ATG16L1與Gal—9在潰瘍性結(jié)腸炎活動性判定中的價值

吳娜 李多 于永強

[摘要] 目的 探究ATG16L1與半乳糖凝集素-9（Gal-9）對潰瘍性結(jié)腸炎（UC）活動性判定中的價值。 方法 選擇2015年3月～2016年3月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）進行治療的80例UC患者為觀察組，另選取同期于我院進行結(jié)腸鏡檢查無異常者20例作為對照組，使用改良Mayo評分系統(tǒng)對UC的活動性進行評估。采用Spearman相關(guān)分析觀察組患者ATG16L1、Gal-9表達(dá)水平與Mayo評分的相關(guān)性。 結(jié)果 觀察組ATG16L1的相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)陽性率均顯著低于對照組（P < 0.05），觀察組Gal-9相對表達(dá)量和表達(dá)陽性率均顯著高于對照組（P < 0.05）。ATG16L1相對表達(dá)量和陽性率與Mayo評分呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.78，P < 0.05；rs=-0.80，P < 0.05），Gal-9相對表達(dá)量和蛋白陽性表達(dá)率與Mayo評分呈顯著正相關(guān)（均rs=0.81，P < 0.05）。 結(jié)論 ATG16L1和Gal-9的表達(dá)與UC的活性密切相關(guān)，可作為判斷UC活性的指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] ATG16L1；半乳糖凝集素-9；潰瘍性結(jié)腸炎；活動性

[中圖分類號] R574.62 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（a）-0066-04

[Abstract] Objective To explore the value of ATG16L1 and galectin-9 （Gal-9） in judging the activity of ulcerative colitis （UC）. Methods From March 2015 to March 2016， 80 patients with UC in the First Affiliated Hospital of Hebei North University （“our hospital” for short） were selected as the observation group， and 20 patients with no intestinal disease over the same period as the control group. The UC activity was evaluated using the modified Mayo scoring system evaluation. Spearman correlation was used to analyze the correlation between the expression level of ATG16L1 gal-9 in the observation group and the Mayo score. Results The relative expression of ATG16L1 and the protein positive expression rate in the observation group were significantly lower than those in the control group （P < 0.05）， and the relative expression of Gal-9 and the positive expression rate in the observation group were significantly higher than those in the control group （P < 0.05）. The relative expression level and positive rate of ATG16L1 showed a significant negative correlation with Mayo score （rs=-0.78，P < 0.05；rs=-0.80，P < 0.05）. The relative expression level of Gal-9 and the protein positive rate showed a significant positive correlation with Mayo score （all rs=0.81，P < 0.05）. Conclusion The expression of ATG16L1 and Gal-9 is closely related to the activity of UC， which can be used as an index to judge the activity of UC.

[Key words] ATG16L1； Galectin-9； Ulcerative colitis； Activity

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）病變部位可遍及整個結(jié)腸，其病程長并容易反復(fù)發(fā)作[1-2]。在治療過程需對UC的活動性及逆行及時評估和隨訪，但目前尚無統(tǒng)一判定標(biāo)準(zhǔn)并且缺乏特異性[3]。ATG16L1編碼的蛋白參與細(xì)胞的自噬，與UC的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[4]。而半乳糖凝集素-9（galectin-9，Gal-9）參與機體炎性反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)過程，細(xì)胞自噬異常會引起Gal-9水平的波動[5]。目前國內(nèi)鮮見關(guān)于Gal-9、ATG16L1與UC活動性的相報道，本文主要研究Gal-9、ATG16L1對與UC活動性判定中的價值，為Gal-9、ATG16L1指導(dǎo)UC的臨床治療提供新的治療方法及依據(jù)。現(xiàn)將報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年3月～2016年3月河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院（以下簡稱“我院”）80例UC患者為觀察組，其中男43例，女37例；平均年齡（40.56±4.43）歲。另選取同期于我院進行結(jié)腸鏡檢查無異常者20例作為對照組，男11例，女9例，平均年齡（38.22±4.07）歲。兩組年齡、性別等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。本研究已經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡在20～80歲；②符合2012年炎癥性腸病診斷與治療的共識意見[6]中對于UC的診斷標(biāo)準(zhǔn)；③各項檢查資料完整；④患者及患者家屬均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①過去3個月內(nèi)使用過水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物制劑等；②合并心血管疾病和肝腎疾病；③合并惡性腫瘤；④合并其他自身免疫性疾?。虎莶溉橐约叭焉锲趮D女。

1.3 方法

1.3.1 疾病活動性評估 本次研究中使用改良Mayo評分系統(tǒng)[7]對UC的活動性進行評估，評估項目包括：排便次數(shù)、便血情況、內(nèi)鏡表現(xiàn)以及總體評價，根據(jù)患者實際情況與患者健康時自身情況，每項進行0～3分的評分，總分為12分，分?jǐn)?shù)越高表示越嚴(yán)重。根據(jù)評分可分為：①臨床緩解期≤2分；②輕度活動3～5分；③中度活動6～10分；④重度活動11～12分。

1.3.2 ATG16L1、Gal-9相關(guān)PCR檢測 所有患者在結(jié)腸鏡檢查時分別采集結(jié)腸黏膜標(biāo)本3份，其中1份使用熒光定量PCR方法進行檢測，具體操作方法如下[7-8]：將標(biāo)本在液氮保護下研磨，使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒提取總RNA，試劑盒購買于Takara公司（RT-reagent），熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒購買于Takara公司（SYBRPremixExTaq）嚴(yán)格按照說明書方法操作。擴增體系為1 L cDNA加入到10 L去離子水，95℃預(yù)變性1 min；變性：95℃下15 s，退火：60℃下30 s，延伸：72℃，共進行40個循環(huán)，比較。ATG16L1上游引物5′-GGCTGTACCGTGTTTCCT～TAG-3′，下游引物5′-CTTCATGGCAAGTGG-TTGTAC-3′；Gal-9上游引物5′-GGCTGTACCGTGTTTCCT～TAG-3′，下游引物5′- GTGAAGGTGACAGCAGTCGGT-T-3′均為自行設(shè)計。

1.3.3 ATG16L1、Gal-9相關(guān)免疫組化檢測 將“1.3.2”中另兩份樣本及逆行免疫組化檢測，具體方法如下：將樣本及逆行固定、脫蠟處理，3%過氧化氫室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性，后用PBS沖洗，再放入枸櫞酸鈉緩沖液高壓煮沸2 min，后用PBS沖洗。分別滴加小鼠抗人ATG16L1、Galectin-9單克隆抗體（購買于上海信裕生物科技有限公司），陰性對照用PBS代替，4℃孵育24 h。復(fù)溫40 min，PBS沖洗，滴加鼠二抗工作液，室溫孵化1 h后PBS沖洗，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，室溫15 minPBS沖洗。DAB顯色10 min，顯微鏡下控制反應(yīng)時間，顯色滿意后自來水沖洗，后用蘇木精復(fù)染。清水沖洗后氨水返藍(lán)，封片。每張切片隨機選取8個高倍視野，細(xì)胞顏色包括無色、淺黃色、黃色、棕黃色和棕褐色，著色比例大于30%并且顏色為黃色、棕黃色、棕褐色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞，表達(dá)陽性率用每個視野中陽性細(xì)胞比例表示，陽性率=（視野中陽性細(xì)胞個數(shù)/視野中總細(xì)胞數(shù)）×100%，取8個視野的平均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman相關(guān)分析觀察組患者ATG16L1、Gal-9表達(dá)水平與Mayo評分的相關(guān)性，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組ATG16L1、Gal-9的mRNA相對表達(dá)量比較

觀察組ATG16L1的相對表達(dá)量顯著低于對照組（P < 0.05），觀察組Gal-9相對表達(dá)量顯著高于對照組（P < 0.05）。見表1。

2.2 兩組ATG16L1、Gal-9蛋白表達(dá)陽性率比較

觀察組ATG16L1蛋白表達(dá)陽性率顯著低于對照組（P < 0.05），觀察組Gal-9蛋白表達(dá)陽性率顯著高于對照組（P < 0.05）。見表2。

2.3 觀察組不同UC活動性ATG16L1、Gal-9的mRNA相對表達(dá)量比較以及相關(guān)性比較

隨著Mayo評分的升高，TG16L1以及Gal-9相對表達(dá)量顯著升高，其中ATG16L1相對表達(dá)量與UC活動性呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.78，P=0.000），Gal-9相對表達(dá)量與UC活動性呈顯著正相關(guān)（rs=0.81，P=0.000）。見表3。

2.4 觀察組不同UC活動性ATG16L1、Gal-9蛋白表達(dá)陽性率比較以及相關(guān)性比較

觀察組內(nèi)不同UC活動性組間的ATG16L1、Gal-9表達(dá)陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），隨著Mayo評分的升高，TG16L1以及Gal-9陽性率顯著升高，其中ATG16L1表達(dá)陽性率與UC活動性呈顯著負(fù)相關(guān)（rs=-0.80，P=0.000），Gal-9表達(dá)陽性率與UC活動性呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（rs=0.81，P=0.000）。見表4。

3 討論

近年來調(diào)查發(fā)現(xiàn)UC在我國的發(fā)病率呈上升趨勢[9]。UC的治療目的是達(dá)到結(jié)腸黏膜的愈合，而UC是一種病程長、極易反復(fù)發(fā)作的疾病，其活動性治療過程中處于不斷變化的過程中，因此對于UC治療過程中，對UC活動性評估對治療有著重要的指導(dǎo)作用，腸鏡檢查雖較直觀，但缺乏客觀性，并且過程較為繁瑣。Mayo評分雖被廣泛的應(yīng)用于臨床，但是其缺乏直觀性，并且評估結(jié)果極易受到影響[10]。研究表明UC屬于不明原因的非特異性炎性疾病，與腸道免疫系統(tǒng)異常密切相關(guān)[11]。自噬可通過溶酶體清除受損的細(xì)胞器以及死亡細(xì)胞等，不會引起炎性反應(yīng)[12]。ATG16L1編碼的蛋白是與自噬過程中最重要蛋白當(dāng)ATG16L1表達(dá)異常會擾亂細(xì)胞自噬過程，導(dǎo)致炎性發(fā)生[13]。研究表明ATG16L1基因多態(tài)性與IBD的發(fā)生密切相關(guān)[14]。本研究結(jié)果提示不同UC活動性的患者中，ATG16L1的mRNA相對表達(dá)量與ATG16L1表達(dá)陽性率存在顯著差異，其水平與Mayo評分呈顯著負(fù)相關(guān)。自噬缺陷可能會引起炎性反應(yīng)，甚至加劇自身免疫性疾病，研究推測自噬異常會導(dǎo)致DC遞呈微生物抗原到達(dá)腸淋巴細(xì)胞，使T細(xì)胞激活受損且分泌炎性因子減少，從而導(dǎo)致腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡，誘發(fā)UC[15-16]。本研究結(jié)果提示ATG16L1表達(dá)水平在UC活動性判定中具有一定價值。

細(xì)菌感染也是導(dǎo)致UC的重要原因，腸黏膜受損細(xì)菌侵入引會起免疫反應(yīng)[17]。既往研究表明，在正常生理條件下Gal-9表達(dá)極少，但在一些炎性因子IFN-γ、IL-1β等的刺激下表達(dá)增加[18]。近年來研究表明，彎曲菌侵入可誘發(fā)UC，并使單層腸上皮表達(dá)Gal-9的水平顯著增高，同時ATG16L1表達(dá)異常導(dǎo)致炎性也會引起Gal-9的水平升高[19]。本研究結(jié)果提示不同UC活動性的患者中，Gal-9的mRNA相對表達(dá)量與表達(dá)陽性率存在顯著差異，其水平與Mayo評分呈顯著正相關(guān)。IFN-γ、IL-1β可通過激活細(xì)胞及B細(xì)胞，促進產(chǎn)生下游細(xì)胞因子，從而發(fā)揮免疫上調(diào)作用，同時也可以促進炎癥細(xì)胞釋放炎性因子，發(fā)揮促炎癥作用，說明Gal-9可作為一種反應(yīng)UC活動性的評價指標(biāo)[20]。

綜上所述，UC患者ATG16L1、Gal-9表達(dá)水平存在顯著異常，并且不同UC活動性間的ATG16L1、Gal-9表達(dá)水平存在顯著差異，ATG16L1表達(dá)水平與Mayo評分呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，Gal-9表達(dá)水平與Mayo評分呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)關(guān)系，可作為判定UC活動性的指標(biāo)。

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