ABT737對(duì)ZM447439促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

張 月 王耀一 孫光源 姜偉華 孫 健 范敬靜 張志生 信國(guó)峰 宋文麗 費(fèi)建東

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院乳腺外科，河北 張家口 075000)

乳腺癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其治療已規(guī)范化，靶向治療成為大趨勢(shì)。化療藥物治療效果明顯，但副作用大；靶向治療針對(duì)靶點(diǎn)，治療明確。Aurora 激酶、Bcl-2家族作為新的靶點(diǎn)，以它們?yōu)榘悬c(diǎn)治療的聯(lián)合應(yīng)用為乳腺癌治療開(kāi)辟了新思路。本研究主要檢測(cè)ABT737增強(qiáng)ZM447439抑制人乳腺癌細(xì)胞的增殖效應(yīng)，誘導(dǎo)凋亡并且初步探討與其相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌細(xì)胞株T47D、MDA-MB-231由河北北方學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；ZM447439、ABT737購(gòu)自selleck公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibico公司；胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；p-AuroraA、 p-組蛋白(Histone)H3、AuroraA、HistoneH3、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)B1、p-cdc25c、cdc25c、p-cdc2、cdc2、p21、p53 Bax、Bcl-2、Bcl-xl、PARP、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)3一抗購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) T47D、MDA-MB-231細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于RPMI1640培養(yǎng)液中，內(nèi)加10%胎牛血清、人青霉素(濃度100 U/ml)和鏈霉素(濃度100 μg/ml)，于37℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組(含ZM447439的RPMI 1640培養(yǎng)液)，設(shè)計(jì)ZM447439濃度分別為0、100 μmol/L處理24 h，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化。

1.33-(4,5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)測(cè)定細(xì)胞活性 將細(xì)胞接種于96孔板(1×104個(gè)/孔)，每組設(shè)3個(gè)平行孔，細(xì)胞按分組處理后，更換新鮮培養(yǎng)液(200 μl)；每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)孵育4 h，棄培養(yǎng)液，加入200 μl二甲基亞砜，震蕩混勻，待顆粒溶解后，酶標(biāo)儀波長(zhǎng)570 nm處檢測(cè)各孔光濃度值 (OD值)。

1.4克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖 處理細(xì)胞懸液，保證6孔板每孔細(xì)胞50個(gè)左右。將其分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組處理4 h后，棄去，RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)15 d后，棄去；預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)輕晃立即棄去；加10%甲醇固定30 min，然后用PBS洗滌至甲醇干凈，自然晾干，加入0.1%結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞染色30 min后用蒸餾水洗滌，置于空氣中到干燥為止，采圖。

1.5免疫熒光觀察紡錘體及核的改變 對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化、計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至103/ml。把預(yù)先處理的無(wú)菌玻片放入12孔板中，將以上細(xì)胞懸液滴入每孔(保證每孔為2 ml)，放入37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜使其貼壁。給予ZM447439 1 μmol/L處理48 h后，將培養(yǎng)液棄去；用預(yù)冷的1倍PBS洗3次(5 min/次)，經(jīng)4%多聚甲醛固定、0.2%Triton-X100破膜、DAPI著色5～10 min，1倍PBS洗3次后封片，在熒光顯微鏡下觀察，共聚焦顯微鏡下采圖。

1.6Western印跡檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取30 μg總蛋白行10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉(zhuǎn)法將蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室溫纖維素膜用含5%牛奶TBST封閉0.5 h；加入一抗(稀釋比例為1∶1 000其中β-actin抗體稀釋比例為1∶10 000)4℃過(guò)夜；TBST洗滌 3次，然后與二抗(辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，稀釋比例1∶10 000)室溫孵育1 h后TBST洗滌3次；電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影，曝光。

1.7流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 分別用對(duì)照組(未處理)、抑制劑組(ZM447439 0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 μmol/L)處理T47D 、MDA-MB-231 24 h，1 μmol/L作用48 h后，收集細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×106個(gè)/ml，用冷PBS洗滌細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min兩次；預(yù)冷的95%乙醇固定，離心乙醇固定的細(xì)胞，棄去乙醇，加入PI(50 μg/ml)與RNase(1 μg/ml)混合物500 μl作用15 min后，在流式細(xì)胞儀上機(jī)分析，檢測(cè)1×104個(gè)細(xì)胞，并用multicycle軟件進(jìn)行細(xì)胞周期的分析。

1.8熒光染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 分別用對(duì)照組(未處理)、實(shí)驗(yàn)組處理T47D細(xì)胞72 h后，分別加入終濃度為5 μg/ml的Hoechst33342、 250 nmol/L的 MitoTracker Red和1 μmol/L的Yo-pro-1，室溫孵育30 min后，倒置熒光顯微鏡下觀察。 Yo-pro-1可透過(guò)凋亡細(xì)胞的細(xì)胞膜，但不能透過(guò)活細(xì)胞的細(xì)胞膜。

1.9流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 分別用對(duì)照組(未處理)、實(shí)驗(yàn)組分別處理T47D 48 h后，收集細(xì)胞，并調(diào)整的細(xì)胞數(shù)至1×106個(gè)/ml，用冷PBS洗滌細(xì)胞兩次。加入結(jié)合緩沖液100 μl、FITC Annexin-Ⅴ 5 μl、PI(50 μg/ml)10 μl，室溫避光孵育15 min后加入結(jié)合緩沖液400 μl細(xì)胞懸液中加入孵育20～30 min。流式細(xì)胞儀FACScan測(cè)定，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件處理計(jì)算凋亡細(xì)胞百分率。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1ZM447439抑制乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)及增殖 MTT法顯示隨著濃度和時(shí)間增加ZM447439呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，24、48、72 h的IC50值分別為(8.01±0.96)、(3.62±0.41)、(0.42±0.11)μmol/L(圖1)；克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著ZM447439濃度的增加克隆形成的數(shù)目減少(圖2)。倒置顯微鏡下觀察，100 μmol/LZM447439作用24 h，T47D、MDA-MB-231細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞皺縮、破裂，失去正常形態(tài)，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)空泡及顆粒，細(xì)胞間隙增大，部分細(xì)胞失去貼壁能力，細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)增加。見(jiàn)圖3。

圖1 MTT檢測(cè)不同濃度不同時(shí)間ZM447439對(duì)T47D細(xì)胞抑制率曲線

圖2 ZM447439對(duì)T47D、MDA-MB-231對(duì)細(xì)胞克隆形成的影響

2.2ZM447439對(duì)P-Histome H3、P-AuroraA及周期特異性、調(diào)節(jié)性指標(biāo)的影響 P-Aurora A、P-Histone的表達(dá)隨著ZM447439濃度增加逐漸減弱，Cyclin B1、p-cdc25c、p-cdc2、p21、p53是G2/M期的周期特異性及調(diào)節(jié)性指標(biāo)，隨著ZM447439濃度增加，CyclinB1的表達(dá)逐漸減少；其他指標(biāo)的表達(dá)逐漸增加(圖4)。

2.3ZM447439對(duì)乳腺癌細(xì)胞核紡錘體的影響及多核細(xì)胞的形成 ZM447439 0、1 μmol/L作用于T47D 48 h，紡錘體的結(jié)構(gòu)紊亂、細(xì)胞核出現(xiàn)改變；在沒(méi)有ZM447439的作用下，MDA-MB-231細(xì)胞核分布均勻，無(wú)明顯分葉的變化。經(jīng)1 μmol/L ZM447439作用48 h后，細(xì)胞核出現(xiàn)分葉狀，產(chǎn)生多核細(xì)胞。見(jiàn)圖5，圖6。

圖3 兩組T47D、MDAMB-231在倒置顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)(×40)

圖4 ZM447439對(duì)Aurora A、HistoneH3自身磷酸化及周期特異性指標(biāo)的影響

圖5 ZM447439對(duì)乳腺癌T47D細(xì)胞核紡錘體的影響及多核細(xì)胞的形成(×200)

2.4流式細(xì)胞術(shù)對(duì)DNA倍體分析 1 μmol/L ZM447439作用48 h，乳腺癌細(xì)胞產(chǎn)生多倍體(圖7)。T47D、MDA-MB-231細(xì)胞系在ZM447439不同濃度作用下，G0/G1、S期細(xì)胞百分比減少，G2/M期細(xì)胞百分比增加；G2/M期細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比隨著濃度的增加有明顯增多的趨勢(shì)，而相對(duì)應(yīng)G0/G1期、S期細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比減少，見(jiàn)表1。

2.5ABT737與ZM447439對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響 不同濃度ZM447439作用不同時(shí)間，PARP的剪切帶呈現(xiàn)濃度及時(shí)間的依賴性。不同濃度ZM447439加入1 μmol/L ABT737作用48 h，PARP、Caspase3剪切帶明顯增加，Bax表達(dá)增加，Bcl-2表達(dá)減少,見(jiàn)圖8。熒光染料及FITC Annexin-Ⅴ流式細(xì)胞術(shù)顯示，1 μmol/L ABT737+1 μmol/L ZM447439聯(lián)合組作用48 h細(xì)胞凋亡率〔(4%5.30±0.32)%〕明顯高于對(duì)照組、1 μmol/L ABT737及1 μmol/L ZM447439作用48 h的(0.31±0.03)%、(17.46±0.39)%、(28.21±0.48)，見(jiàn)圖9。

圖7 流式細(xì)胞術(shù)對(duì)DNA倍體分析

1～6：0、0.001、0.010、0.100、1.000、10.000 μmol/L ZM447439圖8 ABT737與ZM447439對(duì)乳腺癌細(xì)胞的影響

濃度(μmol/L)T47DG0/G1期S期G2/M期MDA-MB-231G0/G1期S期G2/M期050.9±0.5533.6±0.5914.7±0.3248.5±0.6630.1±0.3015.9±0.530.00152.9±0.4929.7±0.1517.3±0.1537.0±0.4628.8±0.3117.5±0.640.01049.6±0.6420.5±0.2130.8±0.3131.4±0.8020.6±0.8229.9±0.440.10053.2±0.3117.6±0.3136.2±0.1517.3±0.554.6±0.4029.3±0.311.00025.6±0.4216.2±0.1058.2±0.508.8±0.254.2±0.3148.2±0.4910.0009.5±0.204.51±0.5185.8±0.326.1±0.210.1±0.1586.0±0.35

圖9 熒光染料顯示各組細(xì)胞凋亡率(×100)

3 討 論

Aurora激酶在許多上皮惡性腫瘤中有擴(kuò)增，與腫瘤形成密切相關(guān)，它們?cè)诙喾N腫瘤細(xì)胞如乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌等中過(guò)表達(dá)〔1〕。AuroraA、B、C是Aurora激酶家族中的3個(gè)成員，主要在調(diào)節(jié)中心體成熟、有絲分裂紡錘體形成、胞質(zhì)分裂中占有重要的地位。AuroraA已被證實(shí)可作為乳腺癌獨(dú)立的預(yù)后因素〔2〕，主要在G2/M期達(dá)到高峰，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中G2/M轉(zhuǎn)換，是調(diào)節(jié)M期進(jìn)展的關(guān)鍵因子〔3〕，AuroraA通過(guò)自身磷酸化發(fā)揮作用。研究表明，ZM447439是ATP競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合性小分子Aurora激酶抑制劑，可抑制細(xì)胞增殖，抑制HistoneH3磷酸化，細(xì)胞出現(xiàn)多倍體現(xiàn)象，胞質(zhì)分裂失敗〔4〕。另外，ZM447439在結(jié)腸癌細(xì)胞中有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，阻斷微管形成的作用，從而發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔5〕。

CyclinB1是細(xì)胞周期中一種重要的蛋白，使細(xì)胞通過(guò)G2/M期的檢查點(diǎn)，促進(jìn)細(xì)胞G2/M期的轉(zhuǎn)換，它在有絲分裂中后期被降解，促進(jìn)有絲分裂完成，促使細(xì)胞周期的運(yùn)行。CyclinB1為P-AuroraA的下游基因，在間期開(kāi)始累積，且越接近有絲分裂期水平越高，CyclinB1可以促使細(xì)胞G2/M期的轉(zhuǎn)化〔5〕，因而干擾P-AuroraA形成會(huì)影響到G2/M細(xì)胞周期的運(yùn)行，使細(xì)胞發(fā)生凋亡。Cdc25c在間期存在于胞質(zhì)中，有絲分裂開(kāi)始時(shí)才轉(zhuǎn)運(yùn)到核中行使去磷酸化功能。Cdc25c可以將CDK1的Thr14位點(diǎn)(cdc2)去磷酸化從而激活CyclinB/CDK1復(fù)合物〔6〕，p21負(fù)向調(diào)控CyclinB/CDK1，使其發(fā)生G2/M期阻滯，Bax能自身形成同源二聚體(Bax/Bax)而誘導(dǎo)凋亡，Bcl-2則可與Bax形成異源二聚體(Bcl-2/Bax)以抑制凋亡，Bax、Bak活化后在線粒體膜上形成二聚體，增加了線粒體外膜通透性，釋放出細(xì)胞色素C等促凋亡分子，激活Caspase9，再激活下游的Caspase3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔7〕。

ABT737與Bcl-2、Bcl-xl和Bcl-w有較高親和力，能促進(jìn)高表達(dá)Bcl-2的腫瘤細(xì)胞凋亡。ABT737單藥對(duì)小細(xì)胞肺癌(SCLC)、濾泡性淋巴瘤/彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞系最有效，可使小鼠模型異種移植的SCLC完全消失、骨髓瘤生長(zhǎng)受抑制〔8〕。對(duì)多數(shù)腫瘤細(xì)胞系，特別是實(shí)體腫瘤，單藥的細(xì)胞殺傷活性較差。ABT737能提高腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性，與多種化療藥物如依托泊苷、阿糖胞苷、多柔比星、順鉑、紫杉醇等合用時(shí)可顯著降低這些藥物的EC50，減少其副作用〔9〕。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ABT737還能提高小分子Aurora激酶抑制劑ZM447439的敏感性。

ZM447439抑制AuroraA和HistoneH3的磷酸化，使細(xì)胞在G2/M期阻滯，從而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)〔10〕。ZM447439抑制乳腺癌細(xì)胞增殖發(fā)生凋亡通過(guò)兩種途徑：(1)抑制P-AuroraA及P-AuroraB的形成。(2)抑制p-Histone H3 形成，形成多倍體細(xì)胞和很少部分二倍體細(xì)胞，二倍體細(xì)胞在藥物的作用下隨著時(shí)間推移最終和多倍體細(xì)胞一樣形成非整倍體，發(fā)生凋亡，從而使促凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，Bcl-2蛋白表達(dá)量減少，ABT737為小分子Bcl-2抑制劑，抑制Bcl-2/Bcl-xl的表達(dá)，從而使Bax的表達(dá)增加。

ZM447439可抑制乳腺癌細(xì)胞AuroraA自身磷酸化，p-cdc25c、p-cdc2表達(dá)增加，下調(diào)CyclinB1的活性，從而發(fā)生G2/M期阻滯，使細(xì)胞停滯生長(zhǎng)，抑制P-HistoneH3，多倍細(xì)胞形成，最終形成非整倍體，細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡相關(guān)指標(biāo)發(fā)生改變，1 μmol/L ABT737的介入，使促凋亡蛋白表達(dá)明顯增加，加速乳腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。

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