CRISPR-Cas9技術(shù)在細(xì)菌中的研究進(jìn)展及應(yīng)用

信 欣，陳麗杰，薛 闖

(大連理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116023)

1 CRISPR-Cas技術(shù)的發(fā)展歷史

1987年，Ishino等[1]在研究大腸埃希菌中負(fù)責(zé)堿性磷酸酶同功酶轉(zhuǎn)化的iakkp基因及其側(cè)翼區(qū)的染色體DNA片段的核苷酸序列時(shí)，在iap的3′末端側(cè)翼區(qū)域發(fā)現(xiàn)不尋?，F(xiàn)象：5個(gè)29 bp高度同源的核苷酸序列分別被32 bp的非同源片段所間隔，由于當(dāng)時(shí)在原核生物的其他區(qū)域沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與這些序列同源的序列，這些序列的生物學(xué)意義無(wú)從得知，但該現(xiàn)象引起了學(xué)者們的廣泛關(guān)注。1995年，Mojica等[2]經(jīng)過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，這種串聯(lián)重復(fù)序列(TREPs)在細(xì)胞周期中發(fā)揮重要的作用，與復(fù)制子的分配及其功能都有密切關(guān)系。后來(lái)，在許多細(xì)菌及古生菌中發(fā)現(xiàn)了這種現(xiàn)象。2000年，Mojica等[3]經(jīng)過(guò)基因組測(cè)序等檢測(cè)，在不同的原核生物中發(fā)現(xiàn)了與上述相似的重復(fù)元件，它們的共同特點(diǎn)主要在于布局：被具有恒定長(zhǎng)度的中間序列間隔開(kāi)，故將其看作一個(gè)“家族”，并將該“家族成員”稱為Short Regularly Spaced Repeats(SRSRs)。SRSRs通常長(zhǎng)24～40 bp，含有高達(dá)11 bp的內(nèi)部和末端反向重復(fù)序列，該部分保守區(qū)域被認(rèn)為可能對(duì)其功能有重要意義。直到2002年，Jansen等[4]進(jìn)一步確定這種重復(fù)序列僅存在于原核生物(細(xì)菌和古細(xì)菌)中，不存在于真核生物或病毒中，其家族特征是21～37 bp的直接重復(fù)，被相似大小的非重復(fù)序列間隔，為了明確表明這一特征以區(qū)分其他重復(fù)類型，將此類序列正式命名為CRISPR，即Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(譯為成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列)，并鑒定出4種CRISPR相關(guān)(cas)基因，指出cas基因與CRISPR基因座具有功能關(guān)系,但該系統(tǒng)的具體功能仍處于探索和研究階段。2005年，Bolotin等[5]發(fā)現(xiàn)CRISPR具有染色體以外來(lái)源的間隔物，因此指出CRISPR在細(xì)菌基因組中的表觀穩(wěn)定性和廣泛存在可能是由于其對(duì)外來(lái)DNA侵襲的保護(hù)作用；Mojica等[6]則表明CRISPR與免疫靶向外源DNA有關(guān)；Pourcel等[7]則稱CRISPR提供了一個(gè)新的強(qiáng)大的識(shí)別工具。后來(lái)，經(jīng)過(guò)許多學(xué)者的大量研究，明確了CRISPR的功能：參與細(xì)菌對(duì)外來(lái)遺傳物質(zhì)及噬菌體抵御。因?yàn)樵谠獾饺肭趾?，?xì)菌會(huì)整合來(lái)自噬菌體等基因組序列作為新的間隔區(qū)，使細(xì)菌本身對(duì)其具有“免疫”性，特異性間隔區(qū)的去除和添加也關(guān)系著細(xì)胞的噬菌體抗性表型[8]。CRISPR發(fā)揮作用的方式類似于真核生物中的RNA干擾(RNAi)，通過(guò)與靶mRNA的堿基互補(bǔ)配對(duì)來(lái)促進(jìn)其降解或翻譯終止[9]。2008年，Marraffini等[10]發(fā)現(xiàn)CRISPR-Cas系統(tǒng)可以在其天然細(xì)菌或古細(xì)菌環(huán)境以外發(fā)揮作用，也就是說(shuō)，其功能不僅限于噬菌體防御，在保護(hù)遺傳多樣性方面具有更廣泛的作用，這一成果也進(jìn)一步為后期CRISPR-Cas9系統(tǒng)發(fā)展為新的基因編輯工具奠定了基礎(chǔ)。隨著CRISPR系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)、功能等特點(diǎn)日漸清楚，2013年該系統(tǒng)被華裔科學(xué)家Cong等和Mail等率先應(yīng)用于人類和哺乳動(dòng)物小鼠胚胎干細(xì)胞的基因編輯中，從此CRISPR-Cas9系統(tǒng)作為一種新的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)進(jìn)入人們的視線且被廣泛應(yīng)用[11-12]。

2 CRISPR-Cas系統(tǒng)功能及分類

CRISPR-Cas系統(tǒng)分為三個(gè)不同的功能階段，即適應(yīng)、表達(dá)和干擾[13-15]。在適應(yīng)階段，來(lái)自可移動(dòng)遺傳元件MGEs(mobile genetic elements)的短DNA序列作為間隔區(qū)被整合到CRISPR陣列中[8]。在表達(dá)階段，CRISPR陣列轉(zhuǎn)錄為一個(gè)大的轉(zhuǎn)錄物pre-crRNA，被Cas酶識(shí)別并結(jié)合，并通過(guò)特異性Cas核酸酶或通過(guò)細(xì)胞核糖核酸酶III加工產(chǎn)生較小的成熟CRISPR RNAs(crRNAs)[16-17]。在干擾過(guò)程中，crRNAs引導(dǎo)Cas核酸酶靶向并切割入侵MGEs中的原體間隔序列[18]，從而實(shí)現(xiàn)其防御功能(圖1)。

圖1 CRISPR-Cas系統(tǒng)Ⅱ型免疫過(guò)程機(jī)理Fig.1 The mechanism of the immune process in typeⅡof CRISPR-Cas system

CRISPR-Cas系統(tǒng)分為三種不同類型(I、II和III)。所有類型都包含2個(gè)通用基因：cas1和cas2[19]。Cas1是一種沒(méi)有序列特異性的金屬依賴型DNAse，可以參與將外源DNA(間隔區(qū))整合到CRISPR中的過(guò)程[20-21]，Cas2是金屬依賴性核糖核酸內(nèi)切酶，也參與間隔物整合階段[22]。然而，三種類型的CRISPR-Cas系統(tǒng)在基因組中的組成基本上不同，并且分別由各自的特征基因表征。三種類型的特征基因分別是cas3(編碼含有N端HD超家族核酸酶結(jié)構(gòu)域的超家族2解旋酶)，cas9(編碼含有預(yù)測(cè)的類似RuvC和HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域的大蛋白質(zhì))和cas10 (編碼含有與核酸聚合酶和核苷酸環(huán)化酶的掌域同源結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì))[23]。這三種類型中，CRISPR-Cas系統(tǒng)又可以根據(jù)包括特征基因的不同以及通用基因cas1的系統(tǒng)發(fā)育等因素進(jìn)一步分類為亞型[19,23]。I型和III型系統(tǒng)具有一些共同特征：有專門的Cas核酸內(nèi)切酶處理pre-crRNA，一旦成熟，每個(gè)crRNA參與組裝成能夠識(shí)別和切割與其互補(bǔ)的核酸的大型多Cas蛋白復(fù)合體。相比之下，II型系統(tǒng)通過(guò)不同的機(jī)制處理pre-crRNA，一個(gè)與pre-crRNA中重復(fù)序列互補(bǔ)的tracrRNA通過(guò)針對(duì)特定雙鏈(ds)RNA的核糖核酸酶RNaseⅢ引發(fā)這一過(guò)程[24](圖1)。由于結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，II型CRISPR-Cas系統(tǒng)在三者中最先發(fā)展為高效的基因編輯工具。Cas9具有2個(gè)酶切結(jié)構(gòu)域：HNH結(jié)構(gòu)域和RuvC結(jié)構(gòu)域，分別負(fù)責(zé)靶向DNA序列的2條鏈的切割，當(dāng)同時(shí)存在small guide CRISPR-RNA和trans-activating CRISPR-RNA(crRNA：tracrRNA)時(shí)是有切割活性的。crRNA分子的間隔區(qū)部分負(fù)責(zé)Cas9的特異性，因?yàn)槠渑c靶向原體間隔物的一條鏈具有互補(bǔ)性。Cas9介導(dǎo)的切割需要原體間隔物3′端側(cè)翼的短且保守的前間區(qū)序列鄰近基序(即Protospacer adjacent motif,PAM)[25-26]，該基序?qū)τ诒苊庾陨砻庖呤侵陵P(guān)重要的：在宿主染色體上CRISPR陣列的間隔區(qū)側(cè)翼PAM基序的缺失能夠防止致死的自我靶向事件的發(fā)生[18]。

3 CRISPR-Cas9技術(shù)在細(xì)菌基因編輯中的應(yīng)用

目前，CRISPR-Cas9技術(shù)作為一種基因組定點(diǎn)編輯的新方法，已經(jīng)憑借其低成本、易操作、高效率等優(yōu)勢(shì)被廣大學(xué)者青睞，在動(dòng)物(如斑馬魚(yú)、小鼠、猴子等)、植物(如擬南芥、水稻等)、真菌(如釀酒酵母等)、細(xì)菌(如枯草芽胞桿菌、梭菌等)等生物體內(nèi)均有廣泛應(yīng)用，可用于對(duì)功能基因進(jìn)行篩選、調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平和DNA成像等[27-28]。第一個(gè)用于細(xì)菌的CRISPR-Cas9基因組編輯工具可追溯到2013年，它基于來(lái)自化膿性鏈球菌(Streptococcuspyogenes)II-A型CRISPR-Cas系統(tǒng)(Spy-Cas9)的Cas9核酸內(nèi)切酶[29-32]。大約在同一時(shí)間，SpyCas9也被廣泛地用于真核生物的基因組編輯[12,29,31-32]。在細(xì)菌中，CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因組編輯工具基于2個(gè)組分的異源共表達(dá)：SpyCas9和crRNA：tracrRNA，目前，合理設(shè)計(jì)的嵌合single guide RNA(sgRNA)分子已經(jīng)方便有效地替代了crRNA：tracrRNA[24]，SpyCas9-crRNA：tracrRNA(或SpyCas9-sgRNA)復(fù)合物將DSDBs(double stranded DNA breaks)引入目標(biāo)位點(diǎn)，在這些位點(diǎn)有突變的細(xì)胞會(huì)避免Cas9誘導(dǎo)的DSDBs并存活下來(lái)。而在真核生物中，非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)機(jī)制可以以容易出錯(cuò)的方式修復(fù)DSDBs，在目標(biāo)位點(diǎn)引入插入或缺失突變并避免細(xì)胞死亡。這是因?yàn)?，與所有真核基因組都能編碼NHEJ系統(tǒng)相反，并不是所有細(xì)菌的基因組都能編碼負(fù)責(zé)其NHEJ機(jī)制的酶[33]。這解釋了與真核生物相比，目前基于CRISPR-Cas9的基因編輯應(yīng)用于原核生物中的實(shí)例占少數(shù)的原因。然而，原核染色體的DSDBs可以通過(guò)細(xì)胞同源重組(HR)系統(tǒng)與染色體/質(zhì)粒的模板結(jié)合，或者由一個(gè)異源重組系統(tǒng)和線性單或雙鏈DNA模板來(lái)修復(fù)[18,34]，盡管如此，對(duì)細(xì)菌來(lái)說(shuō)，DSDBs的修復(fù)仍然比較困難。2016年，Komor等[35]通過(guò)對(duì)Cas9蛋白R(shí)uvC和HNH兩結(jié)構(gòu)域進(jìn)行單一或同時(shí)突變，得到了僅能切割一條鏈的Cas9n和僅能與靶序列結(jié)合但無(wú)切割活性dCas9。Cas9n形成的單鏈切割緩解了細(xì)菌修復(fù)DBSBs的壓力，dCas9與靶DNA序列結(jié)合從而阻止其轉(zhuǎn)錄，形成的基因抑制成為一種新的表達(dá)調(diào)控方式[18]。目前，基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)已經(jīng)在許多細(xì)菌內(nèi)實(shí)現(xiàn)了單基因的刪除與整合、多基因的刪除、單核苷酸修飾等應(yīng)用[28,36]。

4 CRISPR-Cas9技術(shù)的問(wèn)題及應(yīng)對(duì)措施

CRISPR-Cas9系統(tǒng)在基因編輯中仍存在著一些問(wèn)題，最突出的問(wèn)題便是難以預(yù)測(cè)的脫靶效應(yīng)(off-targets)。CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠成為基因組編輯的多功能工具，部分原因是由于sgRNA對(duì)與之互補(bǔ)的DNA序列的高效靶向性，sgRNA中最關(guān)鍵的識(shí)別序列一般為20 nt，當(dāng)其與DNA序列相匹配時(shí)，即使該DNA序列含有多余堿基(匹配時(shí)形成部分DNA凸起)或缺失堿基(部分RNA凸起)也有可能被識(shí)別為靶序列，此時(shí)sgRNA會(huì)介導(dǎo)Cas9核酸酶對(duì)靶標(biāo)位點(diǎn)以外的區(qū)域進(jìn)行編輯或調(diào)控，從而產(chǎn)生脫靶效應(yīng)[37-38]。也就是說(shuō)，sgRNA在通過(guò)堿基配對(duì)來(lái)識(shí)別目標(biāo)序列時(shí)，能夠“容忍”一定程度的不完全匹配，針對(duì)sgRNA的“錯(cuò)配容忍度”，一些學(xué)者進(jìn)行了相應(yīng)的研究。Jinek等[24]表示，在“種子序列”(緊鄰PAM的8～10個(gè)核苷酸)內(nèi)的點(diǎn)突變會(huì)消除Cas9核酸酶的裂解，但是該區(qū)域的確切長(zhǎng)度是未知的，并且不清楚種子中任何核苷酸的突變是否都可以破壞sgRNA的靶向識(shí)別。Cong等[12]稱，鄰近PAM 5′端的11 bp片段內(nèi)單堿基失配就會(huì)完全避免Cas9核酸酶對(duì)該位點(diǎn)的切割，而更遠(yuǎn)處的突變對(duì)其靶向活性無(wú)影響。Jiang等[30]報(bào)道只有緊鄰PAM上游的12個(gè)核苷酸中的錯(cuò)配才能消除切割，其中遠(yuǎn)端7～12 bp可耐受大多數(shù)錯(cuò)配，近端位置的1～6 bp片段中，除了3 bp處只有兩種錯(cuò)配會(huì)不同程度地影響切割外，任何核苷酸的不匹配都會(huì)影響切割活性。此外，sgRNA對(duì)靶位點(diǎn)的識(shí)別除了要與其20 nt按要求相匹配以外，PAM序列也是必不可少的。因?yàn)樵趕gRNA“尋找”目標(biāo)序列時(shí)，會(huì)快速自動(dòng)地略過(guò)不含PAM序列的區(qū)域，不會(huì)檢測(cè)其是否符合配對(duì)標(biāo)準(zhǔn)，更不會(huì)被識(shí)別為靶位點(diǎn)[39]。并且，對(duì)于來(lái)自不同物種的Cas9可能會(huì)有不同的PAM序列[40]。由此可見(jiàn)，預(yù)防或減少脫靶效應(yīng)的有效方法是通過(guò)選擇更合適的PAM位點(diǎn)來(lái)確保sgRNA的特異性。

從目前現(xiàn)有的研究成果來(lái)看，為了減少脫靶效應(yīng)，可以采取以下措施：①在設(shè)計(jì)sgRNA時(shí)，要盡量避免sgRNA 中20 nt與潛在的脫靶位點(diǎn)序列的堿基配對(duì)，尤其在靠近PAM序列的區(qū)域要有2個(gè)或2個(gè)以上堿基不配對(duì)，并且要避免二者有連續(xù)或間隔的4個(gè)堿基配對(duì)的原則來(lái)提高其特異性[41]。目前有一些網(wǎng)站和軟件可以設(shè)計(jì)潛在脫靶位點(diǎn)較少或者檢測(cè)已有的sgRNA是否存在較大脫靶風(fēng)險(xiǎn)，如Cas-OFFinder[42]、CHOPCHOP[43-44]、CRISPRdirect[45]、CRISPRscan[46]和CasOT[47]等。②采用雙切口措施，即利用2個(gè)sgRNA介導(dǎo)2個(gè)Cas9n蛋白識(shí)別并分別切割2條單鏈從而形成DSDBs[48]。③利用FokⅠ核酸酶與dCas9融合形成的二聚體，同時(shí)在2條sgRNA的介導(dǎo)下與相互靠近的兩處靶位點(diǎn)結(jié)合，此時(shí)FokⅠ會(huì)在兩蛋白中間發(fā)揮切割作用[49-50]。④研究發(fā)現(xiàn)，噬菌體在進(jìn)化中會(huì)針對(duì)細(xì)菌的CRISPR防御系統(tǒng)“采取一定的措施”，其編碼的抗CRISPR蛋白(Acrs)可以通過(guò)不同策略抑制Cas9，例如AcrIIC1是一種廣譜Cas9抑制劑，通過(guò)與幾種分散的直系同源Cas9的保守HNH催化結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合來(lái)阻止其DNA切割；AcrIIC3抑制單個(gè)Cas9的活性，并誘導(dǎo)其形成二聚體，以防止其與靶DNA的結(jié)合[51]；AcrIIA4則是僅與Cas9-sgRNA復(fù)合物結(jié)合，而不與Cas9蛋白單獨(dú)結(jié)合[52]。并且，CRISPR-Cas9系統(tǒng)精準(zhǔn)識(shí)別并編輯目標(biāo)序列的過(guò)程中，大約1/2在編輯過(guò)程的短時(shí)間內(nèi)(數(shù)小時(shí))完成，而在此后，脫靶的識(shí)別與編輯逐漸增加，因此如果得知準(zhǔn)確編輯的具體時(shí)間，并在此階段結(jié)束后立即加入Acrs，理論上也可以有效地預(yù)防脫靶效應(yīng)的產(chǎn)生。

5 討 論

雖然基于CRISPR-Cas系統(tǒng)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)仍存在著脫靶效應(yīng)、工具質(zhì)粒不穩(wěn)定、Cas9蛋白毒性作用等問(wèn)題，但由于其成本低、操作容易、效率高，而且對(duì)于待編輯序列要求低等優(yōu)點(diǎn)，該技術(shù)已經(jīng)在動(dòng)物、植物和微生物基因編輯上均有應(yīng)用，尤其在哺乳動(dòng)物和人類的多種疾病治療、藥物研究等方面的應(yīng)用越來(lái)越成熟[53-55]。然而，目前該技術(shù)在細(xì)菌等微生物的基因編輯應(yīng)用方面仍需要更深入的探索。

在許多食品、燃料、藥物、工業(yè)原料等重要產(chǎn)品生產(chǎn)過(guò)程中，微生物發(fā)酵法具有環(huán)保、可持續(xù)、產(chǎn)量穩(wěn)定及可控等優(yōu)點(diǎn)，其中應(yīng)用的工程菌株需要具有理想的生成代謝產(chǎn)物的能力，實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)最根本的辦法就是對(duì)菌株進(jìn)行代謝通路的改造或調(diào)控。由于某些菌種具有基因組過(guò)大或過(guò)小、修復(fù)機(jī)制不健全等特點(diǎn)，導(dǎo)致使用傳統(tǒng)的基因編輯方法很難實(shí)現(xiàn)高效率改造，發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量也難有突破性提高，相比之下，CRISPR-Cas9技術(shù)使其有希望解決上述難題。并且，相信隨著廣大學(xué)者對(duì)CRISPR-Cas系統(tǒng)的逐步研究和優(yōu)化，該技術(shù)有望實(shí)現(xiàn)對(duì)所有菌株基因組進(jìn)行高效率定點(diǎn)編輯及對(duì)任何特定基因進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。