任攀,劉情,李文文,劉亞剛
(西南民族大學生命科學與技術(shù)學院,四川 成都 610041)
鴨病毒性腸炎(DVE)又名鴨瘟,鴨瘟病毒(DPV)是該病的病原,屬于皰疹病毒科(為雙股DNA),具有皰疹病毒的基本特征[1]。胸苷激酶(TK)基因是大部分皰疹病毒復(fù)制的非必需基因,是皰疹病毒的主要毒力基因之一。研究表明,TK基因具有皰疹病毒早期基因的典型特征[2],其編碼的胸苷激酶在胸腺嘧啶合成補救途徑中是必不可少的。皰疹病毒TK基因缺失后表現(xiàn)出在神經(jīng)細胞的復(fù)制能力明顯減弱,但其免疫原性不變,因而TK基因是皰疹病毒構(gòu)建缺失疫苗的首選靶基因[3]。本研究通過對鴨瘟病毒強、弱毒株TK基因的克隆與生物信息學分析,為進一步明確DPV TK基因的功能提供了依據(jù)。
1.1 毒株和質(zhì)粒 DPV AV 1221株購于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,DPV雞胚化弱毒疫苗株購于廣西麗原生物股份有限公司,PMD-19T Vector購于天根生化科技有限公司。
1.2 主要試劑 DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提取試劑盒、感受態(tài)細胞JM109均購于天根生化科技有限公司,Phusion High-Fidelity PCR Kit購于 New England Biolabs公司。
1.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank上收錄的DPV基因序列,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計出特異性引物(由擎科生物公司合成),用于DPV TK基因的擴增。引物序列F1為5′-CGCGGATCCTCAC TGCGCGACTCTTGCGA,R1 為 5′-CCCAAGCTTATTA ATTGTCATCTCGGTAT。
1.4 病毒DNA提取 按照酚-氯仿-異戊醇法提取DNA,提取的DPV DNA置于-20℃保存。
1.5 TK基因的PCR擴增 以提取的DNA為模板,根據(jù)設(shè)計的特異性引物進行PCR擴增,反應(yīng)體系如下:DNA 模板 2.5 μL,1μM 上下游引物各 2.5μL,5×Phusion Buffer 10 μL,10 μM dNTPs 1 μL,Phusion DNA Polymerase 0.5μL,ddH2O 31 μL。PCR 反應(yīng)條件:98℃預(yù)變性 30 s;95℃變性 10 s,55℃退火 30 s,72℃延伸35s,共30個循環(huán);最后72℃延伸8 min,16℃保存。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定,用DNA純化回收試劑盒進行回收。
1.6 TK基因的克隆及鑒定 將回收TK基因的PCR產(chǎn)物與載體PMD-19T連接,構(gòu)建重組克隆載體,并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞JM 109,再接種于含X-gal、Amp(50mg/μL)和 IPTG 的平板上,經(jīng)藍白斑篩選,挑取白色菌落接種于含Amp(50 mg/μL)的LB液體培養(yǎng)基中,37℃擴大培養(yǎng)。菌液PCR鑒定:根據(jù)質(zhì)粒小提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒,重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定。
1.7 TK基因的序列測定及生物信息學分析 將陽性質(zhì)粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,同時對TK基因的核苷酸序列及其所推測氨基酸序列進行生物信息學分析。
1.8 TK基因序列的相似性分析 對本次所測的2株鴨瘟病毒TK基因序列進行BLAST分析,然后從GeneBank上下載鴨瘟病毒不同分離株的TK基因序列,然后通過Megalign程序進行相似性分析。
2.1 DPV強、弱毒株TK基因擴增 結(jié)果見圖1。圖中在約1077bp處出現(xiàn)特異性條帶,與預(yù)期大小符合,說明擴增成功。
圖1DPV的PCR檢測結(jié)果
2.2 DPV TK基因重組質(zhì)粒鑒定 經(jīng)PCR驗證為陽性的重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定,在約1077bp及2651bp位置處出現(xiàn)特異性條帶,與預(yù)期結(jié)果一致(圖2),表明重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建成功。
2.3 DPV TK基因的生物信息學分析
2.3.1 DPV強、弱毒株TK基因同源性分析 將測序得到的兩組序列用BioXM軟件進行對比分析,得出兩片段的同源性高達100%。
2.3.2 胸苷激酶理化性質(zhì)分析 預(yù)測胸苷激酶由358個氨基酸組成,理論等電點pI為6.03。
2.3.3 蛋白親水性分析 胸苷激酶的疏水性分析結(jié)果顯示:胸苷激酶為親水性蛋白,但該蛋白N端(158~162aa)有一明顯的高疏水區(qū)域。
圖2 TK基因重組質(zhì)粒的鑒定結(jié)果
2.3.4 DPV胸苷激酶的二級結(jié)構(gòu)及跨膜分析 分析結(jié)果顯示,胸苷激酶中α螺旋占50.28%,延伸鏈占11.45%,無規(guī)則卷曲占38.27%。根據(jù)Burhard理論推斷出該蛋白屬于混合型蛋白。胸苷激酶的跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果顯示,胸苷激酶的全部氨基酸均位于細胞膜外部。
2.3.5 信號肽預(yù)測 胸苷激酶的信號肽預(yù)測顯示,氨基酸的信號肽分值(S-score)均低于閾值,可以判定胸苷激酶中沒有信號肽成分,不是分泌蛋白。
2.3.6 DPV胸苷激酶的抗原表位和B淋巴細胞抗原結(jié)合表位分析 抗原表位分析結(jié)果顯示,胸苷激酶的平均抗原趨向性為1.0277,共包含有14個可能的抗原表位,其中第11位至第30位氨基酸形成的抗原表位“IRRAFSVPSMPLCLVRVYLD”具有最高的抗原指數(shù)。使用Bcepred在線工具預(yù)測胸苷激酶的B淋巴細胞抗原結(jié)合表位,結(jié)果共發(fā)現(xiàn)7個B細胞結(jié)合表位,見圖3。
圖3 DPV胸苷激酶的B細胞表位預(yù)測
2.3.7 TK基因序列的相似性分析 本研究中2株鴨瘟病毒的TK基因之間的相似性為100%,與GeneBank上TK基因序列的最高相似性為99.8%~100%。
本研究對DPV強、弱毒株的TK基因進行了克隆、測序,得出兩片段的同源性高達100%,通過與其他不同來源的鴨瘟病毒株進行比對,發(fā)現(xiàn)其同源性也達到了99.8%~100%,說明TK基因具有高度保守性。而樊振華等[4]、Kit等[5]敲除病毒的TK基因,可使毒株毒力下降,說明TK基因?qū)Σ《径玖Φ挠绊懞艽?。鴨瘟病毒TK基因的高度保守性,意味著利用TK蛋白作為包被抗原建立的ELISA方法難以用來區(qū)分野毒感染與疫苗感染,并且TK基因不是導(dǎo)致鴨瘟強、弱毒株致病性差異的主要因素[6]。
生物信息學是生物學領(lǐng)域發(fā)展最為快速的學科,具有高效、可預(yù)見性和綜合性強的優(yōu)點[7]。本試驗通過對TK蛋白進行生物信息學分析,結(jié)果顯示:TK蛋白為親水性,但其中所含高疏水性區(qū)域的氨基酸主要用于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu),猜測與胸苷激酶活性有關(guān)[8];通過Burhard理論推斷TK蛋白的二級結(jié)構(gòu),認為該蛋白屬于混合型蛋白;跨膜區(qū)預(yù)測表明,DPV TK蛋白是膜外蛋白,說明TK蛋白不介導(dǎo)DPV對宿主細胞的吸附和轉(zhuǎn)染,同時也從側(cè)面證明了TK基因是DPV復(fù)制的非必需基因;信號肽預(yù)測得出該蛋白沒有信號肽成分,不是分泌蛋白;抗原表位分析顯示,TK蛋白具有最高的抗原指數(shù);使用Bcepred在線工具預(yù)測胸苷激酶的B淋巴細胞抗原結(jié)合表位,共發(fā)現(xiàn)7個B細胞結(jié)合表位,表明TK蛋白擁有較高的抗原性。
本研究通過預(yù)測TK蛋白的性質(zhì)和功能,為蛋白的表達及抗原性鑒定提供了理論支持。
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