圍生期低劑量鄰苯二甲酸二—（2—乙基）己酯對子代雄性大鼠發(fā)育及性激素水平的影響

郭莉 呂維名 洪世華 邱立明 曾書琴

[摘要]目的 探討圍生期低劑量鄰苯二甲酸二-（2-乙基）己酯（DEHP）暴露對子代成年雄性小鼠發(fā)育及血清睪丸中雌激素（E2）和睪酮（T）水平的影響。方法 將20只妊娠6 d的昆明小鼠隨機分為對照組、1、10、100 μg/kg DEHP染毒組，每組各5只，分別灌胃玉米油、1、10、100 μg/kg DEHP溶液，1次/d，染毒至哺乳期出生后21 d（PDN21）結(jié)束。仔鼠斷乳后每周稱量1次至PDN84時，每組隨機選取10只雄性仔鼠，摘取脾臟、肝臟、腎臟、胸腺并測定其重量，并計算臟器系數(shù)；同時測定各組小鼠血清和睪丸勻漿組織中E2和T水平。結(jié)果 100 μg/kg DEHP染毒組子代成年雄性小鼠在PDN0、49、56、63、70、77時的體重均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；各組子代成年雄性小鼠PDN84時的體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。肝臟和胸腺重量及其臟器系數(shù)方面，三組子代成年雄性小鼠與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；100 μg/kg DEHP染毒組子代成年雄性小鼠的脾臟重量及其臟器系數(shù)顯著高于對照組，腎臟重量及臟器系數(shù)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。各DEHP染毒組子代成年雄性小鼠血清中的E2水平隨著染毒劑量的增加而減少，而血清中的T水平呈上升趨勢。100 μg/kg DEHP染毒組子代成年雄性小鼠睪丸組織勻漿液中的E2水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其他組子代成年雄性小鼠的E2水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；各DEHP染毒組子代成年雄性小鼠睪丸組勻漿中的T水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 圍生期低劑量DEHP暴露對子代成年雄性小鼠的發(fā)育和睪丸組織中的E2水平具有持續(xù)的毒性作用。

[關(guān)鍵詞]鄰苯二甲酸二-（2-乙基）己酯；發(fā)育毒性；性激素

[中圖分類號] R698.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2018）12（c）-0032-04

[Abstract] Objective To investigate the effect of perinatal exposure to low-dose Di-（2-ethyl）hexyl phthalate （DEHP） on the development and the levels of estrogen （E2） and testosterone （T） in serum testis of offspring adult male mice. Methods Altogether 20 Kunming mice with 6 days of pregnancy were randomly divided into control group， 1， 10 and 100 μg/kg DEHP infected groups， with 5 mice in each group， and corn oil， 1， 10， 100 μg/kg DEHP solution were given respectively once a day to the end of 21 days after birth to lactation （PDN21）. Ten male mice were randomly selected and were weighed once a week to PDN84 after weaning from each group. The spleen， liver， kidney and thymus were extracted and weighed， and the organ coefficient was calculated. The levels of E2 and T in serum and testicular homogenate tissues were detected. Results The body weight of adult male mice at PDN0， 49， 56， 63， 70 and 77 in the 100 μg/kg DEHP group was significantly lower than that in the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in body weight between adult male mice at PDN84 （P>0.05）. There were no significant differences in weight and organ coefficient of liver and thymus between the three groups of adult male mice and the control group （P>0.05）. The spleen weight and organ coefficient of the adult male mice in the 100 μg/kg DEHP group were significantly higher than those in the control group， the kidney weight and organ coefficient were significantly lower than those in the control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The level of E2 in the serum of adult male mice of each DEHP group decreased with the increasement of the DEHP dose， while the T level in serum increased. The level of E2 in the testis homogenate of adult male mice in the 100 μg/kg DEHP group was significantly lower than that in the control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The E2 levels of adult male mice in other DEHP groups were not significantly different from those in the control group （P>0.05）. There was no significant difference in the T level between the testes of adult male mice in the DEHP groups and the control group （P>0.05）. Conclusion Low dose DEHP exposure during perinatal period has a continuous toxic effect on the development of adult male offspring and the level of E2 in testicular tissue.

[Key words] Di-（2-ethyl）hexyl phthalate； Developmental toxicity； Sex hormones

鄰苯二甲酸二-（2-乙基）己酯（DEHP）是我國塑料工業(yè)最主要的增塑劑之一，大量用于各種顏料產(chǎn)品和日用化工品等生產(chǎn)加工，相關(guān)研究已經(jīng)證實其作為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，通過各種途徑經(jīng)口、呼吸道、靜脈輸液、皮膚吸收等多種方式進入人體危害人類健康[1-3]。大量研究表明，DEHP可以損傷男性生殖功能[4-5]，但具體機制尚不明確，以及對人體后代進一步的影響尚未見報道。目前，大量研究多集中在DEHP對大鼠生殖毒性[6-7]與激素相關(guān)基因表達[8]、代謝及肝功能[9-10]影響及對子代大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)毒性[11]的影響，而對子代小鼠的發(fā)育及激素的影響尚未見報道，故本研究擬通過妊娠小鼠圍生期低劑量DEHP暴露，探討其對子代成年雄性小鼠發(fā)育及血清睪丸中雌激素（E2）和睪酮（T）水平的影響是否具有持續(xù)性，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1實驗動物與處理

成年的雄性、雌性昆明小鼠由江西中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗科技中心提供，實驗動物合格證：SCXK（贛）：2015-0003，室溫25℃，周期性光照12 h條件下，自由采食進水飼養(yǎng)[12]。將動情期雌性小鼠與同品系的雄性小鼠交配，次晨檢查初陰栓日為妊娠第1天。選擇健康妊娠昆明小鼠20只，將其隨機分為4組，包括對照組、1、10、100 μg/kg DEHP染毒組，5只/組，從妊娠第6天起，于每天固定時間，分別灌胃玉米油、1、10、100 μg/kg DEHP溶液，染毒，至哺乳期出生后21 d（PDN21）結(jié)束。仔鼠斷乳后，每組隨機抽取10只雄性小鼠，每周稱量并記錄體重至PDN84時。

1.2試劑與配制方法

DEHP（分析純）購自北京化工廠；T、E2放射免疫試劑盒購自上海信帆生物科技有限公司；DEHP染毒溶液的配制：精密稱定DEHP，溶于適量玉米油中，采用倍比稀釋法配制成實驗所需相應(yīng)濃度DEHP溶液。

1.3小鼠臟器重量測定及其臟器系數(shù)計算

斷乳第84天，稱重，處死小鼠，迅速摘取脾臟、肝臟、腎臟、胸腺，稱重后迅速將臟器組織放入液氮中保存?zhèn)溆?。計算臟器系數(shù)，臟器系數(shù)=臟器重量/體重×100%。

1.4小鼠血清中E2和T水平的測定

小鼠處死前，摘取眼球采血，室溫離心，取血清，-20℃保存，測定前，將血清恢復(fù)至室溫，采用相應(yīng)的放射免疫試劑盒分別測定E2和T濃度[13]。

1.5小鼠睪丸組織中E2和T水平的測定

處死小鼠，摘取睪丸，于-80℃冰箱保存，測定時加1 ml生理鹽水勻漿，低溫離心，取上清液，放至室溫，采用相應(yīng)的放射免疫試劑盒分別測定E2和T濃度。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，激素水平的實驗數(shù)據(jù)采用對數(shù)變換轉(zhuǎn)化成符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1各組小鼠體重的比較

100 μg/kg DEHP染毒組子代成年雄性小鼠在PDN0、49、56、63、70、77時的體重均顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；各組子代成年雄性小鼠PDN84時的體重比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.2各組小鼠臟器重量及其臟器系數(shù)的比較

肝臟和胸腺重量及其臟器系數(shù)方面，三組子代成年雄性小鼠與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；100 μg/kg DEHP染毒組子代成年雄性小鼠的脾臟重量及其臟器系數(shù)顯著高于對照組，腎臟重量及臟器系數(shù)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）（表2）。

2.3各組小鼠血清和睪丸組織勻漿中E2及T水平的比較

各DEHP染毒組子代成年雄性小鼠血清中的E2水平隨著染毒劑量的增加而減少，而血清中的T水平呈上升趨勢。100 μg/kg DEHP染毒組子代成年雄性小鼠睪丸組織勻漿液中的E2水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。其他組子代成年雄性小鼠的E2水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；各DEHP染毒組子代成年雄性小鼠睪丸組勻漿中的T水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（表3）。

3討論

DEHP會對人體健康和動物造成不同程度的危害，具有明顯的生殖發(fā)育毒性、免疫毒性、胚胎毒性、肝臟毒性及致癌性等多種毒性[14]。在體重方面，本研究結(jié)果顯示，100 μg/kg DEHP可使子代雄性小鼠體重顯著降低，與相關(guān)研究報道[15]抑制體重增長一致，但在仔鼠出生84 d時，各DEHP染毒組子代成年雄性小鼠的體重與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），與胡帥爾等[16]報道的DEHP對雌性大鼠體重增長無影響的研究結(jié)果一致，其可能是隨著子代雄性小鼠生長發(fā)育，DEHP類被小鼠體內(nèi)代謝，繼而排出體外，從而減輕對小鼠體重、發(fā)育的抑制作用。

臟器系數(shù)可作為反映實驗因素對動物組織損傷和健康影響的綜合指標[17]。本研究結(jié)果提示，100 μg/kg DEHP染毒組子代成年雄性小鼠的脾臟重量及其臟器系數(shù)均顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與衷筱琴等[18]報道一致，其原因可能是與DEHP對小鼠免疫系統(tǒng)毒性作用相關(guān)。而100 μg/kg DEHP染毒組子代成年雄性小鼠的腎臟重量及其臟器系數(shù)顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示與DEHP易在腎臟代謝及蓄積有關(guān)。

有研究表明，機體對DEHP刺激后作出的應(yīng)激反應(yīng)，過量表達一些酶以滿足機體所需的睪酮量，同時DEHP可以通過影響雄性激素合成以及雌激素受體基因表達水平而引起雄性動物內(nèi)分泌紊亂，進而造成雄性動物的生殖功能障礙[8]。本研究結(jié)果提示，100 μg/kg DEHP可使子代成年雄性小鼠睪丸組織勻漿中E2水平顯著降低，但睪丸組織中T水平以及血清中E2、T水平無顯著性變化。

綜上所述，圍生期低劑量100 μg/kg DEHP暴露對子代成年雄性小鼠的發(fā)育和睪丸組織中的E2水平具有持續(xù)的毒性作用。

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