應用分子生物學技術鑒定體液斑跡組織來源的研究進展

孫啟凡，李冉冉,2，胡 勝，李彩霞，葉 健，季安全,*

（1. 公安部物證鑒定中心，現(xiàn)場物證溯源技術國家工程實驗室，法醫(yī)遺傳學公安部重點實驗室，北京 100038；2. 山西醫(yī)科大學, 太原 030001）

法醫(yī)遺傳學對于生物物證的分析主要以DNA檢驗為基礎，利用DNA的遺傳穩(wěn)定性，通過對STR、SNP等遺傳標記的檢測，實現(xiàn)個體識別、個體信息推斷、個體間親緣關系分析等目標要求[1]。但由于DNA還具備同一性的特點，僅做序列分析無法區(qū)分其不同組織和器官來源。然而對于人源性樣本，如現(xiàn)場血跡、外周血或是月經(jīng)血、噴濺血或是鼻血，對于案件定性或重建案發(fā)現(xiàn)場很有價值。且其不同的組織屬性作為證據(jù)的效力也不相同，而法庭也經(jīng)常要求出具確認斑跡的科學證據(jù)。對生物證據(jù)科學、詳盡的描述，可有效避免證據(jù)采信過程中由于誤解或歧義而引發(fā)的糾紛甚至群體性案（事）件。這就要求對現(xiàn)場DNA來自于何種組織能夠進行準確判定。實際上，法醫(yī)學組織/體液鑒定不是一個新鮮的概念，傳統(tǒng)鑒定的方法相對較多，如基于酶促反應或免疫學檢測的生化鑒定、光譜學鑒定等。但這些方法一是特異性較低，二是檢材需求量大或者會破壞檢材，三是只能針對簡單檢材，四是對操作者的經(jīng)驗要求較高，主觀性強，結果準確度難以保證[2]。

分子生物學基礎理論及檢驗技術的發(fā)展，為解決組織來源鑒定問題提供了新手段，現(xiàn)已有應用，雖準確性有待進一步提高，但其在法庭科學的普遍推廣應予可期。

1 不同生物組織屬性來源區(qū)分的分子基礎

目前，法醫(yī)學對組織來源鑒定所使用的分子標志主要有信使RNA（messenger RNA，mRNA）、微RNA（MicroRNA，miRNA）、DNA甲基化及微生物菌群四種，之所以會選擇這些作為研究對象，與其各自生物學基礎密切相關。每個成年個體大約包含210種功能各異的細胞類型[3]，但是除了生殖細胞（精子，卵細胞）以及無核細胞（血小板、紅細胞）外，所有的體細胞均擁有相同的二倍體基因組，這也是法醫(yī)DNA分型技術的理論基礎。在胚胎發(fā)育和分化過程中，細胞的功能分化在基因組水平上是高度調(diào)控的：DNA首先轉錄成RNA，RNA再翻譯成蛋白質，此構成為生命體遺傳物質發(fā)揮功能的中心法則。而基因表達是有時空差異的。具體來講，每一個特異的細胞類型僅表達人類基因組22000個編碼基因的子集，而相應的mRNA便是這個特定子集被表達的決定因素。人類mRNA的存活周期很短，平均大約10 h，這使得細胞必須迅速改變蛋白質的合成，以適應不斷變化的需求[4]。生命體內(nèi)大約只有2 %的基因組被翻譯成蛋白質，但可轉錄成RNA的則高達85 %[5]。

一些調(diào)控性RNA如MicroRNA或能對細胞的分化起到關鍵作用[6]。MicroRNA是一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，廣泛存在于各種真核細胞中。目前，人類共發(fā)現(xiàn)并確定了1800多種MicroRNA[7]。在哺乳動物體內(nèi)，MicroRNAs主要通過抑制靶mRNA的翻譯或直接剪切靶mRNA而廣泛參與調(diào)節(jié)細胞的生長發(fā)育、分化、凋亡、衰老、疾病及腫瘤發(fā)生等眾多生命活動[8]。MicroRNA的表達具有高度的組織特異性[9]。除了mRNA以及MicroRNA的區(qū)別，不同類型細胞在表觀遺傳上也具有明顯的差異性。表觀基因組包括DNA甲基化、組蛋白修飾和染色質結構差異等。但在提取的DNA中，只有甲基化可被保留，這使得DNA甲基化可成為法庭科學應用的一種表觀遺傳學類型。DNA甲基化在胚胎發(fā)育、轉錄、染色體結構穩(wěn)定性等方面具有重要作用[10]。甲基化譜有時空特異性、細胞特異性和親源特異性，這為甲基化標記應用到法醫(yī)體液鑒定提供了理論依據(jù)[11]。

一個成年人個體大約有40萬億個細胞，除此以外，還存在有大約10倍以上的微生物菌群[7]。人類微生物組計劃已對人類微生物進行了系統(tǒng)的研究[12-14]，人類微生物廣泛存在于人類體內(nèi)，如皮膚、嘴巴、腸道、陰道等部位，能行使輔助消化或維持相關器官的健康等作用，不同的身體部位微生物群落是不一樣的[15]，這就為研究人類微生物群落從而推斷人體不同組織屬性提供了理論基礎。

2 分子生物學技術推斷生物物證組織屬性的研究進展

2.1 mRNA是生物物證組織屬性推斷技術研究中使用最成熟的分子標記物

mRNA是生物物證組織屬性推斷技術研究中使用最成熟的分子標記物，已有外周血、月經(jīng)血、唾液、陰道分泌物等多種體液組織的特異性mRNA被提取并驗證。自2011年開始，歐洲DNA分型組織結合已有研究成果，先后5次組織了實驗室間的聯(lián)合測試以考察mRNA在組織來源推斷中的能力與可行性。第一次共有16家實驗室參加，主要針對三種血液特異性的mRNA：血紅蛋白-βHBB、紅細胞血影蛋白-βSPTB以及膽色素原脫氨酶PBGD，結果發(fā)現(xiàn)15家實驗室均可從提供的血液斑中成功檢測到這三種mRNA[16]。第二次仍然是針對血液的特異性mRNA，不過其中mRNA被分成了兩組，分別是高度敏感型血紅蛋白-αHBA、HBB，中度敏感性5-氨基酮戊酸合成酶2 ALAS2, TCR-CD3分子復合物CD3G，紅細胞錨蛋白1 ANK1、 PBGD和紅細胞血影蛋白-β SPTB，這次提供的樣品包括了陳舊檢材（室溫下放置三年的棉簽血）[17]。第三次測試主要針對唾液特異性mRNA（富組蛋白3 HTN3，富絡蛋白STATH和粘蛋白7 MUC7）以及精液特異性mRNA（磷酸絲氨酸轉氨酶PSA、人魚精蛋白2 PRM2、生精蛋白1 SEMG1、轉谷氨酰胺酶4 TGM4和人魚精蛋白1 PRM1）[18]。第四、五次測試[19]則是對7種月經(jīng)血特異性mRNA（基質金屬蛋白酶7 MMP7、基質金屬蛋白酶10 MMP10、基質金屬蛋白酶11 MMP11、MSH同源蛋白1 MSX1、左右決定因子2 LEFTY2、分泌型卷直相關蛋白4 SFRP4、Hs202072）、7種陰道分泌物特異性mRNA（肌肉特異性蛋白1 MYOZ1、細胞色素P450 2B 7P1 CYP2B7P1、粘蛋白4 MUC4、人β-防御素1HBD1、詹氏乳桿菌Ljen、卷曲乳桿菌Lcris、加式乳桿菌Lgas）以及3種管家mRNA（β2-微球蛋白B2M、泛素C UBC、泛素結合酶UCE）進行了特異性、靈敏度測試，除Hs202072檢出率較低以外，其余16種均被證實可有效應用于法庭科學中。2015年，第六次測試[20]，除了針對DNA/RNA共提取以及mRNA與STR同時檢測技術外，重點測試了接觸類檢材如人類皮膚、指掌紋、衣物、電子產(chǎn)品等物證材料，特異性mRNA包括三種角質化包膜1C LCE1C、1D LCE1D、2D LCE2D，白細胞介素1F7 IL1F7，趨化因子配體27 CCL27，兜甲蛋白LOR，角蛋白9 KRT9和角膜鎖鏈蛋白CDSN，以及管家基因B2M、UBC和UCE。上述測試都證實了mRNA檢測在組織來源鑒定中的可行性。

2.2 MicroRNA區(qū)分不同體液組織屬性具有獨特優(yōu)勢

考慮到mRNA容易降解等限制，許多實驗室也在研究用MicroRNA進行此項工作。不同的實驗室各自篩選了一些特異性的MicroRNA位點組合來區(qū)分各類體液。而隨著分子檢測技術的進步，MicroRNA篩選的技術手段也在不斷更新。2009年，Hanson等[21]使用SYBR?Green qPCR技術從452個人類MicroRNA中檢測出9個具有體液差異性表達的MicroRNA，2010年，Zubakov等[22]采用寡核苷酸芯片檢測718個人類MicroRNA在法醫(yī)常見體液中的表達水平，并用TaqManqPCR技術鑒定出9個體液標記MicroRNA；2011年，Courts等[23]利用Geniom?Biochips檢測人類血液和唾液中MicroRNA的表達水平，后續(xù)的SYBRGreen-qPCR確認了6個標記MicroRNA，但并未檢測其他法醫(yī)常見體液；2016年，四川大學王正等對幾個主要實驗室的工作進行了整理[24]，綜合報道了使用二代測序技術篩選到的9個血液特異性MicroRNA以及16個唾液特異性MicroRNA，并推薦了三種特異性好的MicroRNA(miR486、miR888與miR214)以及內(nèi)參基因U6[25]。

2.3 DNA甲基化用于組織來源推斷的可行性

在人類的遺傳物質中，除了轉錄組即RNA層面具有組織特異性以外，表觀遺傳上不同組織也呈現(xiàn)出較大的不同，這包括DNA甲基化、乙?；?，但是對于提取后的DNA，只有DNA甲基化仍可以被檢測，因此，陸續(xù)有實驗室利用DNA甲基化進行組織來源推斷的研究[26]。前期的研究集中在部分基因位點上，確定了如DACT1、USP49、PRMT2和PFN3等精液特異性基因以及HOXA4等血液特異性基因[27-28]。因甲基化水平受年齡等因素影響較大，為排除其他干擾因素，Park等人使用測序芯片對血液、唾液、精液以及陰道分泌物4種體液的450000個CpG位點的甲基化水平進行了大規(guī)模篩選和驗證，發(fā)現(xiàn)并確定了8個組織特異性甲基化位點，分別是血液特異性甲基化位點cg06379435、cg08792630，唾液特異性甲基化位點cg26107890、cg20691722，精液特異性甲基化位點cg23521140、cg17610929及陰道分泌物特異性甲基化位點cg14991487、cg01774894[29]。Muangsub等人進一步使用基因芯片技術將樣本來源擴展到包括腦組織在內(nèi)的22種常見人體組織，最終篩選獲得86個組織特異性甲基化CpG位點[30]。2015年Matthew等人從基因組水平研究人類組織細胞的甲基化譜差異，除發(fā)現(xiàn)不同的組織特異性甲基化位點外，還展現(xiàn)了mCG和mCH的染色質修飾狀態(tài)和人體大量組織的轉錄狀況，提示mCH能通過作用于干細胞而抑制其向其他細胞類型分化[31]，為法醫(yī)遺傳學家利用DNA甲基化解決體液斑跡組織屬性來源鑒定問題提供了很好的參考數(shù)據(jù)。

2.4 微生物法或為體液組織來源推斷的有力工具

使用微生物法進行體液組織來源推斷，其依據(jù)是不同的菌群只能特異性的存活于特定的某種或某些體液組織中。如鏈球菌只存在于人的口腔和唾液中，故可用于唾液、噴濺血等檢材的檢驗推斷[32]。Saverio等人針對陰道、口腔和糞便菌群的基因組特異性DNA混合物建立了一種多重實時PCR檢測方法，陰道樣本顯示女性生殖道細菌的強特異信號，口腔樣本則呈現(xiàn)出極強的唾液鏈球菌信號，而糞便樣本則為腸球菌信號[33]。該復合體系適用于陳舊檢材，能夠檢測出加氏乳桿菌、卷曲乳桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球、變形鏈球菌、金黃色釀膿葡萄球菌等6種細菌種類。人體體液中的細菌濃度在108～109cfu/mL左右，該濃度可保證對體液斑跡進行微生物檢驗的可能性[34]。

2.5 體液組織來源推斷相關實驗技術

傳統(tǒng)的組織來源推斷主要有Northern印跡技術以及微陣列芯片技術，Northern印跡技術是較早分析RNA的實驗方法，該方法因其所需檢測樣本量大、操作繁瑣、靈敏度低而限制了其廣泛應用[35]。而微陣列芯片技術因花費高，只能半定量且常伴有假陽性，故在法醫(yī)學中的應用也有一定局限性?，F(xiàn)在常用的檢測技術主要有實時熒光定量PCR以及毛細管電泳技術。實時熒光定量PCR技術是現(xiàn)在法醫(yī)工作中定量檢測RNA的金標準，其高靈敏度可用于檢測低豐度的靶分子。而毛細管電泳技術作為國內(nèi)法醫(yī)遺傳學的主流技術，對mRNA的檢測同樣適用，該技術還可以實現(xiàn)DNA/RNA的共檢測，因此，在體液斑跡鑒定領域具有較好的應用前景，如歐洲DNA分型組織進行的數(shù)次實驗室間比對測試，主要就是利用毛細管電泳平臺進行結果分析和檢測。另外，隨著二代測序技術的逐漸成熟，越來越多的法醫(yī)學問題會有望解決，在體液鑒定技術方面，可通過轉錄組測序技術用來篩選新的遺傳標記物，包括lncRNA、circRNA等，同時該技術還可用來對mRNA及miRNA進行測序和定量，能夠建立其更精細化的表達模式[25]。

3 各分子標記物的優(yōu)缺點分析與對策

法醫(yī)學家一直致力于尋找不同體液斑跡或組織來源的特異性遺傳標記物，如MicroRNA、mRNA或DNA甲基化。但是，一方面，體液本身就是一種成分極其復雜的混合物，另一方面，個體因其生活環(huán)境、習慣、身體狀況、年齡、性別的差異都可能導致表達上的差異。因而單純尋找某一種特異性標記物可能尚不足以從根本上解決問題，而事實上，各種遺傳標記也都其各自的問題。

3.1 使用單一特異性分子標記物進行組織來源推斷所存在的問題

RNA是DNA的轉錄產(chǎn)物，直接指導蛋白質的表達從而決定細胞表型。但是，mRNA十分不穩(wěn)定，極易降解。法醫(yī)實踐中遇到的檢材多為陳舊樣本，很可能會因為mRNA不同程度的降解而影響檢驗結果的準確性。

MicroRNA在生物體內(nèi)發(fā)揮作用的方式是靶向mRNA，通過調(diào)節(jié)mRNA的表達來間接影響細胞表型。MicroRNA片段短，不易降解，在法醫(yī)實踐中具有良好的應用前景。但是，利用MicroRNA進行體液來源推斷研究依然存在問題，一是不同實驗室、不同技術手段之間篩選的MicroRNA標記物并非完全一致，可重復性差[21-24]；二是相對mRNA來說，MicroRNA含量較低，提取難度高，對檢材需要量就相對較大，這可能是制約MicroRNA解決組織來源推斷的瓶頸；三是由于MicroRNAs在不同的生理和病理學過程中表達具有差異性，其異常表達往往與癌癥、神經(jīng)紊亂和心臟疾病等有關，故可能會影響其在法醫(yī)學中的應用[36]。

DNA甲基化在組織來源推斷中的優(yōu)勢在于其DNA含量相對較高，因此檢測靈敏性較高[29]，同時有研究發(fā)現(xiàn)CODIS 20個STR遺傳標記均不含有甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶HhaI的識別位點，即DNA甲基化識別體系與STR分型體系能夠互相兼容[37]。但也仍有問題：一是DNA的甲基化修飾屬表觀遺傳學范疇，會受到年齡、疾病等因素的影響，位點篩選及確定需慎重，二是DNA甲基化檢測難度較大，雖然未來可能實現(xiàn)用單分子實時測序技術直接進行檢測[28]，但目前還只能對其進行間接檢測，如使用甲基化敏感性限制性內(nèi)切酶以及重亞硫酸鹽測序法等。

微生物種類在使用中存在的問題在于檢材尤其是離體檢材被檢測到的微生物種類，會因微生物本身的生長或降解而導致其種類發(fā)生變化，此外隨著人體組織成分的降解以及環(huán)境中微生物的滋生等原因，微生物種類也會相異[26]。但鑒于微生物種類的穩(wěn)定性以及研究方法的復雜性，其價值需進一步研究探討。

3.2 體液斑跡組織來源推斷可結合多種手段實現(xiàn)技術突破

一是要細化樣本來源，加大樣本量積累，提高數(shù)據(jù)的可靠性和準確性。與基因組DNA不同，可用于組織來源鑒定的遺傳標記大多與表達相關，故個體的年齡、性別、健康狀況等都可能影響特異性分子標記物的篩選[36-37]。這就要求在研究過程中，需細化被篩選樣本的來源特征，設定兼顧不同年齡、不同性別等多方面因素的實驗方案，同時，針對確定的生物大分子如mRNA、MicroRNA以及DNA甲基化等，應進行大量樣本的驗證工作，以保證實驗結論的科學性和準確性。

二是多種遺傳標記與技術手段聯(lián)合運用，綜合分析以判斷組織來源。上文也有介紹，具備體液特異性的生物大分子在實際應用中各有優(yōu)劣，因此在實際研究工作中需打破尋找某單一種遺傳標記進行推斷研究的傳統(tǒng)思路，可多種分子標記同時使用[26]。

三是建立DNA/RNA共提取技術，實現(xiàn)檢材的充分利用。目前法醫(yī)DNA的STR分型技術是實現(xiàn)個體識別的主要手段，也是判定和尋找嫌疑人的重要工具。在對體液檢材進行組織屬性來源推斷時，在提取mRNA、MicroRNA等生物大分子的同時，更要保證DNA的有效利用。因此，實現(xiàn)DNA/RNA高效共提取技術，可實現(xiàn)生物檢材的最大效率使用，從而提供盡可能多的破案信息。

四是建立并提高針對微量檢材RNA提取的手段與能力。目前比較成熟和完善的組織特異性分子標記物主要是RNA（包括mRNA和MicroRNA），而針對RNA的檢測手段十分成熟，基于電化學傳感器的體液MicroRNA其檢測靈敏度甚至可達0.1pmol[38]。然而由于mRNA的穩(wěn)定性相對較差，而MicroRNA的含量又相對較低，微量生物檢材中RNA的提取難度較大。因此實現(xiàn)現(xiàn)場微量生物物證組織屬性的準確判定，可能受制于生物標記物（如RNA）的提取技術。

4 展望

新的刑訴法對于物證檢驗鑒定工作提出了更高要求，為了適應新刑訴法實施的需要,生物物證應為案情提供更多的信息，而對生物檢材的組織屬性來源判定就很重要。目前，針對生物大分子如mRNA、MicroRNA以及DNA甲基化等的篩選和檢測手段日趨成熟，基于宏基因組分析的微生物研究也愈益完善，新的特異性分子標記物也被不斷報道，這些都為建立法醫(yī)學適用的特異性生物大分子檢測技術從而推斷生物物證組織的屬性來源提供了幫助和支持。

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