乳酸菌在抗病原微生物感染中的作用

趙曉雨，李 夢(mèng),唐金秀,朱洪偉,張建龍,姜琳琳,黃清榮,于 馨 ,張興曉

(魯東大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264025)

乳酸菌是一類(lèi)可以發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱，屬革蘭陽(yáng)性菌(G+),通常包括乳桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)等。乳酸菌作為益生菌中的主要分類(lèi)具有多種重要生理功能，如維持腸道微生態(tài)的平衡、促進(jìn)腸道蠕動(dòng)消化、抗高血壓[1]、降低血清膽固醇[2]、黏附或降解有害物質(zhì)等。1907年，俄國(guó)微生物學(xué)家Metchnikoff最先發(fā)現(xiàn)乳酸菌具有抑制腐敗細(xì)菌生長(zhǎng)及增強(qiáng)機(jī)體免疫力的功效。此后，乳酸菌在抑制病原微生物感染中的作用逐漸被重視。乳酸菌可通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫力、直接抑制病原微生物、增強(qiáng)上皮細(xì)胞屏障功能等途徑抑制細(xì)菌和病毒感染。本文綜述了乳酸菌在抗病原微生物感染中的作用。

1 增強(qiáng)機(jī)體免疫力

1.1 乳酸菌通過(guò)增強(qiáng)固有免疫抵御病原微生物感染

固有免疫是宿主防御病原微生物感染的第一道防線。固有免疫系統(tǒng)由具有免疫防御功能的體液因子和固有免疫細(xì)胞構(gòu)成。其中體液因子包括抗菌肽、溶菌酶、補(bǔ)體系統(tǒng)、細(xì)胞因子和趨化因子等。固有免疫細(xì)胞主要包括吞噬細(xì)胞(包括單核/巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞)、NK細(xì)胞、T細(xì)胞、Bl細(xì)胞、NKT細(xì)胞、肥大細(xì)胞等。

乳酸菌可通過(guò)誘導(dǎo)固有免疫體液因子產(chǎn)生和增強(qiáng)固有免疫細(xì)胞功能來(lái)抵御病原微生物感染。天然抗菌肽不僅具有選擇性免疫激活和調(diào)節(jié)功能，而且具有廣譜抗菌活性[3]，可以殺滅革蘭陰性細(xì)菌、革蘭陽(yáng)性細(xì)菌、真菌、寄生蟲(chóng)等。研究表明，植物乳桿菌ATCC 8014分泌的抗菌肽Tet213和細(xì)菌素對(duì)金黃色葡萄球菌、血鏈球菌和銅綠假單胞菌均有較強(qiáng)的抑制作用[4]。Gupta等[5]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌LR/14產(chǎn)生的抗菌肽AMPs LR14能夠抑制惡性瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)及由其引起的溶血現(xiàn)象。鼠李糖乳糖桿菌、乳酸球菌、明串珠球菌可使褐鱒血清溶菌酶水平顯著升高，抗菌能力顯著增強(qiáng)[6]。補(bǔ)體參與機(jī)體非特異性免疫的主要作用機(jī)制是通過(guò)裂解直接殺死病原菌。研究表明，給魚(yú)類(lèi)直接投喂乳酸菌可提高其自然補(bǔ)體的活性[7]。此外，乳酸菌還可以誘導(dǎo)增強(qiáng)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性，提高活性氧、活性氮含量及單核/巨噬細(xì)胞的吞噬能力[8]。Matsusaki[9]等發(fā)現(xiàn)，口服植物乳桿菌06CC2可以有效誘導(dǎo)腸道部位IFN-γ的產(chǎn)生，激活腸道免疫反應(yīng)。進(jìn)一步的研究表明，乳桿菌06CC2可以通過(guò)活化NK細(xì)胞促進(jìn)IFN-γ的分泌。Zelaya等[10]用熱滅活的鼠李糖乳酸桿菌CRL1510(Lr1510)對(duì)小鼠連續(xù)鼻腔給藥，然后用流感病毒進(jìn)行感染，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，細(xì)胞因子IL-10和I型干擾素分泌顯著增強(qiáng)，并且能引發(fā)小鼠抗病毒免疫反應(yīng)和TLR3免疫反應(yīng)，顯著降低了小鼠因流感病毒引起的肺損傷。Kechaou等[11]通過(guò)大規(guī)模的篩選，確定了一種新型的候選乳桿菌株—植物乳桿菌CNRZ1997，能夠有效誘導(dǎo)小鼠外周血單核細(xì)胞IL-8和IL-12等炎癥因子的分泌，抑制IL-10的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體抗流感病毒的免疫應(yīng)答，顯著降低體內(nèi)病毒滴度。在大鼠李斯特單增菌感染模型中，唾液乳桿菌BGHO1可顯著誘導(dǎo)小腸絨毛部位和派氏結(jié)部位固有免疫分子CD14、IL-1 和TNF-α的表達(dá)，增強(qiáng)抗細(xì)菌免疫應(yīng)答，降低體內(nèi)細(xì)菌載量[12]。

1.2 乳酸菌通過(guò)增強(qiáng)適應(yīng)性免疫抵御病原微生物感染

適應(yīng)性免疫主要包括體液免疫和細(xì)胞免疫。體液免疫由B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體所介導(dǎo)。這些抗體包括IgA、IgG、IgM、IgE和IgD五種，能夠識(shí)別并結(jié)合抗原、介導(dǎo)免疫細(xì)胞活性、調(diào)理吞噬等。Waki等[13]將凍干的短乳桿菌KB290通過(guò)灌胃的方式免疫小鼠，然后用流感病毒IFV對(duì)小鼠進(jìn)行鼻內(nèi)感染，結(jié)果表明，感染前口服KB290不僅能夠顯著提高IFN-α的分泌水平，而且能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性IFV-IgA，從而減輕IFV引起的臨床癥狀。此外，發(fā)酵乳桿菌CJL-112能夠通過(guò)刺激巨噬細(xì)胞、Th1細(xì)胞產(chǎn)生大量的IgA誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)來(lái)保護(hù)小鼠免受流感病毒IFV的侵染[14]。給豚鼠口服能夠表達(dá)口蹄疫病毒(FMDV)蛋白VP1的乳酸桿菌菌株NC8和WCFS1，能夠顯著誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高水平抗原特異性IgG、IgA、IgM、黏膜分泌型IgA(sIgA)及中和抗體，增強(qiáng)體液免疫，有利于預(yù)防和治療口蹄疫病毒感染[15]。在流感病毒感染中，Kikuchi等[16]從140株能夠誘導(dǎo)小腸派氏結(jié)產(chǎn)生IgA抗體的乳酸桿菌菌株中篩選出了1株乳酸菌AYA，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，給小鼠口服乳酸菌AYA可顯著誘導(dǎo)派氏結(jié)中DC細(xì)胞分泌IL-6，進(jìn)而促進(jìn)IgA+B細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，并產(chǎn)生大量IgA，增強(qiáng)腸道黏膜免疫功能。此外，該乳桿菌也能誘導(dǎo)肺部IgA的產(chǎn)生。

乳酸菌除了可以促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體外，還能增強(qiáng)機(jī)體針對(duì)病原微生物的細(xì)胞免疫應(yīng)答。肺炎病毒感染中，在肺黏膜部位利用植物乳桿菌L.plantarumBAA-793對(duì)小鼠進(jìn)行免疫，可顯著誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、DC細(xì)胞及淋巴細(xì)胞募集至感染部位，通過(guò)增強(qiáng)抗原遞呈和特異性免疫應(yīng)答以降低病毒滴度。同時(shí)，該乳桿菌可明顯抑制肺炎病毒誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)[17]。Yang等[18]使用能夠表達(dá)H9N2禽流感病毒相關(guān)蛋白NP-M1-DCpep的重組乳酸菌口服疫苗NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep對(duì)雞進(jìn)行免疫，再予H9N2病毒感染。結(jié)果表明，該重組乳酸菌可顯著增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫，同時(shí)提高黏膜分泌型sIgA和IgG水平，對(duì)雞具有良好的保護(hù)效果。

綜上，乳酸菌可以通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體固有免疫和適應(yīng)性免疫促進(jìn)機(jī)體對(duì)細(xì)菌和病毒的清除作用，以抵御病原微生物的感染(圖1)。

圖1 乳酸菌通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫力抵御病原微生物感染Fig.1 Lactic acid bacteria can resist the infection of pathogenic microorganisms by enhance the immunity of the organism

2 抑制病原微生物

2.1 與病毒結(jié)合抑制病毒吸附

病毒的復(fù)制周期主要包括吸附、穿入、脫殼、生物合成、組裝和釋放這幾個(gè)連續(xù)過(guò)程。吸附是病毒與宿主細(xì)胞相互作用的第一步，是病毒感染致病的前提。乳酸菌可以直接與病毒表面分子結(jié)合抑制病毒吸附于易感細(xì)胞表面。人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)可選擇性感染表達(dá)CD4分子的細(xì)胞，如CD4+T細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等。這些細(xì)胞表面的CD4分子可以和HIV囊膜蛋白gp120結(jié)合，介導(dǎo)病毒吸附至細(xì)胞表面。Su等[19]研究發(fā)現(xiàn)，干酪乳酸菌393(L.casei393)表面也存在著CD4受體，可以直接結(jié)合HIV表面的gp120蛋白，占據(jù)其與CD4+細(xì)胞結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而抑制HIV吸附和感染宿主細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)表明，L.casei393可顯著抑制TZM-bl細(xì)胞感染HIV-1，且抑制率高達(dá)60%～70%，提示乳酸桿菌可以通過(guò)直接結(jié)合病毒以降低機(jī)體病毒滴度。

2.2 競(jìng)爭(zhēng)占位作用

乳酸菌除了能夠與病毒結(jié)合抑制病毒對(duì)細(xì)胞的吸附外，還能夠和宿主細(xì)胞表面相結(jié)合，減少病原菌的黏附位點(diǎn)，從而減弱致病菌與腸黏膜間的相互作用[20]，這種作用方式也叫競(jìng)爭(zhēng)作用或空間位阻效應(yīng)。體外競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)和取代實(shí)驗(yàn)表明，卷曲乳酸桿菌K313和K243可明顯抑制沙門(mén)氏菌H9812和大腸埃希菌ATCC25922對(duì)腸上皮細(xì)胞HT-29的黏附，提示乳酸菌能夠和腸道病原菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而抑制病原菌的黏附和感染[21]。Garriga等[22]篩選了5株乳酸菌，發(fā)現(xiàn)其中鼠李糖乳桿菌CTC1679和米酒乳桿菌CTC494具有較強(qiáng)的結(jié)合HT-29細(xì)胞的能力，進(jìn)而抑制李斯特單增菌黏附于細(xì)胞表面。此外，從泡菜中分離的乳酸菌嗜酸乳桿菌GK20、副干酪乳桿菌GK74和胚牙乳桿菌GK81能夠與鼠傷寒沙門(mén)氏菌競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2表面結(jié)合位點(diǎn)，導(dǎo)致鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染能力顯著降低[23]。

2.3 產(chǎn)生代謝產(chǎn)物發(fā)揮抑制作用

乳酸菌可產(chǎn)生有機(jī)酸、過(guò)氧化氫、安息香酸、溶菌酶等物質(zhì)對(duì)病原微生物發(fā)揮抑制作用[24]。乳酸菌產(chǎn)生的乳酸、乙酸等有機(jī)酸能夠降低腸道pH值、鰲合金屬離子、改變腸道黏膜的通透性，從而抑制病毒增殖和病原菌感染。Nahui等[25]從健康女性陰道內(nèi)提取了5株乳桿菌，實(shí)驗(yàn)表明，這幾株乳桿菌均能通過(guò)產(chǎn)生乳酸和介導(dǎo)介質(zhì)的酸化顯著抑制HIV-1的感染。此外，卷曲乳桿菌L.crispatusT79-3、T90-1和詹氏乳桿菌L.jensenii118-3、T231-1產(chǎn)生的乳酸對(duì)陰道內(nèi)寄生的大腸埃希菌的生長(zhǎng)和定殖有顯著抑制作用[26]，植物乳桿菌L.plantarumMTCC 2621產(chǎn)生的乳酸對(duì)金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)有顯著抑制作用[27]。此外，保加利亞乳桿菌和唾液鏈球菌代謝產(chǎn)生的乳酸對(duì)代表性口臭致病菌牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌也有明顯的抑制作用[28]。

除乳酸外，乳酸菌還可以分泌過(guò)氧化氫提高宿主抗菌肽(溶菌酶和乳鐵蛋白)的活性和上皮細(xì)胞的抗菌活性，以保護(hù)陰道不受感染[29]，且宿主體內(nèi)過(guò)氧化氫濃度的變化和乳酸菌代謝產(chǎn)物溶菌酶的活性對(duì)大腸埃希菌的抑菌作用成正比[30]。此外，有些乳酸菌還可以產(chǎn)生細(xì)菌素，可直接作用于病原微生物，抑制其感染和增殖。乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素對(duì)淋病奈瑟氏菌的生長(zhǎng)有抑制作用[31]。植物乳桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素可以抑制肉桿菌、金黃色釀膿葡萄球菌、銅綠假單胞菌、李斯特菌和沙門(mén)氏菌的生長(zhǎng)繁殖[32]。有些乳酸菌還可以產(chǎn)生胞外多糖，吸附病毒表面受體臨近的分子，降低病毒對(duì)細(xì)胞的氧化損傷。例如將乳酸菌培養(yǎng)上清與雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)共同孵育后再用雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)進(jìn)行感染，可以顯著提高細(xì)胞的抗氧化能力，推測(cè)可能是乳酸菌培養(yǎng)上清中的多糖吸附細(xì)胞表面病毒受體鄰近的分子，產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)而減少病毒對(duì)細(xì)胞的吸附和在細(xì)胞內(nèi)的增殖，從而降低了病毒對(duì)細(xì)胞的氧化損傷[33]。不僅如此，胞外多糖可以誘導(dǎo)小鼠樹(shù)突狀細(xì)胞的成熟，進(jìn)而誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫應(yīng)答[34]。另外，乳酸菌可以分泌胞外多肽抑制革蘭陰性菌胞壁成分LPS介導(dǎo)的炎性損傷，并且這種抑制作用是NF-κB和p38MAPK信號(hào)通路依賴的[35]。 乳酸菌可分泌抗菌肽，增強(qiáng)固有免疫抑制細(xì)菌感染。

綜上，乳酸菌可通過(guò)與病毒表面位點(diǎn)結(jié)合抑制病毒吸附至易感細(xì)胞表面、與細(xì)菌競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合腸上皮細(xì)胞位點(diǎn)或產(chǎn)生抑制性代謝產(chǎn)物等途徑發(fā)揮抑制病原微生物感染宿主細(xì)胞的作用(表1)。

3 增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞屏障功能

腸上皮屏障包括腸上皮細(xì)胞(IECs)表面的理化屏障、上皮細(xì)胞層、上皮細(xì)胞間的緊密連接(tight junctions,TJs)。IECs一方面可以分泌堿性磷酸酶(intestinal alkaline phosphatase,IAP)、抗菌肽及黏蛋白，在腸道上皮細(xì)胞表面形成一層理化屏障，防止病原微生物黏附，另一方面可通過(guò)TJs調(diào)控細(xì)胞旁路運(yùn)輸，以維持上皮完整性。從犬腸道中分離的嗜酸乳桿菌LAB20有較強(qiáng)的黏附能力，能夠通過(guò)增加跨膜電阻(Transepithelial electrical resistance，TER)來(lái)增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞的屏障功能，而且該菌株還具有抗炎能力，能夠誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞IL-8的分泌[36]。

3.1 促進(jìn)黏蛋白分泌

腸道上皮細(xì)胞中的杯狀細(xì)胞可分泌富含黏蛋白的黏液，將IECs與病原微生物隔離，抑制致病菌在腸上皮定植。此外，黏液中含有與上皮細(xì)胞表面細(xì)菌結(jié)合受體相似的蛋白分子，與細(xì)菌結(jié)合后抑制其在上皮細(xì)胞的定植。實(shí)驗(yàn)表明，乳酸菌可誘導(dǎo)HT29細(xì)胞表達(dá)黏蛋白3(mucin 3，MUC3)，增強(qiáng)乳酸菌和細(xì)胞之間的黏附，從而減少病原菌對(duì)細(xì)胞的黏附[37]。同樣，嗜酸乳桿菌能夠通過(guò)促進(jìn)黏蛋白2的分泌抑制大腸埃希菌O157∶H7對(duì)HT29細(xì)胞的黏附[38]。

3.2 促進(jìn)緊密連接形成

緊密連接是由細(xì)胞膜構(gòu)成的一個(gè)細(xì)胞間緊密相連的區(qū)域，是多種蛋白組成的復(fù)合蛋白，具有降低上皮細(xì)胞通透性，隔離水分、電解質(zhì)和病原微生物的作用。病原微生物感染可破壞細(xì)胞間的緊密連接，增加腸道通透性，導(dǎo)致細(xì)菌或病毒進(jìn)入機(jī)體。Beck等[39]利用比目魚(yú)模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，飼喂乳球菌BFE920可促進(jìn)腸道分泌IL-10、TGF-β 等免疫調(diào)節(jié)分子，進(jìn)而促進(jìn)閉合蛋白和緊密連接的形成，降低腸道通透性，對(duì)遲鈍愛(ài)德華菌感染具有良好保護(hù)作用。胚芽乳桿菌DSM 2648能夠通過(guò)增強(qiáng)緊密連接完整性降低大腸埃希菌O127∶H6感染[40]。

3.3 抑制腸道上皮細(xì)胞凋亡

腸道上皮細(xì)胞的完整性對(duì)于機(jī)體抵御病原微生物的感染至關(guān)重要，乳酸菌能夠通過(guò)多種機(jī)制抑制IECs的凋亡，維持細(xì)胞的完整。有研究表明，加氏乳桿菌SF1183能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116中周期調(diào)控蛋白p21的表達(dá)將細(xì)胞周期阻止于G1期，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡[41]。鼠李糖乳桿菌LGG及其培養(yǎng)上清可以通過(guò)活化Akt抗凋亡信號(hào)通路和抑制p38MAPK促凋亡信號(hào)通路抑制腸上皮細(xì)胞的凋亡[42-43]。

表1 乳酸菌抑制病原微生物作用及其機(jī)制Table 1 Inhibitory effect of lactic acid bacteria on pathogenic microorganisms and its mechanism

4 結(jié) 語(yǔ)

乳酸菌抗病原微生物的作用最終取決于乳酸菌、病原微生物和宿主三者之間的復(fù)雜相互關(guān)系。隨著對(duì)乳酸菌研究的深入，人們篩選出了更多具有抗菌抗病毒作用的菌株，菌株的抗病毒譜也已由最初的輪狀病毒(RV)擴(kuò)展到HIV、流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)、水泡性口炎病毒(VSV)等。本實(shí)驗(yàn)室前期研究中從感染并耐過(guò)禽流感病毒H9N2的雞鼻腔黏液中分離出1株唾液乳桿菌和1株植物乳桿菌，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該菌對(duì)流感病毒的復(fù)制具有明顯抑制作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，這種抑制作用與其高疏水性及對(duì)上皮細(xì)胞的高黏附性密切相關(guān)。但是，有關(guān)該乳桿菌與流感病毒的結(jié)合位點(diǎn)及抗病毒機(jī)理尚需進(jìn)一步研究。近年來(lái)乳酸菌作為新型微生態(tài)制劑廣泛用于治療臨床疾病，但尚存在諸多問(wèn)題。有報(bào)道稱益生菌可引起細(xì)菌異位，增加重癥急性胰腺炎的死亡風(fēng)險(xiǎn)[44]，而且部分乳酸菌攜帶可轉(zhuǎn)移耐藥基因，增加腸道菌群中耐藥性水平轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[45]。此外，乳酸菌抗病原微生物的細(xì)胞學(xué)機(jī)制和分子學(xué)機(jī)制尚未完全闡明，臨床中如何更好地利用乳酸菌對(duì)感染性疾病進(jìn)行治療仍需進(jìn)一步探索。