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    四種常用化學消毒劑對豬2型圓環(huán)病毒殺滅效果研究

    2018-02-26 13:31:16儲玉雙李紅英黃小紅
    湖北畜牧獸醫(yī) 2018年12期

    儲玉雙 李紅英 黃小紅

    摘要:試驗應(yīng)用復合碘制劑、2%戊二醛消毒液、優(yōu)氯凈消毒粉(二氯異氰尿酸鈉)、苯扎溴銨四種常用的化學消毒劑對豬2型圓環(huán)病毒殺滅效果進行研究,采用病毒滴定、中和劑鑒定及病毒滅活試驗進行檢測。結(jié)果表明,二氯異氰尿酸鈉的殺滅效果最好,其次是戊二醛,復合碘制劑也有一定的殺毒作用,苯扎溴銨消毒液的殺滅效果最差,建議將二氯異氰尿酸鈉和戊二醛作為控制豬2型圓環(huán)病毒的消毒劑,可有效防止豬2型圓環(huán)病毒的傳播。

    關(guān)鍵詞:化學消毒劑;豬2型圓環(huán)病毒;殺滅效果

    中圖分類號:S858.28? ? ? ? 文獻標識碼:A? ? ? ? 文章編號:1007-273X(2018)12-0005-02

    豬圓環(huán)病毒(PCV)按照致病性的有無分為1型和2型,PCV1被認為不具備致病性,具有致病性的

    PCV2被認為同豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)等疫病有關(guān)[1]。豬圓環(huán)病毒是無囊膜病毒,也稱裸病毒,是目前發(fā)現(xiàn)的動物疾病中最小的病毒,通常裸病毒很難消滅,所以一定要使用有效消毒劑才能殺滅裸病毒。對該類病毒,許多消毒劑如酚制劑、陽離子表面活性劑、季銨鹽類等的使用效果不理想或沒有效果。目前市場上真正稱得上是廣譜高效消毒劑的有碘制劑、甲醛、戊二醛及二氯異氰尿酸鈉(DCCNa)等,能夠殺滅各種細菌、芽孢、真菌、囊膜病毒和非囊膜病毒等,試驗選擇復合碘制劑、2%戊二醛消毒液、優(yōu)氯凈消毒粉(二氯異氰尿酸鈉,DCCNa)、苯扎溴銨四種消毒劑來殺滅豬2型圓環(huán)病毒,比較其消毒效果,旨在為豬2型圓環(huán)病毒的預防提供參考。

    1? 材料與方法

    1.1? 毒株與細胞

    豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)由江西農(nóng)業(yè)大學實驗室分離鑒定、保存和提供。不含PCV1和PCV2的豬腎細胞PK(15)由本實驗室培養(yǎng)傳代保存。

    1.2? 主要試劑

    復合碘制劑、戊二醛消毒液、優(yōu)氯凈消毒粉(5%二氯異氰尿酸鈉)、苯扎溴銨四種消毒劑購買自江西匯康實業(yè)有限公司。甘氨酸為河南特康生物科技有限公司,吐溫80為Sigma產(chǎn)品,細胞培養(yǎng)試劑中DMEM培養(yǎng)基購自Sigma公司。無菌胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。復合碘制劑和優(yōu)氯凈消毒粉(5%二氯異氰尿酸鈉)的中和劑為0.1 mol/L硫代硫酸鈉的磷酸鹽緩沖溶液(PBS);戊二醛消毒液的中和劑為0.3%吐溫80+0.1%甘氨酸的PBS;苯扎溴銨為季銨鹽類消毒劑,它的中和劑為卵磷脂+吐溫80+組氨酸[2]。

    1.3? 主要儀器

    電熱恒溫水浴鍋,芬蘭百得實驗室儀器(中國)有限公司;超凈工作臺,蘇凈集團安泰公司;振蕩培養(yǎng)箱,廣東醫(yī)療器械廠;培養(yǎng)箱,廣東醫(yī)療器械廠;電子天平,YP202N型,上海精密科學儀器有限公司;96孔培養(yǎng)板。

    1.4? 方法

    1.4.1? 病毒滴定的方法? 將PCV2病毒株用細胞維持液(1%血清的DMEM培養(yǎng)基)進行10倍系列稀釋(101~106),分別接種于PK(15)細胞(96孔培養(yǎng)板)中,每個稀釋度接種8孔,置于37 ℃、50% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每日觀察細胞病變的結(jié)果,連續(xù)觀察3 d,按Reed-Muench法計算該病毒的半數(shù)細胞感染劑量(TCID50)[3],每次試驗重復3次,計算標準差。

    1.4.2? 中和劑鑒定試驗? 試驗共分為6組,第1-3組為中和劑,后3組為陰性對照,分別為細胞維持液、標準硬水、PBS,混勻接種3~4 h后觀察細胞生長情況。

    1.4.3? 病毒滅活試驗? 用標準硬水將消毒劑按待測濃度的1.5倍稀釋成試驗用的消毒劑,將0.5 mL待測消毒劑置(20±1) ℃水浴30 min,再吸加0.5 mL各病毒懸液,混勻。待作用至試驗規(guī)定的滅活病毒時間(5、10、20 min),立即取出0.1 mL,加入含0.9 mL中和劑混勻,作用10 min,作系列稀釋后,吸取樣液,接種于單層細胞培養(yǎng)板上,每個滴度接種4孔;陽性對照組,用0.6 mL無菌去離子水代替消毒劑,將細胞培養(yǎng)板置37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱中,吸附1~2 h后,將細胞培養(yǎng)板內(nèi)液體棄去,在板內(nèi)加入細胞維持液,37 ℃二氧化碳孵箱培養(yǎng)5 d,分別測定不同濃度消毒劑、不同作用時間對PCV2的殺滅效果,試驗重復3次。

    1.4.4? 豬圓環(huán)病毒耐藥性試驗? 將400 mg/L復合碘溶液、250 mg/L戊二醛消毒液、150 mg/L有效氯的復方二氯異氰尿酸鈉及 40 g/L的苯扎溴銨溶液間隔30、90、120 d使用,分組別長期作用豬圓環(huán)病毒,對兔進行靜脈注射,判斷各組別的豬圓環(huán)病毒耐藥性產(chǎn)生的時間及變化情況。

    2? 結(jié)果與分析

    2.1? 中和劑對PK(15)細胞生長狀況的影響

    中和劑對PK(15)細胞生長狀況的影響見圖1。由圖1可知,各中和劑沒有影響細胞的生長,與對照組相當,表明選用的中和劑及形成的中和產(chǎn)物對PK(15)細胞無毒害作用。

    2.2? 四種消毒劑對PCV2的殺滅效果

    結(jié)果表明,以含400 mg/L復合碘溶液對豬圓環(huán)病毒作用5 min,滅活率為100%;以200 mg/L復合碘溶液作用10 min,滅活率為99.99%(表1)。

    250 mg/L戊二醛消毒液、150 mg/L DCCNa及40 g/L的苯扎溴銨溶液與豬圓環(huán)病毒作用5 min,滅活率均可達到100%(表2、表3、表4)。

    2.3? PCV2耐藥性

    豬圓環(huán)病毒耐藥性研究結(jié)果表明,250 mg/L戊二醛和150 mg/L DCCNa抗毒性強,體溫無變化,120 d未產(chǎn)生耐藥性;400 mg/L復合碘有一定的抗毒性,120 d使用較易產(chǎn)生耐藥性;40 g/L的苯扎溴銨抗毒差,120 d使用更易產(chǎn)生耐藥性(表5)。

    3? 小結(jié)

    四種常用消毒劑在相同的濃度和試驗條件下(溫度、相對濕度、酸堿度等)殺滅豬圓環(huán)病毒,以DCCNa的殺滅效果最好,其次是戊二醛,復合碘制劑也有一定的殺滅作用,苯扎溴銨消毒液的殺滅效果最差。四種消毒劑的消毒效果與文獻報道相一致[4],建議將DCCNa和戊二醛作為控制豬圓環(huán)病毒的消毒劑。該方法與秦濤等[5]的研究方法近似,結(jié)果滿意。

    中和劑鑒定試驗表明,四種中和劑安全可靠,無毒副作用,中和劑對PCV2在PK(15)細胞中的增殖無顯著抑制作用。文獻研究表明決定中和劑選擇結(jié)果好壞的關(guān)鍵不在于試驗病毒 ,而在其宿主培養(yǎng)細胞, 即能否選出對試驗細胞無毒或毒性較小的中和劑和中和產(chǎn)物[6]。

    PCV2耐藥性研究結(jié)果表明,戊二醛和DCCNa抗毒性強,復合碘有一定的抗毒性,苯扎溴銨抗毒性差。該結(jié)果與秦秀慧等[7]的戊二醛復合消毒劑對豬病病毒殺滅效果的研究結(jié)果相一致。經(jīng)查詢文獻資料,關(guān)于消毒劑對豬圓環(huán)病毒消毒效果及耐藥性的研究較少,本研究可為養(yǎng)豬場預防疾病及消毒劑選擇提供參考。

    參考文獻:

    [1] 司興奎,郭? 鑫,楊漢春.豬圓環(huán)病毒2型感染后血清抗體及組織中病毒含量的動態(tài)變化[J].中國獸醫(yī)雜志,2009,45(7):24-26.

    [2] 韓? 杰,魏秋華.化學消毒劑的中和劑的研究現(xiàn)狀[J].中國消毒雜志,2013,30(12):1165-1168.

    [3] REED L J,MUENCH H.A simple method of estimating fifty percent endpoints[J].American Journal of Hygiene,1938,27:493-497.

    [4] 楊滿軍.9種商業(yè)消毒劑對豬2型圓環(huán)病毒的殺滅效能測試[J].今日養(yǎng)豬業(yè),2009(3):13-16.

    [5] 秦? 濤,汪川韋,石寶蘭,等.四種常用消毒劑對H5N6亞型禽流感病毒滅活效果的研究[J].中國獸醫(yī)科學,2018,48(9):1139-1145.

    [6] 薄玉霞,SYED A S .評價化學消毒劑對病毒滅活效果的中和劑選擇試驗[J].中國消毒學雜志,2007,24(6):523-524.

    [7] 秦秀慧,張? 冰,李? 軍,等.戊二醛復合消毒劑對豬病病毒殺滅效果的研究[J].中國實驗動物學報,2002,10(2):117-119.

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