結(jié)腸鏡活檢組織檢測MGMT和galectin—3的表達在結(jié)腸腺癌中的臨床意義

蘇賡 梁科慶 羅顯克 溫偉

[摘要] 目的 檢測結(jié)腸腺癌活檢組織中DNA修復酶O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）和半乳糖凝集素-3（galectin-3）的表達在結(jié)腸腺癌中的臨床意義。 方法 選取2010年1月～2015年1月廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院結(jié)腸鏡活檢的120例患者標本組織（包括60例結(jié)腸腺癌、30例炎性結(jié)腸黏膜病變和30例不典型增生結(jié)腸黏膜病變），通過免疫組化SP方法檢測MGMT蛋白、galectin-3蛋白的表達情況，并通過隨訪了解預后情況。 結(jié)果 與炎性腸黏膜病變組比較，結(jié)腸腺癌組MGMT陽性表達降低，galectin-3陽性表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。與中-高分化結(jié)腸腺癌組比較，低分化結(jié)腸腺癌組中MGMT陽性表達降低，galectin-3陽性表達升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;與有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸腺癌組比較，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸腺癌組MGMT陽性表達升高，galectin-3陽性表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;MGMT在結(jié)腸腺癌組織中的表達隨著TNM分期增高而降低，galectin-3的表達隨著TNM分期增高而增高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;MGMT和galectin-3的表達與結(jié)腸腺癌患者的年齡、性別無關(guān)（P > 0.05）。MGMT和galectin-3在結(jié)腸腺癌中的表達呈負相關(guān)（r = -0.399，P = 0.002）;MGMT和galectin-3在結(jié)腸腺癌中的陽性表達率與患者的3年生存率明顯相關(guān)（P < 0.05）。 結(jié)論 MGMT和galectin-3在結(jié)腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用，檢測結(jié)腸腺癌組織中MGMT和galectin-3的表達有助于判斷腫瘤的惡性程度、病情進展及預后。

[關(guān)鍵詞] 炎性腸黏膜病變;結(jié)腸黏膜不典型增生;結(jié)腸腺癌;O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶;半乳糖凝集素-3

[中圖分類號] R574.62 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）12（b）-0094-05

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significances of DNA repair enzyme O6-methylguanine DNA methyltransferase （MGMT） and galectin-3 in colon adenocarcinoma tissues collected with fibro colonoscopy. Methods From January 2010 to January 2015， the tissues with fibro colonoscopy from 120 patients treated in Minzu Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region were collected， including 60 colon adenocarcinomas， 30 inflammatory bowel diseases， and 30 colonic mucosal atypical hyperplasias. The expression of MGMT and galectin-3 were measured by immunohistochemical SP method and the prognosis was evaluated by follow-up visit. Results Compared with the inflammatory bowel disease group， the positive expression of MGMT significantly decreased and the positive expression of galectin-3 significantly increased in the colon adenocarcinomas group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Compared with medium-high differentiation colon adenocarcinoma group， the positive expression of MGMT significantly decreased and the positive expression of galectin-3 significantly increased in poor differentiation colon adenocarcinoma group， the differences were statistically significant （P < 0.05）; the expression of MGMT in colon adenocarcinoma decreased with the increase of TNM stage， and the expression of galectin-3 increased with the increase of TNM stage， the differences were statistically significant （P < 0.05）; the expression of MGMT and galectin-3 were not related to age and gender （P > 0.05）. There was a negative association between the expression level of MGMT and galectin-3 in colon adenocarcinoma （r = -0.399，P = 0.002）; the positive expression rate of MGMT and galectin-3 in colon adenocarcinoma were significantly correlated with the 3-year survival rate of patients （P < 0.05）. Conclusion MGMT and galectin-3 might play important roles in tumorigenesis and development of colon adenocarcinoma， they are promising biomarkers for colon adenocarcinoma staging， metastasis and prognosis .

[Key words] Inflammatory bowel disease; Colonic mucosal atypical hyperplasia; Colon adenocarcinoma; MGMT; Galectin-3

結(jié)腸癌是最常見的胃腸癌類型之一，目前仍然是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因[1]。結(jié)腸腺癌是最常見的結(jié)腸癌類型，占新診斷結(jié)腸癌病例的98%[2]。結(jié)腸鏡活檢是預防及早期發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的重要手段，手術(shù)治療聯(lián)合其他治療方案（放射治療、射頻消融、化療）是標準的治療策略。盡管在診斷和治療方面取得了一定的進展，但由于腫瘤轉(zhuǎn)移引起的相關(guān)并發(fā)癥，患者的預后仍然很差。研究表明很多惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預后與DNA修復酶O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）和半乳糖凝集素-3（galectin-3）表達異常有關(guān)[3]。本研究通過免疫組化SP法對結(jié)腸鏡活檢組織中的60例結(jié)腸腺癌、同期30例炎性結(jié)腸黏膜病變和30例不典型增生結(jié)腸黏膜病變標本中MGMT和galectin-3的表達進行研究，為臨床篩選高危人群、判斷結(jié)腸腺癌惡性程度、選擇治療方案及評價預后提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年1月～2015年1月廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院（以下簡稱“我院”）經(jīng)結(jié)腸鏡活檢并病理證實的60例結(jié)腸腺癌患者和同期30例炎性結(jié)腸黏膜病變、30例不典型增生結(jié)腸黏膜病變患者的資料。60例結(jié)腸腺癌患者中，女25例，男35例;年齡30～82歲，平均年齡（60±12.7）歲，其中年齡≥60歲的37例，年齡<60歲的23例;鏡下病理分級中-高分化腺癌36例，低分化腺癌24例;術(shù)后及影像學檢查發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，腫瘤TNM分期Ⅰ+Ⅱ期的患者32例，Ⅲ+Ⅳ期患者28例;所有病例術(shù)前均未經(jīng)放、化療，全部病例跟蹤隨訪，并以3年生存率作為反映預后的指標。結(jié)腸腺癌標本的入選依據(jù)中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范（2017版）分類標準，由兩位病理醫(yī)師經(jīng)雙盲法重新復診切片。參與本研究的所有患者均對本研究知情并簽署知情同意書。本研究經(jīng)我院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 免疫組化

MGMT和galectin-3單克隆即用型抗體均購自福州邁新生物技術(shù)公司，標本按常規(guī)SP法染色。設(shè)立對照：以已知MGMT和galectin-3陽性組織切片作為陽性對照，以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.3 結(jié)果判定

在光學顯微鏡下結(jié)合HE片觀察免疫組化片染色結(jié)果，結(jié)果判定采用雙盲法，隨機選擇10個高倍視野，每個視野計算100個腫瘤細胞，按照陽性細胞所占比例計分，無陽性細胞計0分，<11%計1分，11%～ <51%計2分，≥51%計3分。染色強度計分：無棕黃色計0分，微弱棕黃色計1分，中等強度棕黃色計2分，褐色或棕褐色計3分。兩者評分相乘<2分為陰性表達，≥2分為陽性表達。MGMT染色定位于細胞核和/或細胞質(zhì)，galectin-3染色定位于細胞質(zhì)。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗，相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MGMT和galectin-3在炎性結(jié)腸黏膜病變、不典型增生結(jié)腸黏膜病變和結(jié)腸腺癌中的表達

從炎性病變到不典型增生到惡性病變，MGMT表達逐漸降低，galectin-3表達逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;結(jié)腸腺癌MGMT陽性表達率低于炎性結(jié)腸黏膜病變，galectin-3陽性表達率高于炎性結(jié)腸黏膜病變，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;結(jié)腸腺癌與不典型增生結(jié)腸黏膜病變組間、炎性結(jié)腸黏膜病變與不典型增生結(jié)腸黏膜病變組間MGMT和galectin-3表達比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），見表1。MGMT和galectin-3在炎性結(jié)腸黏膜病變、不典型結(jié)腸黏膜病變和結(jié)腸腺癌中免疫組織化學染色情況見圖1～2（封四）。

2.2 MGMT和galectin-3在結(jié)腸腺癌中的表達與臨床生物學特性關(guān)系

低分化結(jié)腸腺癌組中MGMT陽性表達低于中-高分化結(jié)腸腺癌組，galectin-3陽性表達高于中-高分化結(jié)腸腺癌組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸腺癌組MGMT陽性表達高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸腺癌組，galectin-3陽性表達低于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸腺癌組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;MGMT在結(jié)腸腺癌組織中的表達隨著TNM分期增高而降低，galectin-3在結(jié)腸腺癌組織中的表達隨著TNM分期增高而增高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）;結(jié)腸腺癌患者年齡及性別與MGMT及galectin-3的表達無關(guān)（P > 0.05）。見表2。

2.3 MGMT和galectin-3在結(jié)腸腺癌中表達的相關(guān)性

應用Spearman等級相關(guān)分析MGMT和galectin-3表達的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)r = -0.399，P = 0.002，提示MGMT和galectin-3表達呈負相關(guān)。

2.4 MGMT和galectin-3的表達與結(jié)腸腺癌患者生存時間的關(guān)系

隨訪調(diào)查60例結(jié)腸腺癌患者發(fā)現(xiàn)，3年內(nèi)死亡16例，存活44例，3年生存率為73.33%。死亡患者中MGMT陽性表達率明顯低于存活患者（P < 0.05），galectin-3陽性表達率明顯高于存活患者（P < 0.05）。見表3。

3 討論

DNA修復酶MGMT穩(wěn)定地存在于人體各種組織內(nèi)，分子結(jié)構(gòu)上的啟動子富含GC堿基，順式作用元件（GRE）包含2個糖皮質(zhì)激素反應元件、核轉(zhuǎn)錄因子激活蛋白-1（AP-1）元件、CpG島中的6個Spl位點[4]，其通過去除烷基加合物來抵消烷化劑的致染色體畸變作用，從而防止交聯(lián)形成并由此引起對烷基化藥物的抗性，位于MGMT啟動子區(qū)域中的CpG島的甲基化主要負責幾種腫瘤類型中相關(guān)基因的失活[5-6]。研究結(jié)果表明，MGMT的表達水平在肝細胞性肝癌、胃癌、乳腺癌的總體生存率中是一個重要的預警指標[7-9]。然而，MGMT表達與結(jié)腸腺癌的臨床病理特征之間的關(guān)系仍不清楚。目前大部分研究都集中于結(jié)腸腺癌的MGMT啟動子的甲基化狀態(tài)的激活因素。有研究報道結(jié)直腸癌中MGMT啟動子區(qū)CpG島存在過度甲基化，導致MGMT表達的缺失不能修復基因損傷，因此引起腫瘤的發(fā)生，這是目前為止最廣為接受的結(jié)腸腺癌發(fā)生機制之一[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，MGMT在炎性結(jié)腸黏膜病變-不典型增生結(jié)腸黏膜病變-結(jié)腸腺癌這一病變過程中，陽性率逐級下降，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組MGMT表達低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸腺癌組，病理分級低分化組MGMT表達明顯高于高分化組，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，差異均有統(tǒng)計學意義?？赡軝C制是結(jié)腸腺癌中MGMT啟動子區(qū)CpG島存在過度甲基化，導致MGMT表達的缺失不能修復基因損傷，因此引起惡性腫瘤的發(fā)生[11]，并且在相應的隨訪病例中，MGMT低表達者預后較差，監(jiān)測MGMT的表達有助于判斷其預后。

galectin-3是凝集素家族的成員，galectin-3蛋白在細胞核中產(chǎn)生，主要定位于細胞表面和細胞外基質(zhì)中，通過與相應配體的相互作用發(fā)揮多種功能[12-14]。galectin-3通過與細胞黏附相關(guān)分子結(jié)合并抑制細胞-細胞和細胞-基質(zhì)相互作用來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移，從而增加癌細胞脫離和遷移率。臨床研究表明，galectin-3在包括食管癌和肺癌在內(nèi)的多種實體瘤組織中高度表達[15-16]。Korkmaz等[17]報道，結(jié)腸直腸腺癌組織中g(shù)alectin-3的表達顯著高于正常腸組織。這些報道提示，galectin-3在結(jié)腸腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)galectin-3在炎性結(jié)腸黏膜病變-不典型結(jié)腸黏膜病變-結(jié)腸腺癌這一病變過程中，陽性率逐級上升，癌組織陽性率明顯高于非癌組織。這一發(fā)現(xiàn)與Mazurek等[18]的報道一致，提示galectin-3可能參與結(jié)腸癌的發(fā)生和發(fā)展。本研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者、分化程度低、TNM分期晚的患者galectin-3陽性表達率較高，這些參數(shù)是預后相對較差的指標。分析galectin-3表達水平與生存率之間的關(guān)系，結(jié)果顯示3年內(nèi)死亡患者的galectin-3陽性表達率明顯高于存活患者。這一結(jié)果提示，galectin-3的陽性表達與惡性結(jié)腸腺癌的生物學行為有關(guān)，可作為患者預后不良的預測指標。

本研究發(fā)現(xiàn)MGMT和galectin-3在結(jié)腸腺癌中的表達呈負相關(guān)，也就是說結(jié)腸腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中如果失去MGMT的正常表達，可能意味著galectin-3過度表達，反之亦然。導致這種結(jié)果的原因可能是兩者形成特殊的復合體在結(jié)腸腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮拮抗作用，同時MGMT與galectin-3有共同的基因定位，推測兩種蛋白可能有直接或間接的關(guān)聯(lián)，因此MGMT及galectin-3在結(jié)腸腺癌中的表達具有顯著相關(guān)性，在其發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中可能發(fā)揮著拮抗作用。當然，這需要更大量數(shù)據(jù)及更深層次的實驗來證實。

總之，MGMT、galectin-3與結(jié)腸腺癌的發(fā)生及進展相關(guān)，MGMT的低表達和galectin-3的高表達促進了結(jié)腸腺癌發(fā)生、發(fā)展，是瘤細胞進一步轉(zhuǎn)化和惡變的分子異常事件，可作為早期診斷結(jié)腸癌癌前病變和結(jié)腸癌的篩查指標之一。結(jié)腸鏡活檢組織中聯(lián)合檢測MGMT和galectin-3的表達在結(jié)腸腺癌的防治中可能有良好的應用前景。

[參考文獻]

[1] Reha J，Mukkamalla SKR，Rathore R，et al. Adequate lymph node evaluation in the elderly is associated with improved survival in patients with stage Ⅰ-Ⅲ colon cancer：A validation study using the National Cancer Data Base [J]. Eur J Surg Oncol，2018，44（1）：148-156.

[2] Alibolandi M，Rezvani R，F(xiàn)arzad SA，et al. Tetrac-conjugated polymersomes for integrin-targeted delivery of camptothecin to colon adenocarcinoma in vitro and in vivo [J]. Int J Pharm，2017，532（1）：581-594.

[3] Kurimoto T，Kondo A，Ogino I，et al. Effect of O6-methylguanine-DNA methyltransferase methylation in medulloblastoma [J]. Mol Clin Oncol，2017，7（6）：1107-1111.

[4] Kessler T，Sahm F，Sadik A，et al. Molecular differences in IDH wildtype glioblastoma according to MGMT promoter methylation [J]. Neuro Oncol，2018，20（3）：367-379.

[5] Ida CM，Butz ML，Jenkins RB，et al. Real-Time Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction for MGMT Promoter Methylation Clinical Testing in Glioblastoma：An Alternative Detection Method for a Heterogeneous Process [J]. Am J Clin Pathol，2017，148（4）：296-307.

[6] Kurimoto T，Kondo A，Ogino I，et al. Effect of O6-methylguanine-DNA methyltransferase methylation in medulloblastoma [J]. Mol Clin Oncol，2017，7（6）：1107-1111.

[7] Formeister EJ，Tsuchiya M，F(xiàn)ujii H，et al. Comparative analysis of promoter methylation and gene expression endpoints between tumorous and non-tumorous tissues from HCV-positive patients with hepatocellular carcinoma [J]. Mutat Res，2010，692（1/2）：26-33.

[8] Li C，Deng L，Shen H，et al. O-6-methylguanine-DNA Methyltransferase Inhibits Gastric Carcinoma Cell Migration and Invasion by Downregulation of Matrix Metalloproteinase 2 [J]. Anticancer Agents Med Chem，2016，16（9）：1125-1132.

[9] Paranjpe A，Bailey NI，Konduri S，et al. New insights into estrogenic regulation of O6-methylguanine DNA-methyltransferase（MGMT）in human breast cancer cells：Co-degradation of ER-α and MGMT proteins by fulvestrant or O6-benzylguanine indicates fresh avenues for therapy [J]. J Biomed Res，2016，30（5）：393-410.

[10] Alonso S，Dai Y，Yamashita K，et al. Methylation of MGMT and ADAMTS14 in normal colon mucosa：biomarkers of a field defect for cancerization preferentially targeting elder African-Americans [J]. Oncotarget，2015，6（5）：3420-3431.

[11] Michailidi C，Theocharis S，Tsourouflis G，et al. Expression and promoter methylation status of hMLH1，MGMT，APC，and CDH1 genes in patients with colon adenocarcinoma [J]. Exp Biol Med（Maywood），2015，240（12）：1599-1605.

[12] de Oliveira JT，de Matos AJ，Gomes J，et al. Coordinated expression of galectin-3 and galectin-3-binding sites in malignant mammary tumors：implications for tumor metastasis [J]. Glycobiology，2010，20（11）：1341-1352.

[13] Tas F，Bilgin E，Tastekin D，et al. Clinical Significance of Serum Galectin-3 Levels in Gastric Cancer Patients [J]. J Gastrointest Cancer，2016，47（2）：182-186.

[14] O′Sullivan JM，Jenkins PV，Rawley O，et al. Galectin-1 and Galectin-3 Constitute Novel-Binding Partners for Factor Ⅷ [J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2016，36（5）：855-863.

[15] Liang N，Song X，Xie J，et al. Effect of galectin-3 on the behavior of Eca-109 human esophageal cancer cells [J]. Mol Med Rep，2015，11（2）：896-902.

[16] Kuo HY，Hsu HT，Chen YC，et al. Galectin-3 modulates the EGFR signalling-mediated regulation of Sox2 expression via c-Myc in lung cancer [J]. Glycobiology，2016，26（2）：155-165.

[18] Mazurek N，Byrd JC，Sun Y，et al. Cell-surface galectin-3 confers resistance to TRAIL by impeding trafficking of death receptors in metastatic colon adenocarcinoma cells [J]. Cell Death Differ，2012，19（3）：523-533.

（收稿日期：2018-06-29 本文編輯：羅喬荔）