犬細粒棘球絳蟲糞抗原間接夾心ELISA檢測方法的建立

王永斌 ，伏剛 ，趙揚揚 ，賴茂林 ，陳千林 ，曹政 ，3*

（1.重慶市巫溪縣畜牧獸醫(yī)局，重慶 巫溪 405800；2.重慶澳龍生物制品有限公司，重慶 榮昌 402460；3.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460）

棘球蚴（包蟲）病是由細粒棘球絳蟲（Eg）中絳期所引起的一種世界性分布的人畜共患寄生蟲病。犬是包蟲病傳播的重要傳染源，因此，控制犬感染細粒棘球絳蟲是防治包蟲病的關(guān)鍵措施。本研究建立了診斷犬細粒棘球絳蟲感染的雙抗體夾心ELISA方法，該方法抗原制備簡單、免疫原性強、制備量大，具有較好的特異性和敏感性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 犬糞樣品 犬糞采自四川省石渠縣、道孚縣、爐霍縣。

1.1.2 實驗動物 試驗所用兔子、BALB/C小鼠均由重慶澳龍生物制品有限公司提供，并在其實驗動物房開展相關(guān)試驗。

1.2 方法

1.2.1 特異性表面抗原SMZ-OVA的制備 將特異性表面抗原SMZ-OVA基因序列送至基因公司合成，上游插入EcoR I酶切位點，下游插入Sal I酶切位點，連接到pET-32a（+）表達載體。采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法[1]將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta，使用氨芐青霉素（Amp）和氯霉素平板篩選陽性克隆，挑選陽性克隆子擴大培養(yǎng)，誘導(dǎo)并驗證表達情況。

1.2.2 抗體制備 首免用法國Seppic公司的ISA 15A VG佐劑將特異性表面抗原SMZ-OVA制成免疫抗原，以100 μg/mL濃度皮下注射4只實驗兔（每只1 mL），同時將細粒棘球絳蟲蟲卵以300枚/mL皮下注射4只BALB/C小鼠（每只1mL）。21d和42d后，分別重復(fù)免疫一次?？贵w效價達到要求后，收集全血，4000r/min離心10min，收集血清，置-70℃凍存。

1.2.3 抗體純化 取8 mL抗體，8 500 r/min離心30min；取上清，逐滴加入50%飽和度的硫酸銨溶液4 mL，邊加邊攪拌，4℃過夜；8 500 r/min，4℃離心3min；取上清，在磁力攪拌器上向燒杯中逐滴加入50%飽和度的硫酸銨溶液4 mL，4℃條件下過夜；8500r/min，4℃條件下離心30min，棄上清，將沉淀溶于3mL PBS緩沖液中，再倒入處理好的透析袋中，磁力攪拌，4℃條件下透析過夜；用移液器取出透析袋中的IgG，分裝到1.5mL離心管中，-40℃條件下保存[2]。

1.3 間接夾心ELISA檢測步驟 用包被緩沖液將純化的BALB/C小鼠腹水抗體稀釋至8μg/mL，然后加入96孔酶標(biāo)板中（100mL/孔），4℃放置過夜；棄去板孔中的溶液，加入稀釋好的洗滌液（200 mL/孔），靜置1min后倒掉，再在吸水紙上拍干，共計洗滌3次；加入封閉液（0.1%BSA+PBS，200 μL/孔），置 37℃下溫育2h，棄去板孔中的溶液，加入稀釋好的洗滌液（200μL/孔），靜置1min后倒掉，再在吸水紙上拍干，共計洗滌3次；將1∶1稀釋的待檢樣品、陰性對照樣品和陽性對照樣品各取100μL加至抗原包被板中，輕輕振勻，置37℃下溫育30min，棄去板孔中的溶液，加入稀釋好的洗滌液（200 μL/孔），靜置 1 min 后倒掉，再在吸水紙上拍干，共計洗滌3次；每孔加兔血清稀釋至30μg/mL，置37℃下溫育30min，棄去板孔中的溶液，加入稀釋好的洗滌液（200 μL/孔），靜置1min后倒掉，再在吸水紙上拍干，共計洗滌3次；將山羊抗兔酶標(biāo)二抗以1∶6 000比例稀釋，按照100 μL/孔加入酶標(biāo)板，置37℃下溫育 30 min，棄去板孔中的溶液，加入稀釋好的洗滌液（200mL/孔），靜置1min后倒掉，再在吸水紙上拍干，共計洗滌3次；在每個反應(yīng)孔中加入等體積的底物A液與底物B液（100 μL），避光顯色10min，待顯色結(jié)束后于每個反應(yīng)孔中加入50μL終止液，10min內(nèi)測定OD450nm值。

1.4 結(jié)果判定 同時滿足陽性對照OD450nm平均值≥0.60，陽性對照OD450nm平均值≥陰性對照OD450nm平均值×2.1，方可進行判定。

陽性判定：樣品OD450nm值＞陰性對照OD450nm平均值×2.1。

陰性判定：樣品OD450nm值≤陰性對照OD450nm平均值×2.1。

2 結(jié)果

2.1 犬糞細粒棘球絳蟲卵陽性樣品的制備 先后收集了30只牧羊犬的糞便樣品，運用飽和食鹽水蟲卵漂浮法[3]進行鏡檢，初步篩選陽性樣品。鏡檢結(jié)果如表1所示。

表1 犬糞樣品鏡檢結(jié)果

用飽和食鹽水溶液漂浮蟲卵時，分別在30min、60 min、90min、120 min、150 min、180min 參照麥克馬斯特法計數(shù)[4]。30min時，蟲卵上浮較慢（平均25個）；60 min時略有升高（平均30個）；90 min時，仍然沒有漂浮完全（平均47個）；120 min時，蟲卵的漂浮與富集均達到頂峰（平均60個）；150min時，蟲卵開始下沉（平均54個）；180min時，蟲卵個數(shù)基本保持不變，不再上浮和下沉（平均57個）。結(jié)果石渠縣檢出8份陽性樣品，道孚縣檢出7份陽性樣品，爐霍縣檢出7份陽性樣品。

2.2 特異性抗原純化 特異性抗原純化效果如圖1所示。用鏡檢出的細粒棘球絳蟲蟲卵免疫BALB/C小鼠，用純化出的特異性表面抗原免疫兔，分別收集小鼠腹水和兔高免血清，純化高免抗體。

2.3 兔抗高免血清滴度檢測結(jié)果 見表2。

2.4 BALB/C小鼠腹水抗體含量測定結(jié)果 見表3。根據(jù)計算結(jié)果取兔抗血清蛋白濃度為90000μg/mL。

2.5 間接夾心ELISA檢測 采用間接ELISA方法檢測從四川省石渠縣、道孚縣、爐霍縣等地采集的30份糞便樣品，結(jié)果如表4、表5所示。

圖1 特異性表面抗原SDS-PAGE圖

2.6 鏡檢結(jié)果和間接夾心ELISA檢測結(jié)果符合情況 根據(jù)表5算出兩種方法的陽性符合率為86.36%，總體符合率為90%。

3 小結(jié)

用飽和食鹽水蟲卵漂浮法檢測出19個犬糞樣品中含有細粒棘球絳蟲蟲卵，表明本次犬糞樣品篩選較成功。用該法富集蟲卵的最佳時間點是在靜置120min時。犬細粒棘球絳蟲糞抗原間接夾心ELISA方法的檢測結(jié)果與漂浮蟲卵法的鏡檢結(jié)果陽性符合率為86.36%，總體符合率為90%，說明該ELISA方法構(gòu)建成功。本試驗為后期研制犬細粒棘球絳蟲糞抗原間接夾心ELISA檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

[1]郭全海，陳陸，王川慶，等.兩步化學(xué)轉(zhuǎn)化法構(gòu)建豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因重組腺病毒質(zhì)粒[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（5）：48-50.

[2]陳丹，孫廣瑞，柳增善.辛酸-硫酸銨聯(lián)合沉淀法在單克隆抗體純化中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（26）：8105-8105.

[3]岳進巧，張彤，馬秀敏，等.一種犬糞便中腸道寄生蟲蟲卵檢查方法的建立[J].西部醫(yī)學(xué)，2012，24（2）：221-223.

[4]余爐善，孫國清，時國軍.三角錐瓶漂浮集卵法計數(shù)家畜線蟲卵的試驗報告[J].江西畜牧獸醫(yī)雜志，1989（4）：10-11.

表2 兔抗高免血清滴度檢測結(jié)果（OD450nm值）

表3 腹水抗體含量測定結(jié)果

表4 犬糞樣品間接夾心ELISA檢測結(jié)果

表5 鏡檢結(jié)果與間接夾心ELISA檢測結(jié)果比較