品與試劑 本實驗所用金蕎麥2014年3月購于湖北省鄂州市中醫(yī)院，經(jīng)鄂州市藥品檢驗所鄭本瑞主任藥師鑒定為蓼科植物金蕎麥Fagopyrumdibotrys(D.Don)Hara的干燥根莖，符合《中華人民共和國藥典》2010年版標準。金蕎麥藥酒，淡黃色液體，本院自制，將金蕎麥飲片與白酒以4∶11(g∶ml)比例常溫浸泡60 d，倒出液體，用白酒調(diào)節(jié)至每毫升藥酒相當于金蕎麥原藥材0.4 g，本實驗劑量以原生藥表示，臨用前用生理鹽水稀釋成不同濃度；雷公藤多苷片，浙江得恩德制藥有限公司生產(chǎn)，批號：20131114；完全弗氏佐劑(FCA)、雞Ⅱ型膠原(CⅡ)，Sigma 公司；Trizol試劑，RNA逆轉錄試劑盒，SYBR Premix Ex Taq 試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；大鼠血清MMP-2、MMP-9酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒，卡邁舒(上海)生物科技有限公司；Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒，天津百浩生物科技有限公司；ED1單抗(標記巨噬細胞)，上海今邁生物科技有限公司；SP免疫組織化學檢測試劑盒，上海研卉生物科技有限公司；3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司。

1.3儀器 9602A酶標儀，南京普朗醫(yī)用設備有限公司；超聲波細胞粉碎機，上海豫明儀器有限公司；臺式冷凍離心機，上海安亭科學儀器公司；Z160M微量高速離心機，德國HERMLE；CFX 96 Touch PCR儀，美國伯樂；PT-MR3100D組織勻漿機，瑞士Polytron公司；UV754紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；病理切片機HS2046，金華市華速科技有限公司；OLYPUS BX-60光學顯微鏡，日本；PV-200 型足容積測定儀，成都泰盟科技有限公司。

1.4動物造模及分組給藥 隨機抽取大鼠10只，為正常組，其余50只建立CIA模型〔2,3〕，將CⅡ溶于0.2%醋酸，濃度為2 mg/ml，4℃條件下放置過夜，與等體積FCA混合，于冰浴中充分乳化，即得CⅡ乳劑，于每只大鼠尾根部、背部、右后肢足趾3點皮內(nèi)共注射0.4 ml，正常組于相同部位3點注射生理鹽水0.1 ml。7 d后所有造模大鼠按原方法注射CⅡ乳劑0.2 ml加強免疫1次。將造模大鼠隨機分為模型組、陽性對照組、高劑量金蕎麥組、中劑量金蕎麥組、低劑量金蕎麥組。正常組、模型組于造模后每天灌胃生理鹽水15 ml/kg，陽性對照組每天灌胃雷公藤多苷混懸液0.03 g/kg，高、中、低劑量金蕎麥組分別每天灌胃不同濃度金蕎麥藥酒2.16、1.08、0.54 g/kg，灌胃體積為10 ml/kg，連續(xù)給藥21 d。

1.5觀察指標及方法 觀察記錄致炎后第12、15、18、21天各組大鼠左后足跖腫脹體積。末次給藥2 h后，常規(guī)對各組大鼠眶靜脈取血，3 500 r/min離心10 min，取上清液于-70℃保存待用。ELISA測定血清MMP-2、MMP-9水平。

1.6RT-PCR檢測滑膜細胞凋亡相關基因caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA表達 取大鼠后肢右膝關節(jié)，分離出滑膜，常規(guī)Trizol法提取滑膜細胞總RNA，檢查純度和濃度達到要求后，按照逆轉錄試劑盒說明將RNA逆轉錄成cDNA。根據(jù)上海捷瑞生物工程有限公司提供的caspase-3、caspase-9、β-actin核苷酸序列設計和合成引物，按SYBR Premix Ex Taq 試劑盒說明添加PCR反應體系，進行caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA的cDNA擴增，反應條件為94℃預變性5 min，94℃變性15 s，60℃退火60 s，40個循環(huán)結束。RT-PCR數(shù)據(jù)處理采用2-ΔΔCt法。

1.7流式細胞術檢測脾臟淋巴細胞凋亡 取大鼠脾臟，稱重后剝離干凈，生理鹽水沖洗，取加磷酸鹽緩沖液研磨，過100目篩，1 000 r/min離心10 min，棄掉上清液，向沉淀中加適量紅細胞裂解液，混勻后靜置5～6 min，再1 000 r/min離心10 min，用1640完全培養(yǎng)液(加入10%胎牛血清)重懸細胞，調(diào)整細胞濃度2×106個/ml，取上述液體0.1 ml按Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒說明書操作，流式細胞儀檢測分析。

1.8膝關節(jié)滑膜ED1免疫組化染色及巨噬細胞計數(shù) 取大鼠后肢左膝關節(jié)，分離膝關節(jié)皮膚、肌肉等組織，暴露膝關節(jié)，固定，用手術剪沿髕骨周圍將整塊滑膜剪成條狀，立即用10%甲醛液固定，石蠟包埋切片，SP染色法進行ED1免疫組化染色(ED1單抗?jié)舛葹?∶20)，AEC顯色，顯微鏡下觀察滑膜襯里層ED1陽性細胞分布密度(細胞數(shù)/mm2)。

1.9統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1各組足跖腫脹體積比較 與正常組比較，模型組自第12天起有明顯腫脹(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組和金蕎麥各劑量組腫脹體積下降，自第15天起基本上差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表1。

2.2各組血清MMP-2、MMP-9水平比較 與正常組比較，模型組MMP-2、MMP-9水平升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組和高、中劑量金蕎麥組MMP-2、MMP-9明顯下調(diào)(P<0.05，P<0.01)，低劑量金蕎麥組MMP-9也明顯下調(diào)(P<0.05)。見表2。

2.3各組滑膜細胞caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA比較 與正常組比較，模型組caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA表達明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組和高、中劑量金蕎麥量組caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA表達明顯上調(diào)(P<0.01)，低劑量金蕎麥組caspase-9 mRNA表達也明顯上調(diào)(P<0.05)。見表2。

表1 各組足跖腫脹體積比較

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

表2 各組血清MMP-2、MMP-9水平及滑膜細胞caspase-3 mRNA、caspase-9 mRNA比較

2.4各組脾臟淋巴細胞凋亡水平比較 與正常組比較，模型組脾淋巴細胞凋亡率明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組和高、中劑量金蕎麥組脾淋巴細胞凋亡率明顯升高(P<0.05，P<0.01)，低劑量金蕎麥組與模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

2.5各組膝關節(jié)滑膜巨噬細胞水平比較 與正常組比較，模型組巨噬細胞密度明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，陽性對照組和高、中劑量金蕎麥組巨噬細胞密度明顯降低(P<0.05,P<0.01)，低劑量金蕎麥組與模型組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組脾臟淋巴細胞凋亡、膝關節(jié)滑膜巨噬細胞水平比較

3 討 論

MMPs可降解軟骨和關節(jié)骨中的蛋白多糖、膠原等細胞外基質大分子，從而促進血管翳對軟骨的侵襲，引起韌帶、軟骨、骨的破壞〔4，5〕。MMP-2和MMP-9作為明膠酶類基質金屬蛋白酶，兩者作用底物近似，對間質膠原、明膠、彈性蛋白、和Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ型膠原等細胞外基質成分有降解作用〔6，7〕。在所有MMPs中，MMP-2表達最廣泛，對結締組織的生理代謝具有重要意義，過度表達可導致關節(jié)炎的發(fā)生，應用MMPs抑制劑可以阻止關節(jié)的破壞已經(jīng)在動物實驗中得到證實〔8〕。本實驗表明，金蕎麥藥酒可降低CIA大鼠血清MMP-2和MMP-9水平，從而抑制軟骨和關節(jié)骨中細胞外基質降解。線粒體途徑是細胞凋亡的經(jīng)典途徑之一，在凋亡刺激因子作用下，細胞色素C釋放，與凋亡蛋白激活因子結合，形成多聚復合物，導致caspase-9活化，后者再活化下游的caspase-3，引發(fā)級聯(lián)反應，分解大量的細胞底物，最終導致細胞凋亡〔9〕。升高caspase-3水平可以促進RA大鼠增生的滑膜細胞凋亡。本實驗表明，金蕎麥藥酒可增強CIA大鼠滑膜細胞caspase-3 mRNA和caspase-9 mRNA表達，促進增殖的滑膜細胞凋亡，改善風濕性關節(jié)炎的病理狀態(tài)。在風濕性關節(jié)炎患者病變關節(jié)滑膜內(nèi)，巨噬細胞數(shù)量明顯增多，其不僅與關節(jié)疼痛數(shù)、壓痛數(shù)、紅細胞沉降率、C 反應蛋白等反映風濕性關節(jié)炎病情程度的指標呈明顯正相關，還與X線關節(jié)破壞的侵蝕積分和狹窄積分呈明顯的正相關，可能與其釋放腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-1、IL-6等炎性因子有關。本實驗同時顯示，風濕性關節(jié)炎大鼠脾淋巴細胞凋亡率較正常大鼠明顯降低，其機制有待進一步研究。

1王 慶，徐桂華，錢 先，等.老年類風濕關節(jié)炎患者自我管理行為與自我效能的相關性〔J〕.中國老年學雜志，2015;35(16):4684-5.

2徐 琦，尹抗抗，譚達全，等.麻黃加術湯對大鼠類風濕性關節(jié)炎模型作用機制的研究〔J〕.湖南中醫(yī)藥大學學報，2011;31(5):13-5.

3馬艷苗，王永輝，李艷彥，等.風濕寧膠囊對膠原誘導性關節(jié)炎大鼠滑膜細胞超微結構及細胞凋亡相關基因表達的影響〔J〕.中醫(yī)雜志，2013;54(4):326-8，335.

4許 蕾，解思濤，譚 磊,等.中西醫(yī)治療類風濕關節(jié)炎的研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2014;34(5):1436-7.

5馬 玲.糖皮質激素在調(diào)節(jié)類風濕關節(jié)炎患者多項血清因子中的效果觀察〔J〕.醫(yī)學理論與實踐,2015;28(11):1423-5.

6Kim KS，Choi HM，Lee YA，etal.Expression levels and association of gelatinases MMP-2 and MMP-9 and collagenases MMP-1 and MMP-13 with VEGF in synovial fluid of patients with arthritis〔J〕.Rheumatol Int，2011;31(4):543-7.

7Nyman JS，Lynch CC，Perrien DS，etal.Differential effects between the loss of MMP-2 and MMP-9 on structural and tissue level properties of bone〔J〕.J Bone Miner Res，2011;26(6):1252-60.

8Ishikaw T，Nishigakia F，Miyata S，etal.Prevention of progressive joint destruction in adjuvant induced arthritis in rats by a novel matrix metalloproteinase inhibitor，F(xiàn)R217840〔J〕.Eur J Pharmacol，2005;(508):239-47.

9林昌松，陳秀敏，林 云.昆母湯醇提液對人類風濕 關節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞凋亡及caspase-3表達的影響〔J〕.廣東醫(yī)學，2015;36(3)：339-41.