化濁毒中藥對2型糖尿病并發(fā)急性腦梗死患者動脈彈性指數(shù)、舌上細(xì)胞凋亡指數(shù)及核因子κB的影響

史春林，陳建權(quán)，張海生，張國良，劉大永，劉冬敏，王玉超

（玉田縣醫(yī)院中醫(yī)科，河北 唐山 064100）

急性腦梗死是2型糖尿病患者最常見的血管事件之一，具有較高的病死率及致殘率[1]。常規(guī)的內(nèi)科治療歷來是治療此病的主要方法，除此以外疾病早期溶栓治療、部分介入及手術(shù)治療也占據(jù)重要地位，但由于受到病情、個體化因素、經(jīng)濟因素等原因的限制，使后續(xù)治療局限性加大[2]。我們選擇120例2型糖尿病并發(fā)急性腦梗死無溶栓機會的患者，觀察化濁毒中藥對此類患者動脈彈性指數(shù)、舌上細(xì)胞凋亡指數(shù)及舌苔NF-κB蛋白表達(dá)的影響?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2013年7月～2017年8月挑選120名玉田縣醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科病房和中醫(yī)病房住院的失眠患者，采用隨機對照的方法進行研究，分為對照組53例，對治療組67例。兩組在性別、年齡、病程、病情程度等方面，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

已確診為“ 2型糖尿病”的年齡≥60歲患者為診斷的選擇標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)臨床、CT、MRI證實為腦梗死患者并符合在中華醫(yī)學(xué)會精神科分會編制的《中國精神疾病分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)》[3]（CCMD-2R）中有關(guān)于失眠癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 治療方法

治療組采用化濁毒中藥（黃連6g，半夏12g，瓜蔞9g，白術(shù)60～120g，天麻9g，茯苓12g，枳實12g，半枝蓮9g，半邊蓮9g，紅景天12g，三棱9g，莪術(shù)9g，焦三仙各15g日1劑早晚分服），對照組給予地西泮片5mg睡前頓服1/日治療。30d為1個療程，1個療程后統(tǒng)計療效。兩組患者都根據(jù)病情使用營養(yǎng)腦細(xì)胞、改善微循環(huán)藥物。在用藥前、后觀察心肌酶、轉(zhuǎn)氨酶情況。

1.4 動脈彈性指數(shù)的測定

所有受試者在檢測前靜息30min，在安靜環(huán)境下取仰臥位，采用美國HDI公司CVProfilorTMDO2020型動脈彈性功能測定儀系統(tǒng)測量血管彈性。選用合適的袖帶于右側(cè)肱動脈位置測量臥位血壓，將動脈脈沖壓力傳感器置于左側(cè)橈動脈搏動最強處，采集橈動脈搏動波形圖30s，計算機分析舒張期壓力及振蕩衰減，應(yīng)用修正的Windkessel循環(huán)模型計算出大動脈彈性指數(shù)（C1）和小動脈彈性指數(shù)（C2），分別測量3次取平均值。

1.5 舌上皮細(xì)胞凋亡檢測（缺口末端標(biāo)記技術(shù)，TUNEL法）

舌苔懸液經(jīng)1000r/10 min離心并400目濾網(wǎng)過濾，PBS 洗滌3次，用沉淀做細(xì)胞涂片，晾干3h；4%多聚甲醛固定1h后PBS洗3次，1%曲拉通（4℃作用10min）再用PBS洗滌3次；加入TUNEL液37℃孵育1h后，PBS洗3次；POD37℃作用30min，DAB顯色（5min），蘇木素復(fù)染，晾干，封片，鏡檢。隨機選取1000個舌上皮細(xì)胞，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞，觀察陽性細(xì)胞所占比例，記為細(xì)胞凋亡指數(shù)（apoptosis index，AI）。

1.6 舌苔NF-κB蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞在37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2條件下培養(yǎng)（舌苔懸液處理后細(xì)胞培養(yǎng)1h），提取總蛋白要采用細(xì)胞裂解液，BCA法測定蛋白濃度。取50μg總蛋白樣品煮沸變性后，SDS－PAGE電泳，然后將電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，在封閉液的容器中講用雙蒸水漂洗過的膜放入，室溫下脫色搖床上 4℃振蕩過夜。加入用TBS/T稀釋至適當(dāng)濃度的一抗，4℃振蕩過夜。TBS/T洗膜。加入封閉液稀釋的二抗，4℃振蕩過夜，TBS/T洗膜。將膜與ECL反應(yīng)5 min后，曝光于X光膠片上，顯影、定影、掃描后進行圖像分析。（所有標(biāo)本送檢上海西唐生物科技有限公司）。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS17.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)以表示，計量資料采用t 檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

表1 各組治療前后動脈彈性指數(shù)變化（

表1 各組治療前后動脈彈性指數(shù)變化（

與對照組治療后比較：※P＜0.05；與治療前比較△P＜0.01。

組別 n 時間 動脈彈性指數(shù)（分）C1 C2對照組 53 治療前 8.93±2.76 3.98±0.93治療后 10.75±2.91 4.32±1.09治療組 67 治療前 8.72±2.71 3.93±1.08治療后 12.09±3.07※△ 6.69±1.45※△

治療后對照組動脈彈性指數(shù)呈上升趨勢，但治療前后，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療前與治療后對比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與對照組治療后比較，動脈彈性指數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組治療前后舌上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)及舌苔NF-κB蛋白表達(dá)變化s）

表2 各組治療前后舌上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)及舌苔NF-κB蛋白表達(dá)變化s）

與對照組治療后比較：※P＜0.05；與治療前比較△P＜0.01。

舌苔NF-κB拷貝數(shù)（μlcDNA）對照組 53 治療前 6.73±5.26 260.937±261.331治療后 9.06±5.19 203.324±201.093治療組 67 治療前 6.57±5.71 261.393±259.108治療后 11.43±8.42※△ 119.690±136.145※△組別 n 時間 舌上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)（分）

治療后對照組舌上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)呈上升趨勢，但治療前后對比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療前與治療后對比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與對照組治療后比較，舌上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

治療后對照組舌苔NF-κB拷貝數(shù)呈下降趨勢，但治療前后對比無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。治療前與治療后對比有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），與對照組治療后比較，舌苔NF-κB拷貝數(shù)明顯升高，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討 論

缺血性腦卒中的患者進行早期二級預(yù)防，有利于患者通過尋找卒中事件發(fā)生的原因，糾正所有可干預(yù)的危險因素，達(dá)到預(yù)防卒中再發(fā)的目的。缺血性腦卒中的二級預(yù)防包括: 控制血壓、血糖、抗血小板、抗動脈粥樣硬化，以及血脂的管理，手術(shù)治療，必要的介入治療，以及改變生活方式等。因此，對糖尿病并發(fā)急性腦梗死且無溶栓機會的患者如何進行肢體、語言、高級腦功能的恢復(fù)，降低致殘率，提高生活質(zhì)量等嚴(yán)峻的問題亟待解決。

2型缺血性腦血管病危險因素之一是糖尿病。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)：長期的高血糖狀態(tài)使一氧化氮滅活加速，從而影響血管內(nèi)皮細(xì)胞合成和釋放一氧化氮減少，血管平滑肌對內(nèi)皮源性一氧化氮反應(yīng)性降低，血管的擴張性減弱，動脈順應(yīng)性降低，最終導(dǎo)致動脈彈性的降低，主要表現(xiàn)為近端彈性大動脈順應(yīng)性及遠(yuǎn)端小動脈彈性和微循環(huán)順應(yīng)性降低，即C1和C2的降低。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為人體是有機整體，糖尿病對血管的損傷涉及到全身微血管及大血管。因此，我課題組將此評價指標(biāo)引入到此項研究中。

舌背黏膜為復(fù)層鱗狀上皮，舌背黏膜為復(fù)層鱗狀上皮，復(fù)層鱗狀上皮不斷從基底層經(jīng)棘細(xì)胞層、顆粒層向角化層遷移，當(dāng)機體處于健康狀態(tài)時，此種遷移就會處于平衡狀態(tài)，一般正常人都是薄白苔。影響這種平衡遷移可能就是機體產(chǎn)生病變了，舌苔就會出現(xiàn)厚薄不同、顏色各異的變化情況。舌苔變化是機體臟腑功能發(fā)生變化的外在表現(xiàn)，并且是直觀和客觀的統(tǒng)一，可以作為疾病的輔助診斷指標(biāo)，也可以有效指導(dǎo)臨床用藥和判斷預(yù)后。因此，本項研究將舌苔變化作為此項研究終點評價的重點。

核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的轉(zhuǎn)錄活性與2型糖尿病微血管內(nèi)皮細(xì)胞受損密切相關(guān)，NF-κB活化后能誘導(dǎo)黏附分子轉(zhuǎn)錄，是糖尿病微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎性反應(yīng)過程的核心因素，Haslbeck等研究證實，糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）及其受體（receptor of AGEs，RAGE）結(jié)合引起NF-κB 持續(xù)活化，可調(diào)控其下游一系列細(xì)胞因子的表達(dá)，在糖尿病周圍神經(jīng)病變甚至更早期的糖耐量異常相關(guān)的周圍神經(jīng)病變患者中，活檢發(fā)現(xiàn)活化的NF-κB可在神經(jīng)束膜及神經(jīng)外膜血管和部分神經(jīng)內(nèi)膜血管上表達(dá)[4]。因此，本項研究亦將核因子κB信號通路作為此項研究終點評價之一。

本次研究發(fā)現(xiàn)，化濁毒中藥化濁毒中藥能明顯升高動脈彈性指數(shù)及舌上細(xì)胞凋亡指數(shù)，同時可降低舌苔懸液中NF-κB的含量。本方法可恢復(fù)2型糖尿病并發(fā)急性腦梗死無溶栓機會的患者肢體、語言、高級腦功能，降低致殘率，提高生活質(zhì)量，可能是與調(diào)節(jié)該類患者的動脈彈性指數(shù)、舌上細(xì)胞凋亡指數(shù)及舌苔NF-κB蛋白表達(dá)有關(guān)。但本結(jié)果需進一步加大樣本量進行臨床驗證。