藏族藥甘青青蘭不同花色花朵的代謝組學分析△

趙翔，賽曼*，張艷鵬，于曉銳，王勇，蘭世超，申振，段亞玲

1.西藏自治區(qū)藏醫(yī)院 生藥研究所，西藏 拉薩 850000；2.道地藥材國家重點實驗室，北京 100700；3.西南林業(yè)大學 園林園藝學院，云南 昆明 650224；4.貴州大學 精細化工研究開發(fā)中心，貴州 貴陽 550025；5.貴州師范學院 生物科學學院，貴州 貴陽 550018；6.貴州省分析測試研究院，貴州 貴陽 550014

甘青青蘭Dracocephalum tanguticumMaxim.屬唇形科（Lamiaceae）青蘭屬（DracocephalumL.）多年生草本植物[1]，俗名則羊古、隴塞青蘭、唐古特青蘭，分布于西藏、青海、四川和甘肅等地[2]，喜干燥環(huán)境，主要生長在海拔1900～4000 m 的河谷岸、田野、草灘或林邊等[2-9]。據(jù)記載，甘青青蘭味甘、苦，可清膽熱、止血、愈瘡、燥黃水[10]，陰陽兩坡均生，花及葉皆蘭色[11]，藏族醫(yī)常用其地上部分入藥，在民間亦將其作為香料使用[12]，具有抗氧化、保護心臟、抑菌、抗炎、抗病毒等功效，常用于治療胃炎、氣管炎、黃疸性肝炎、頭暈、神疲、關節(jié)炎及癤瘡等[2,13-17]。

資料顯示，甘青青蘭（原變種）、矮生變種及灰毛變種僅存在1 種花色，其花冠為紫藍色至暗紫藍色，并未發(fā)現(xiàn)其他顏色[1]。但經實地考察發(fā)現(xiàn)，除了記載的正?；ㄉ纤{色外，還存在粉色花，且2 種花色差異明顯，目測可辨。顏色出現(xiàn)差異主要源于其代謝產物，如黃酮苷，是紫藍色和粉色的顏色來源，黃酮類結構含有重要的生色基團，生色基團與黃酮苷元耦合產生顏色的差異[18-19]。同時，中藥藥效與其代謝產物有密切關系[20-22]。近年來，在甘青青蘭有效成分提取及其功效研究方面已取得顯著進展[1,4,7,9,22-33]，然而關于其花色與生藥藥性的相關性研究尚未見報道。

代謝組學主要分為靶向代謝組學和非靶向代謝組學[34-35]。目前非靶向代謝組學的應用比較普遍，可以全面分析生物體內代謝物種類，但是其存在準確度、特異性缺乏等缺點。靶向代謝組學利用前期建立的各種代謝物數(shù)據(jù)庫并結合多種代謝通路，對目標代謝物進行定量分析，準確度高、特異性強，能夠彌補非靶向代謝組學的不足[36-38]。代謝組學提供的眾多的潛在生物標志物及其代謝網(wǎng)絡為表征“傳統(tǒng)藥物的成分巨系統(tǒng)”作用于“機體巨系統(tǒng)”的有效性和作用機制提供了一個可能的思路。因此開展甘青青蘭不同花色花朵的比較代謝組學研究有重要意義。本研究以2 種不同花色的甘青青蘭為材料，利用非靶向代謝組學分析不同花色花朵中代謝物的差異，并對差異代謝通路進行富集，初步明確形成不同花色的原因及產生花色差異的代謝物和通路。

1 材料

1.1 樣品

甘青青蘭樣品于2022 年8 月采自西藏自治區(qū)瀕危藏藥材人工種植研究基地（E91°15'6.19″，N29°37'14.55″），采集同一范圍內植株（50 m×50 m），保證其生境的相似性，減少環(huán)境因素影響。隨機選取2019 年種植的6 株處于盛花期、生長狀況基本一致的甘青青蘭植株，采集花朵，清理灰塵及雜質，將處理完成的潔凈樣品依據(jù)顏色分開，用錫箔紙封裝標記，迅速置于液氮中，處理時間30 min。處理完成后的樣品放置于-80 ℃超低溫冰箱，備用。轉運過程中采用足量干冰以保持恒定溫度，以避免樣品產生劇烈物質變化。

對樣品顏色進行定性比較，第1 組顏色鑒定為紫藍色，編號為Z1～Z3；第2 組顏色確定為粉色，編號為F1～F3。所有樣品經西藏自治區(qū)藏醫(yī)院達娃頓珠副主任藥師鑒定為甘青青蘭Dracocephalum tanguticumMaxim.的花。

1.2 儀器與試劑

SQP型電子天平 [賽多利斯科學儀器（北京）有限公司]；SG9200HDT 型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；DW-86L829BPT型醫(yī)用低溫保存箱（青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司）；BL-200SM300L 型防爆冰箱（廣東安菲環(huán)?？萍加邢薰荆?；Tissuelyser-24L 型高通量組織研磨儀（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；5430R 型高速冷凍離心機（艾本德中國有限公司）；超高效液相色譜聯(lián)用四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（UPLC-Q-Exactive-MS/MS）儀 [賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；甲醇、乙腈、甲酸均購自美國Fisher Chemical 公司；屈臣氏超純水；2-氯-苯丙氨酸（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%，批號：J15J7E9147）。

2 方法

2.1 樣品制備

精確稱取樣品100 mg，放置于2 mL 離心管中，液氮預冷，高通量組織研磨儀研磨，研磨充分后，加入提取液 [甲醇-乙腈-水（2∶2∶1）]，含有內標物質2-氯-苯丙氨酸（0.1 mg·mL-1）。隨后進行渦旋、振蕩，超聲處理。4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min（離心半徑為10 cm），取上清液，過0.22 μm 濾膜，置于2 mL 棕色液相進樣瓶中，通過UPLC-QExactive-MS/MS 進行分析。所有樣品提取物在分析期間均保存在4 ℃條件下，同時，將所有樣本的提取液等比例混合作為質量控制（QC）樣本，每6 個檢測樣本插入1個QC 樣本進行檢測，以監(jiān)測儀器分析的穩(wěn)定性。

2.2 UPLC-Q-Exactive-MS/MS分析條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～11.0 min，95%～5%A；11.0～12.0 min，5%A；12.0～12.1 min，5%～95%A；12.1～15.0 min，95%A）；流速為0.4 mL·min-1；進樣量為5 μL；柱溫為40 ℃。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正、負離子模式，掃描質量范圍為m/z70～1050，ESI 加熱溫度為500 ℃，離子源Gas1 和Gas2 壓力分別為50、50 psi（1 psi≈6.895 kPa），Curtain Gas 壓力為30 psi，離子噴霧電壓浮動（ISVF）在負離子模式下為-3 kV，在正離子模式下為3 kV，MS/MS 去簇電壓為80 V，碰撞能量（CE）為20～60 eV。

2.3 代謝物鑒定

經UPLC-Q-Exactive-MS/MS 檢測后，將原始數(shù)據(jù)導入代謝組學處理軟件Progenesis QI v2.0.5542進行基線過濾、峰識別、積分、tR校正、峰對齊，最終得到1 個tR、m/z和峰強度的數(shù)據(jù)矩陣。保留至少1 組樣品中非零值80%以上的變量；對原始數(shù)據(jù)進行缺失值填充值（原始矩陣中最小值填補空缺值）；對總峰進行歸一化處理，并刪除QC 樣本RSD≥30%的變量；對數(shù)據(jù)進行對數(shù)轉換得到最終用于后續(xù)分析的數(shù)據(jù)矩陣。利用精確的質譜、質譜片段譜和同位素比值差在人體代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB，https://hmdb.ca）中進行搜索鑒定。

2.4 統(tǒng)計分析

采用主成分分析（PCA）觀察各樣品之間的總體分布和組間的離散程度，推測組內樣本的相似性和組間樣本的差異性。采用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）區(qū)分各組間代謝輪廓的總體差異，根據(jù)P值（P<0.01）和log2FC（FC 為差異倍數(shù)）值篩選組間的差異代謝物。

2.5 差異代謝物通路分析

將差異代謝物注釋到京都基因與基因組百科全書（KEGG，http://www.genome.jp/kegg/）、人類代謝組數(shù)據(jù)庫（HMDB，https://hmdb.ca）和小分子通路數(shù)據(jù)庫（SMPDB，http://smpdb.ca/），獲得代謝物在數(shù)據(jù)庫的注釋信息，利用MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca）進行差異代謝物的代謝途徑和富集情況表征，并統(tǒng)計其在數(shù)據(jù)庫的注釋情況。

3 結果與分析

3.1 顏色差異

花朵顏色是植物重要且基礎的理化特征之一，對植物的生長發(fā)育起到重要作用，對于植物的生殖生長、抵御外界環(huán)境脅迫、引誘害蟲天敵均具有重要作用。根據(jù)顏色比對分析，可以看出甘青青蘭花朵顏色存在顯著差異（圖1），通過植物照片可以看出，兩者之間除了花朵顏色差異外，花瓣形狀和大小、苞片和輪傘花序及形成的間斷穗狀花序類型基本無差異。

圖1 不同顏色的甘青青蘭花

3.2 代謝物的鑒定

甘青青蘭樣本檢測完成的數(shù)據(jù)經Progenesis QI軟件分析處理，并經過HMDB 數(shù)據(jù)庫進行搜庫鑒定分析，在正、負離子模式下共鑒定得到560 個代謝物。基于HMDB 分析，甘青青蘭中的代謝物主要包括脂類和類脂類223 個、含氧有機物77 個、苯丙素和聚酮76 個、有機雜環(huán)化合物74 個、有機酸及其衍生物59 個、苯環(huán)衍生物31 個、含氮有機物10 個、核苷/核苷酸和類似物4 個、木脂素/新木脂素及相關化合物4 個、烴類衍生物1 個、生物堿及其衍生物1 個。樣本中占比最高的為脂類和類脂類（39.82%），其次為含氧有機物類（10.54%）、苯丙素和聚酮類、有機雜環(huán)化合物，其他包括有機酸及其衍生物、苯環(huán)衍生物及含氮有機物等占比較少。

通過對化合物進行具體分析發(fā)現(xiàn)，在紫藍色花中含量排名前10 位的化合物為刺槐素-7-[芹糖基-(1→6) -葡萄糖苷] {acacetin-7-[apiosyl-(1→6) -glucoside]，圖2}、L-2-氨基-3-亞甲基己酸（L-2-amino-3-methylenehexanoic acid）、藥芹二糖苷B（graveobioside B）、L-組氨醇（L-histidinol）、棕櫚酸（palmitic acid）、N1,N10-二香豆?；鶃喚罚∟1,N10-dicoumaroylspermidine，圖2）、芹菜苷（apiin）、苯基膦酸（phenylphosphonic acid）、鹿花菌素（gyromitrin）、xi-10-羥基十八烷酸（xi-10-hydroxyoctadecanoic acid）。在粉色花中含量前10 位的化合物為N1,N10-二香豆酰基亞精胺、刺槐素-7-[ 芹糖基-(1→6) -葡萄糖苷]、藥芹二糖苷B（graveobioside B）、L-2-氨基-3-亞甲基己酸、羥基洋艾烯內酯（hydroxypelenolide）、L-組氨醇、黃麻脂肪酸F（corchorifatty acid F）、棕櫚酸、蓖麻油酸（ricinoleic acid）和日當藥黃素（swertiajaponin）。

圖2 不同顏色甘青青蘭花中代表性化合物化學結構

不同花色花朵樣本中共有的化合物為刺槐素-7-[芹糖基-(1→6)-葡萄糖苷]、L-2-氨基-3-亞甲基己酸、藥芹二糖苷B、L-組氨醇、棕櫚酸和N1,N10-二香豆?；鶃喚贰?/p>

3.3 代謝物的相關性分析

為了了解不同顏色甘青青蘭樣品之間代謝物的變異程度，依據(jù)不同樣本間代謝物表達情況對樣本進行PCA，結果見圖3。紫藍色花和粉色花的代謝數(shù)據(jù)矩陣見圖3A。經過Hotelling 的T2分析，確定所有樣本均分布在95%置信區(qū)間內（圖3B）。在PCA圖的6 個主成分解釋了總方差值的94.05%，而第1個主成分方差貢獻率高達50.28%，可對不同花色花朵樣本進行區(qū)分（圖3C）。在PCA圖中，2個分析組和QC 組分離良好，且樣本之間分離度很好，表明這些組之間的代謝存在顯著差異（圖3A）。此外，QC樣本的不同生物學重復樣品緊密聚集在一起，表明分析過程中系統(tǒng)穩(wěn)定性好、分析可靠性高。圖3D系統(tǒng)評價了各組內代謝物的成分和含量分布，紫藍色花組和粉色花組組內顯示出明顯的組聚類趨勢，組間個體代謝物分布的顯著差異表明紫藍色花和粉色花之間存在顯著的生物學差異。本研究中應用的儀器分析穩(wěn)定可靠，得到的代謝物數(shù)據(jù)矩陣可用于后續(xù)分析。

圖3 不同顏色甘青青蘭花中代謝物的PCA得分

3.4 甘青青蘭代謝物的OPLS-DA

依據(jù)前述結果對所得數(shù)據(jù)模型進行OPLS-DA，使用OPLS-DA 可以使樣本之間的微小差異最大化，以利于篩選差異代謝物。在OPLS-DA 中（圖4），R2和模型預測能力（Q2）越接近1，模型擬合精度越高，反之亦然。根據(jù)圖4 可知，左側的R2和Q2的模擬值小于右上角的原始模型，表明原始模型是有效和可靠的，且未過度擬合。由這些結果表明，OPLS-DA 模型具有很好的預測能力，可用于進一步篩選差異代謝物。

圖4 不同顏色甘青青蘭花中代謝物的OPLS-DA置換檢驗

3.5 甘青青蘭顯著性差異代謝物的分析

甘青青蘭不同花色代謝組學樣本相關性熱圖和差異代謝物火山圖見圖5。對不同顏色花朵的甘青青蘭樣本檢測所得的560 個代謝物進行相關性熱圖表征。圖5A 中每個色條表示2 個樣本之間的相關性，不同顏色代表樣本間相關系數(shù)的相對大小，聚類長度表示樣本間相對距離的遠近，同一聚類樹上的樣本相似性更接近。依據(jù)樣本相關性聚類熱圖可以看出，紫藍色花組和粉色花組之間代謝物積累模式存在明顯變化，但組內無差異無統(tǒng)計學意義（圖5A）。根據(jù)火山圖（圖5B）對560 個代謝物進行差異分析和表征，上調代謝物為120個，下調代謝物為59個，其余差異無統(tǒng)計學意義。

圖5 不同顏色甘青青蘭花中代謝物聚類熱圖和差異代謝物火山圖

3.6 甘青青蘭差異代謝物代謝途徑和富集分析

對紫藍色花和粉色花甘青青蘭樣品鑒定出的179 個差異代謝物進行進一步篩選分析，設置篩選條件為變量重要性投影（VIP）值>1，且P<0.01，數(shù)據(jù)經Progenesis QI 處理，并經過HMDB 數(shù)據(jù)庫搜庫鑒定分析，共篩選出33個差異代謝物（圖6）。這些差異代謝物中上調代謝物20 個，下調代謝物13個。

圖6 不同顏色甘青青蘭花中33個差異代謝物

將33 個差異代謝成分進行KEGG 通路富集分析，其主要富集到苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成；泛醌和其他萜類化合物-醌生物合成；不飽和脂肪酸的生物合成；酪氨酸代謝；嘌呤代謝5 條代謝通路（圖7A）。通路富集主要與氨基酸苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸有關，這三者與色素生成有關[39]。其中，酪氨酸酶是色素細胞中黑色素生物合成的關鍵和限速酶[40]，苯丙氨酸在體內可以在苯丙氨酸羥基酶的催化下轉化為酪氨酸。并且，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸屬于結構和化學特征相似的芳香族氨基酸，表明這3 個氨基酸之間可能存在代謝上的交互作用。證明了紫藍色花與粉色花甘青青蘭樣本相比，其色素相關代謝通路存在差異，佐證了顏色差異的來源。同時，差異通路富集到含有不飽和結構和共軛結構，推測這些代謝物可能與花色顏色差異有關[41-42]。

圖7 不同顏色甘青青蘭花中差異代謝物的代謝通路富集

基于SMPDB 藥物途徑代謝物數(shù)據(jù)庫，將33 個代謝物進行注釋和富集（圖7B）分析，其主要富集到依普利酮作用途徑、雙硫侖作用途徑、巰嘌呤作用途徑、硫鳥嘌呤作用途徑、硫唑嘌呤作用途徑。依普利酮作用途徑和雙硫侖作用途徑富集率較高，表明其花色差異可能與功效[43]存在一定關聯(lián)。

4 討論與結論

本研究采用UPLC-Q-Exactive-MS/MS 結合PCA和OPLS-DA 等統(tǒng)計分析方法，對甘青青蘭不同花色的次生代謝產物進行了分析比較。研究結果表明，6個甘青青蘭樣品在正、負2 個離子模式下共定性得到560 個代謝物，歸為11 類，其中脂類和類脂類分子最為豐富。紫藍色花和粉色花中相對含量最高的代謝物分別為刺槐素-7-[芹糖基-(1→6)-葡萄糖苷] 和N1,N10-二香豆?；鶃喚贰Ｆ涔灿谐煞肿貦八崾且环N飽和脂肪酸，是血液中含量最高的游離脂肪酸[44]，通過激活蛋白磷酸酶2A（PP2A）減少內皮型一氧化氮合成酶（eNOS）Ser1177磷酸化、降低eNOS活性及細胞內NO含量[45]。芹菜苷是芹菜中芹菜素的主要存在形式之一，具有緩解結腸炎的效果[46]。紫藍色花和粉色花的代謝物存在顯著差異，從2 種不同顏色的花中共鑒定出差異代謝物33 個，與粉色花相比，紫藍色花中共有20個代謝物上調，13個代謝物下調。KEGG 通路分析發(fā)現(xiàn)差異代謝物被富集到縮醛磷脂合成、苯丙氨酸和酪氨酸代謝、長鏈飽和脂肪酸的線粒體β-氧化、酪氨酸代謝、嘌呤代謝5 個代謝通路中，相關通路富集到的差異成分[39,42]與其不飽和結構[41]可能與顏色差異有關?；赟MPDB 藥物途徑代謝物數(shù)據(jù)庫進行注釋和富集，其主要富集到依普利酮、雙硫侖、巰嘌呤、硫鳥嘌呤、硫唑嘌呤等作用途徑，依普利酮作用途徑富集率最高。依普利酮是鹽皮質激素受體（MR）拮抗劑，可有效降低高血壓等心血管疾病[43]。這也說明了紫藍色花和粉色花的甘青青蘭存在一定的功效差異，后期可通過進一步實驗驗證。