王永斌 ,伏剛 ,趙揚揚 ,賴茂林 ,陳千林 ,曹政 ,3*
(1.重慶市巫溪縣畜牧獸醫(yī)局,重慶 巫溪 405800;2.重慶澳龍生物制品有限公司,重慶 榮昌 402460;3.重慶市畜牧科學(xué)院,重慶 榮昌 402460)
棘球蚴(包蟲)病是由細粒棘球絳蟲(Eg)中絳期所引起的一種世界性分布的人畜共患寄生蟲病。犬是包蟲病傳播的重要傳染源,因此,控制犬感染細粒棘球絳蟲是防治包蟲病的關(guān)鍵措施。本研究建立了診斷犬細粒棘球絳蟲感染的雙抗體夾心ELISA方法,該方法抗原制備簡單、免疫原性強、制備量大,具有較好的特異性和敏感性。
1.1 材料
1.1.1 犬糞樣品 犬糞采自四川省石渠縣、道孚縣、爐霍縣。
1.1.2 實驗動物 試驗所用兔子、BALB/C小鼠均由重慶澳龍生物制品有限公司提供,并在其實驗動物房開展相關(guān)試驗。
1.2 方法
1.2.1 特異性表面抗原SMZ-OVA的制備 將特異性表面抗原SMZ-OVA基因序列送至基因公司合成,上游插入EcoR I酶切位點,下游插入Sal I酶切位點,連接到pET-32a(+)表達載體。采用化學(xué)轉(zhuǎn)化法[1]將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至Rosetta,使用氨芐青霉素(Amp)和氯霉素平板篩選陽性克隆,挑選陽性克隆子擴大培養(yǎng),誘導(dǎo)并驗證表達情況。
1.2.2 抗體制備 首免用法國Seppic公司的ISA 15A VG佐劑將特異性表面抗原SMZ-OVA制成免疫抗原,以100 μg/mL濃度皮下注射4只實驗兔(每只1 mL),同時將細粒棘球絳蟲蟲卵以300枚/mL皮下注射4只BALB/C小鼠(每只1mL)。21d和42d后,分別重復(fù)免疫一次??贵w效價達到要求后,收集全血,4000r/min離心10min,收集血清,置-70℃凍存。
1.2.3 抗體純化 取8 mL抗體,8 500 r/min離心30min;取上清,逐滴加入50%飽和度的硫酸銨溶液4 mL,邊加邊攪拌,4℃過夜;8 500 r/min,4℃離心3min;取上清,在磁力攪拌器上向燒杯中逐滴加入50%飽和度的硫酸銨溶液4 mL,4℃條件下過夜;8500r/min,4℃條件下離心30min,棄上清,將沉淀溶于3mL PBS緩沖液中,再倒入處理好的透析袋中,磁力攪拌,4℃條件下透析過夜;用移液器取出透析袋中的IgG,分裝到1.5mL離心管中,-40℃條件下保存[2]。
1.3 間接夾心ELISA檢測步驟 用包被緩沖液將純化的BALB/C小鼠腹水抗體稀釋至8μg/mL,然后加入96孔酶標板中(100mL/孔),4℃放置過夜;棄去板孔中的溶液,加入稀釋好的洗滌液(200 mL/孔),靜置1min后倒掉,再在吸水紙上拍干,共計洗滌3次;加入封閉液(0.1%BSA+PBS,200 μL/孔),置 37℃下溫育2h,棄去板孔中的溶液,加入稀釋好的洗滌液(200μL/孔),靜置1min后倒掉,再在吸水紙上拍干,共計洗滌3次;將1∶1稀釋的待檢樣品、陰性對照樣品和陽性對照樣品各取100μL加至抗原包被板中,輕輕振勻,置37℃下溫育30min,棄去板孔中的溶液,加入稀釋好的洗滌液(200 μL/孔),靜置 1 min 后倒掉,再在吸水紙上拍干,共計洗滌3次;每孔加兔血清稀釋至30μg/mL,置37℃下溫育30min,棄去板孔中的溶液,加入稀釋好的洗滌液(200 μL/孔),靜置1min后倒掉,再在吸水紙上拍干,共計洗滌3次;將山羊抗兔酶標二抗以1∶6 000比例稀釋,按照100 μL/孔加入酶標板,置37℃下溫育 30 min,棄去板孔中的溶液,加入稀釋好的洗滌液(200mL/孔),靜置1min后倒掉,再在吸水紙上拍干,共計洗滌3次;在每個反應(yīng)孔中加入等體積的底物A液與底物B液(100 μL),避光顯色10min,待顯色結(jié)束后于每個反應(yīng)孔中加入50μL終止液,10min內(nèi)測定OD450nm值。
1.4 結(jié)果判定 同時滿足陽性對照OD450nm平均值≥0.60,陽性對照OD450nm平均值≥陰性對照OD450nm平均值×2.1,方可進行判定。
陽性判定:樣品OD450nm值>陰性對照OD450nm平均值×2.1。
陰性判定:樣品OD450nm值≤陰性對照OD450nm平均值×2.1。
2.1 犬糞細粒棘球絳蟲卵陽性樣品的制備 先后收集了30只牧羊犬的糞便樣品,運用飽和食鹽水蟲卵漂浮法[3]進行鏡檢,初步篩選陽性樣品。鏡檢結(jié)果如表1所示。
表1 犬糞樣品鏡檢結(jié)果
用飽和食鹽水溶液漂浮蟲卵時,分別在30min、60 min、90min、120 min、150 min、180min 參照麥克馬斯特法計數(shù)[4]。30min時,蟲卵上浮較慢(平均25個);60 min時略有升高(平均30個);90 min時,仍然沒有漂浮完全(平均47個);120 min時,蟲卵的漂浮與富集均達到頂峰(平均60個);150min時,蟲卵開始下沉(平均54個);180min時,蟲卵個數(shù)基本保持不變,不再上浮和下沉(平均57個)。結(jié)果石渠縣檢出8份陽性樣品,道孚縣檢出7份陽性樣品,爐霍縣檢出7份陽性樣品。
2.2 特異性抗原純化 特異性抗原純化效果如圖1所示。用鏡檢出的細粒棘球絳蟲蟲卵免疫BALB/C小鼠,用純化出的特異性表面抗原免疫兔,分別收集小鼠腹水和兔高免血清,純化高免抗體。
2.3 兔抗高免血清滴度檢測結(jié)果 見表2。
2.4 BALB/C小鼠腹水抗體含量測定結(jié)果 見表3。根據(jù)計算結(jié)果取兔抗血清蛋白濃度為90000μg/mL。
2.5 間接夾心ELISA檢測 采用間接ELISA方法檢測從四川省石渠縣、道孚縣、爐霍縣等地采集的30份糞便樣品,結(jié)果如表4、表5所示。
圖1 特異性表面抗原SDS-PAGE圖
2.6 鏡檢結(jié)果和間接夾心ELISA檢測結(jié)果符合情況 根據(jù)表5算出兩種方法的陽性符合率為86.36%,總體符合率為90%。
用飽和食鹽水蟲卵漂浮法檢測出19個犬糞樣品中含有細粒棘球絳蟲蟲卵,表明本次犬糞樣品篩選較成功。用該法富集蟲卵的最佳時間點是在靜置120min時。犬細粒棘球絳蟲糞抗原間接夾心ELISA方法的檢測結(jié)果與漂浮蟲卵法的鏡檢結(jié)果陽性符合率為86.36%,總體符合率為90%,說明該ELISA方法構(gòu)建成功。本試驗為后期研制犬細粒棘球絳蟲糞抗原間接夾心ELISA檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
[1]郭全海,陳陸,王川慶,等.兩步化學(xué)轉(zhuǎn)化法構(gòu)建豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因重組腺病毒質(zhì)粒[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2010(5):48-50.
[2]陳丹,孫廣瑞,柳增善.辛酸-硫酸銨聯(lián)合沉淀法在單克隆抗體純化中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2007,35(26):8105-8105.
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表2 兔抗高免血清滴度檢測結(jié)果(OD450nm值)
表3 腹水抗體含量測定結(jié)果
表4 犬糞樣品間接夾心ELISA檢測結(jié)果
表5 鏡檢結(jié)果與間接夾心ELISA檢測結(jié)果比較