緩沖蛋白胨水前增菌對冷鮮雞表面微生物變化的影響

桂國弘，徐 娥，楊 華，陳小敏，溫雪婷，肖英平*

(1．貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江 杭州 310021)

隨著近年來禽流感的不斷爆發(fā)，全國多地市禁止活禽交易，冷鮮雞成為未來生鮮雞肉消費的主要品種，具有廣闊的發(fā)展前景[1]。雞肉營養(yǎng)豐富，適于大多數(shù)細菌生長繁殖，且冷鮮雞從宰殺、運輸、貯藏到消費者餐桌上[2-3]，受到污染的病原菌種類繁多，造成一定的質(zhì)量安全隱患，污染微生物也導(dǎo)致冷鮮雞的貨架期縮短[4-5]。對雞肉中病原菌的檢測，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法或是分子檢測方法基本均需選擇特定的前增菌介質(zhì)進行菌體修復(fù)和富集，以獲得相對豐度較高的目標菌體[6]。常見的非選擇性前增菌介質(zhì)主要是緩沖蛋白胨水(buffer peptone water，BPW)、胰酶大豆肉湯(trypticasesoy broth，TSB)、營養(yǎng)肉湯(nutrient broth，NB)等[7]。其中BPW是食品安全國家標準GB4789.4-2016《食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢驗》和《食品微生物學(xué)檢驗 克羅諾桿菌屬(阪崎腸桿菌)檢驗》 中用于沙門氏菌和克羅諾桿菌屬檢驗的前增菌液，也廣泛用于其他微生物的增菌中。BPW營養(yǎng)相對匱乏，Mackey等[8]認為菌體修復(fù)過程不需要營養(yǎng)太豐富的介質(zhì)，營養(yǎng)缺乏對菌體修復(fù)會更有利；Ray等[9]認為，在非營養(yǎng)介質(zhì)中，由低溫、冷凍引起的部分損傷菌體更能得到較好的修復(fù)。但非營養(yǎng)介質(zhì)不能修復(fù)熱激損傷的菌體[10]。冷鮮雞在生產(chǎn)過程中，經(jīng)過了預(yù)冷、冷藏以及冷鏈運輸?shù)拳h(huán)節(jié)，表面污染微生物主要存在一定的冷損傷，因此采用BPW前增菌對于后續(xù)菌體的修復(fù)具有重要作用。此外，有研究報道不同的增菌時間對于目標菌的分離培養(yǎng)至關(guān)重要，如BPW前增菌分離沙門氏菌，增菌時間選擇不當，會造成漏檢或檢出率降低[11]。然而，目前對于不同增菌過程中菌群的結(jié)構(gòu)變化研究甚少，缺乏整個微生物結(jié)構(gòu)在前增菌過程中演替的相關(guān)數(shù)據(jù)。因此本研究以前增菌液BPW和冷鮮雞微生物為研究對象，采用平板計數(shù)法、變性梯度凝膠電泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)和高通量測序技術(shù)，闡明冷鮮雞污染微生物在BPW前增菌過程中微生物數(shù)量和結(jié)構(gòu)的變化，為前增菌研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 實驗用20只冷鮮雞樣品為三黃雞，于2017年4月購買于杭州超市。

1.1.2 培養(yǎng)基 緩沖蛋白胨水培養(yǎng)基(Buffer Peptone Water，BPW)(杭州微生物試劑有限公司)，平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基(Plate Count Agar，PCA)(杭州微生物試劑有限公司)，孟加拉紅(虎紅)培養(yǎng)基(Rose Bengal Medium)(杭州微生物試劑有限公司)。

1.1.3 試劑與儀器 ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrepTM(Zymo Research)，KOD FX DNA 聚合酶(日本東洋坊公司)，Applied Biosystems? Veriti? Thermal Cycler (美國Bio-RAD公司)，凝膠成像儀(美國Bio-RAD公司)，DGGE D Code 電泳儀(美國Bio-RAD公司)，NanoDrop 2000 超微量分光光度計(美國Thermo Fisher 公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理 將從市場上購買的冷鮮雞放置于無菌袋中，每500 g冷鮮雞加入500 mL BPW沖洗液，用手握住無菌袋激烈振蕩1 min，取出雞肉樣品，將沖洗過雞肉樣品的BPW沖洗液繼續(xù)置于自封袋，36 ℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)0、2、6、12、24 h時取 BPW增菌液用于后續(xù)實驗。

1.2.2 微生物平板計數(shù) 不同增菌階段菌落總數(shù)分別按照食品安全國家標準GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢測 菌落總數(shù)》計數(shù)。

1.2.3 沙門氏菌檢測 取不同階段的BPW增菌液，參考食品安全國家標準GB 4789.4-2016《食品微生物學(xué)檢測 沙門氏菌檢驗》對沙門氏菌進行檢測分析。

1.2.4 DNA的提取 從20只冷鮮雞增菌液樣品中隨機選擇2只冷鮮雞(編號為A和a)不同階段的BPW增菌液30 mL，8 000 r/min離心10 min，得到細菌，采用試劑盒提取細菌基因組DNA用于DGGE分析和高通量測序分析，具體操作參見試劑盒說明書。

1.2.5 16S rDNA V3區(qū)擴增和DGGE分析 參照Muyzer等[12]的方法，使用341F和534R引物進行PCR擴增，在上游引物5′ 端添加GC序列：341F-GC(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGG-GCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)，534 R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)。選擇濃度為8%的尿素-丙烯酰胺凝膠，選擇變性梯度范圍為40%～65%將V3區(qū)段的擴增產(chǎn)物進行DGGE分析。采用DGGE D Code 電泳儀進行電泳，電泳緩沖液為1×TAE 緩沖液，60 ℃、50 V 電泳14 h，用EB染色，棄浸泡液，用MQ水清洗3次去除染色液。將膠放入凝膠圖像分析儀照相。

1.2.6 高通量測序分析 以提取的DNA為模板，引物338 F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′) 和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′) ，對細菌16S rRNA基因V3-V4區(qū)進行PCR擴增。上機測序采用雙端測序法(Pair end,150 bp×2)，Hiseq2500平臺進行PE150測序。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理與分析 根據(jù)條碼序列(barcode)匹配雙端測序序列(read)與樣品，對條碼序列及引物序列進行切除。使用FLASH 軟件(version 1.2.7)將雙端序列進行融合(merge)，得到未加工序列。使用QIIME軟件(Quantitative Insights Into Microbial Ecology，V1.7.0)將序列進行質(zhì)控和過濾后，獲得優(yōu)質(zhì)序列[13-14]。通過UCHIME算法將得到的優(yōu)質(zhì)序列與參考數(shù)據(jù)庫(Gold database)進行比對，發(fā)現(xiàn)嵌合體序列，去除后獲得有效序列[15-16]。使用Uparse軟件(Uparse V7.0.1001)依據(jù)相似性≥97%將質(zhì)控后的有效序列聚類成為操作分類單元(operational taxonomic unit，OTU)[17]。采用QIIME(Version 1.7.0)默認參數(shù)計算各樣品的alpha多樣性指數(shù)和物種分布。為了比較使用BPW增菌劑增菌不同時間的菌群結(jié)構(gòu)差異，使用R軟件(Version 2.15.3)內(nèi)的FactoMineR軟件包對樣品之間的菌群結(jié)構(gòu)相似度進行主坐標分析(PCoA)。

1.2.8 統(tǒng)計分析 根據(jù)菌落計數(shù)結(jié)果計算成每毫升樣品中細菌的含菌量(cfu/mL)，SPSS18.0分析實驗數(shù)據(jù)的的顯著性，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。并用GraphPad Prism 6 繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同增菌時間菌落總數(shù)變化

由圖1可見，菌落總數(shù)隨著增菌時間的延長而增加，在0和2 h菌落總數(shù)無顯著差異(P>0.05)，在6 h菌落總數(shù)極顯著升高(P<0.01)，24 h與其他四個時間點差異極顯著(P<0.01)。有研究認為[18-19]增菌的修復(fù)過程發(fā)生在繁殖前6 h內(nèi)，本實驗在增菌2 h時，菌落總數(shù)無顯著變化，在增菌6 h后，細菌數(shù)量均大量增加。

2.2 不同增菌時間對沙門氏菌檢測結(jié)果的影響

由圖2可見，沙門氏菌檢出率在增菌前12 h呈上升趨勢，檢出率分別為0%、5%、30%、40%，說明BPW增菌12 h時沙門氏菌的數(shù)量最多，利于其檢出，到24 h時其檢出率下降至15%，同時沙門氏菌也是在6 h 后開始增多，也證實了增菌的修復(fù)過程發(fā)生在繁殖前6 h[18-19]的觀點。

2.3 不同增菌時間的菌群DGGE圖譜

冷鮮雞表面菌群DGGE圖譜如圖3A所示，在BPW增菌0、2、6、12 h 的菌群條帶均較為豐富，但在增菌24 h后，菌群結(jié)構(gòu)圖譜發(fā)生明顯變化，條帶數(shù)據(jù)減少；多樣性聚類分析表明(圖3B)使用BPW增菌24 h后，與其他時間點菌群的相似性僅為0.20，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化。

圖1 不同增菌時間BPW中的菌落總數(shù)(n=20)Fig.1 Total microflora counts at different enrichment time in BPW

數(shù)據(jù)標有相同字母為差異不顯著(P>0.05)，標有相同字母為差異顯著(P<0.05)

Bars with same superscripts the difference are not significant(P>0.05),bars with different superscripts are statistically different(P<0.05)

圖2 不同增菌時間BPW中的沙門氏菌檢出率(n=20)Fig.2 Salmonella′s detection rate at different enrichment time in BPW

2.4 不同增菌時間的菌群高通量測序結(jié)果

從10個樣品中最終獲得540 247條有效片段，其中樣品有效序列為48 656～59 748條(表1)，樣品間的有效序列差異性較小。10個樣品最終獲得116～188個OTU，且各個樣品的覆蓋度指數(shù)(Good coverage)均為0.999～1，并且由圖4可看出其稀釋曲線已經(jīng)趨于平穩(wěn)，說明樣品中序列已基本全部檢測出。

圖3 不同增菌時間菌群DGGE結(jié)果和聚類結(jié)果Fig.3 The result of DGGE and microflora cluster in different enrichment timeM：Marker；A0、A2、A6、A12、A24：分別用BPW增菌0、2、6、12、24 h；a0、a2、a6、a12、a24：分別用BPW增菌0、2、6、12、24 h；下圖同M: Maker; A0,A2,A6,A12,A24: enriched by BPW in 0,2,6,12,24 h; a0,a2,a6,a12,a24: enriched by BPW in 0,2,6,12,24 h;the same as below

圖4 各樣品稀釋曲線Fig.4 Rarefaction curves of 10 different samples

表1 樣品測序概況Table 1 Overview of sequencing results of each sample

在門水平上，變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)是冷鮮雞表面優(yōu)勢菌門，占總菌群85%以上(圖5A)。在BPW增菌12 h內(nèi)變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門的相對豐度未明顯變化，在增菌24 h后，變形菌門相對豐度降低，但依然維持較高的相對豐度，為46%以上，大量病原菌如大腸埃希菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、幽門螺旋桿菌等均屬于變形菌門；而厚壁菌門相對豐度大幅度增加，由0～12 h時的5.82%～18.21%增加至35.09%～39.19%。同時，梭桿菌門(Fusobacteria)在0～12 h時相對豐度為0.16%左右，24 h時分別增加到3.80%～10.73%。另外擬桿菌門(Bacteroidetes)和放線菌門(Actinobacteria)的豐度也在增菌24 h后增加。

在屬水平上，從圖5B 組中反映出0～12 h間相對豐度較高的屬到24 h時降低，如編號為A的冷鮮雞樣品，0 h時不動桿菌屬(Acinetobacter)、希爾氏菌屬(Shewanella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)的相對豐度分別為29.49%、21.96%、20.64%、10.26%，到24 h時分別下降到1.17%、0.65%、0.91%、0.51%；而0 h時消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、變形桿菌屬(Proteus)、漫游球菌屬(Vagococcus)、擬桿菌屬(Bacteroides)和摩根氏菌屬(Morganella)的相對豐度分別為0.40%、0.14%、0.15%、1.23%、0.14%、0.17%，到24 h時分別上升到28.45%、3.75%、7.19%、3.15%、5.72%、3.10%。

圖5 各樣品的細菌菌群結(jié)構(gòu)Fig.5 The bacterial community structures of different samples.A：在門的水平上；B：在屬的水平上A: at the phylum level; B: at the genus level

郭洪波等[20]研究報道，食品主要致病菌增菌時間在12～18 h時為宜。本試驗的研究也證實了BPW前增菌時間為12 h階段細菌數(shù)量顯著增加，而菌群結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變，有利于沙門氏菌等特定病原菌的復(fù)蘇和分離。

從主坐標分析(圖6)中可以看出，相同時間點不同樣品的菌群結(jié)構(gòu)相似性較高；不同時間點，相同樣品的菌群也有較高的差異性，其中24 h時和其他時間點都有較大的差異。這與上述DGGE聚類分析的實驗結(jié)果相同。

圖6 各樣品菌落結(jié)構(gòu)的聚類和主坐標分析Fig.6 Cluster analysis and principal coordinates analysis (PCoA) of the dissimilarity of bacterial community structure among the samples A：樣品間的加權(quán)UniFrac 距離；B：樣品細菌菌群結(jié)構(gòu)的主坐標分析，PC1 和PC2為兩個主坐標成分，百分比表明二者的相對貢獻A: weighted UniFrac distance among the samples; B: PCoA of the dissimilarity of bacterial community structure among the samples,which is plotted against the PC1 vs.PC2 axes,with the percentages indicating the relative contributions of the two principal coordinates

3 討 論

使用BPW對冷鮮雞中微生物進行前增菌處理時，增菌時間對菌群結(jié)構(gòu)具有顯著影響。細菌總數(shù)隨著增菌時間的延長而顯著增多；沙門氏菌的檢出率在BPW增菌12 h階段，檢出率最高，為40%；BPW作為常見非選擇性前增菌液，能有效地增加細菌總數(shù)，提高沙門氏菌檢出率。

變形菌門在各時間點都占有很高比例，變形菌門中包含很多病原微生物(大腸埃希菌、沙門氏菌等)，同時也是細菌中最大的一個門。隨著培養(yǎng)時間的增加，24 h時變形菌門的比例減少，而厚壁菌門比例增多。由于很多厚壁菌門的細菌可以產(chǎn)生芽胞，在營養(yǎng)物質(zhì)匱乏時也能生存下來，在營養(yǎng)條件不佳時，厚壁菌門的細菌依然能增殖。

消化鏈球菌屬和不動桿菌屬在臨床上與炎癥、感染的發(fā)生有相關(guān)性[21-22]。希瓦氏菌屬和假單胞菌屬都是食品中常見的腐敗菌，在很多研究中[23-24]都證實了其在冷藏過程中能作為優(yōu)勢生存，且能產(chǎn)生氨等腐敗產(chǎn)物。本研究在增殖0～2 h內(nèi)不動桿菌屬、希瓦氏菌屬和假單胞桿菌屬為優(yōu)勢菌，但是到了24小時時其菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了較大改變，消化鏈球菌屬成為優(yōu)勢菌，不動桿菌屬、希瓦氏菌屬和假單胞桿菌屬的比例變少。所以增菌到24小時后其菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生極大改變，不能準確地判斷其真正的結(jié)構(gòu)。從菌群結(jié)構(gòu)變化的角度闡明BPW增菌時間為12 h有利于沙門氏菌等細菌復(fù)蘇分離的作用機制。

使用BPW對冷鮮雞樣品進行前增菌處理時，增菌時間對菌群結(jié)構(gòu)具有顯著影響：①細菌總數(shù)和沙門氏菌檢出率隨著增菌時間的延長而增多；②DGGE和基于16S rRNA基因的高通量測序分析均表明，BPW增菌12 h內(nèi)，菌群結(jié)構(gòu)變化相對較少，優(yōu)勢菌屬為不動桿菌屬(Acinetobacter)、希爾氏菌屬(Shewanella)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)；而增菌24 h，菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，消化鏈球菌屬(Peptostreptococcus)、梭桿菌屬(Fusobacterium)、變性桿菌屬(Proteus)、漫游球菌屬(Vagococcus)、擬桿菌屬(Bacteroides)和摩根氏菌屬(Morganella)成為主要的優(yōu)勢菌屬。