PCR技術(shù)在使用亞胺培南治療的患者中檢測(cè)真菌感染的臨床意義

劉東育等

doi：10.3969/j.issn.1007-614x.2017.26.66

摘要 目的：探討熒光PCR技術(shù)在使用亞胺培南治療的患者中檢測(cè)真菌感染的臨床意義。方法：選擇31例使用亞胺培南治療的患者，收集治療前后的標(biāo)本各2份。1份采用傳統(tǒng)培養(yǎng)法，1份采用PCR法檢測(cè)真菌。結(jié)果：兩種方法均檢測(cè)出白色念珠菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌。PCR法檢出陽(yáng)性11例，陽(yáng)性率35.48%；傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)陽(yáng)性5例，陽(yáng)性率16.12%。5 dPCR檢測(cè)陽(yáng)性率5.2%，7 d檢出陽(yáng)性率35.48%。結(jié)論：PCR檢測(cè)真菌感染的穩(wěn)定性好，敏感性和特異性均較理想。

關(guān)鍵詞 抗菌藥；亞胺培南；真菌病；熒光PCR技術(shù)

隨著廣譜抗菌藥的廣泛應(yīng)用，臨床條件性致病菌和耐藥菌株越來(lái)越多，特別是真菌感染日益增多，而其臨床表現(xiàn)缺乏特異性，易誤診、漏診，延誤最佳治療時(shí)機(jī)，或行真菌預(yù)防性治療導(dǎo)致過(guò)度醫(yī)療。本研究對(duì)使用亞胺培南一西司他丁鈉治療的患者應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)其血液、深部痰液中念珠菌DNA，可敏感、快速及時(shí)和準(zhǔn)確地報(bào)告結(jié)果，為診斷患者真菌感染、使用抗真菌的時(shí)機(jī)及抗真菌藥的選擇提供臨床依據(jù)。

資料與方法

標(biāo)本來(lái)源于2013年1月-2017年1月我院重癥醫(yī)學(xué)科收治需使用亞胺培南治療的患者31例，其中重癥胰腺炎7例，重癥肺炎8例，胃腸穿孔術(shù)后15例，其他1例。

傳統(tǒng)培養(yǎng)及科瑪嘉顯色鑒定：將臨床樣本接種于薩布羅培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，涂片鏡檢為真菌后接種至科瑪嘉假絲酵母菌顯色培養(yǎng)基（CHROMA-gar）中進(jìn)行培養(yǎng)，假絲酵母菌屬類(lèi)別根據(jù)菌落顏色的變化進(jìn)行鑒定。白色假絲酵母菌為翠綠色，熱帶假絲酵母菌為藍(lán)灰色，克柔假絲酵母菌為粉紅色，光滑假絲酵母菌為紫色，其他假絲酵母菌為白色（如近平滑假絲酵母菌等）。薩布羅培養(yǎng)基購(gòu)自天津市金章科技發(fā)展有限公司，科瑪嘉顯色培養(yǎng)基購(gòu)自鄭州博賽生物技術(shù)股份有限公司。

真菌基因提取及PCR擴(kuò)增：待檢標(biāo)本的真菌DNA用Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒提取，其中血液樣本先進(jìn)行紅細(xì)胞裂解處理。根據(jù)假絲酵母菌IST1、ITS2及拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ的序列設(shè)計(jì)的不同種類(lèi)的特異性引物，引物均由生工生物工程（上海）有限公司代為合成。以提取的基因組DNA為模板，采用以下試驗(yàn)體系和程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（終濃度）：1×PCR緩沖液（含MgCl₂），0.2μmol/L上、下游引物，0.2 mmol/L dNTP，DNA模板，2.5 UTaqDNA聚合酶，滅菌ddH₂O補(bǔ)齊至50μL。每次PCR試驗(yàn)均需設(shè)置空白對(duì)照（模板DNA用ddH₂O代替）及陽(yáng)性對(duì)照，整個(gè)過(guò)程需嚴(yán)格控制污染。

方法：31例患者均使用亞胺培南1.0g/次，1次/8 h，靜脈滴注治療，其余為一般對(duì)癥支持治療。收集患者亞胺培南治療前后的血液或痰液備各2份，送檢：1份傳統(tǒng)培養(yǎng)法，1份PCR法檢測(cè)真菌。于治療前、治療5 d時(shí)、治療7 d時(shí)分別送檢。其中排除治療前PCR法查真菌陽(yáng)性者。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：所有數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用X²檢驗(yàn)；P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果：在31例的臨床標(biāo)本中，兩種方法均檢測(cè)出白色念珠菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌，以白色念珠菌為多。PCR法檢出陽(yáng)性11例，陽(yáng)性率35.48%；真菌傳統(tǒng)培養(yǎng)法檢測(cè)陽(yáng)性5例，陽(yáng)性率16.12%。

PCR與傳統(tǒng)真菌培養(yǎng)法比較：兩種方法對(duì)念珠菌所檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

不同時(shí)間真菌檢測(cè)陽(yáng)性率：在31例的標(biāo)本中，5 d PCR檢測(cè)陽(yáng)性率5.2%，7d檢出陽(yáng)性率35.48%，以白色念珠菌為多見(jiàn)，見(jiàn)表2。

討論

抗菌藥物的使用是條件致病菌真菌繼發(fā)感染的主要原因，多見(jiàn)于肺部感染，主要為深部白色念珠菌感染。其中念珠菌多部位定植是重癥患者發(fā)生侵襲性真菌感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。治療期間在3～5 d即有真菌生長(zhǎng)，以5～20 d發(fā)生率最高。而傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)法需用5～7 d出結(jié)果，且敏感性不高，而PCR法2 h即可完成。傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)法與PCR法陽(yáng)性檢出率有顯著差異，充分表明了PCR法比傳統(tǒng)培養(yǎng)法靈敏。需要注意的是PCR法檢測(cè)中發(fā)生污染的可能性大，導(dǎo)致假陽(yáng)性，對(duì)檢測(cè)結(jié)果需要綜合分析。

亞胺培南一西司他丁鈉為廣譜抗菌藥，在ICU重癥感染患者中的使用較廣泛。本品適用于多種病原體所致和需氧（厭氧）菌引起的混合感染及病原菌未確定前的早期治療。本研究以亞胺培南治療后5 d PCR法檢查真菌陽(yáng)性率5.2%，7 dPCR真菌陽(yáng)性率35.48%。根據(jù)PCR法檢查結(jié)果及時(shí)給予抗真菌治療，取得了較好的臨床效果。本實(shí)驗(yàn)的目的是通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)患者疑似真菌感染進(jìn)行敏感、快速、及時(shí)和準(zhǔn)確的檢查，對(duì)患者合理使用抗真菌藥的時(shí)機(jī)及抗真菌藥物的選擇尋找依據(jù)。隨著熒光PCR標(biāo)記技術(shù)的飛速發(fā)展，其特性已應(yīng)用于念珠菌臨床快速的診斷、基因分型、耐藥等研究。endprint