超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定食品中堿性嫩黃O的含量

◎ 夏莉娟，馮秀娟

（1.寧夏回族自治區(qū)食品藥品審評(píng)查驗(yàn)中心，寧夏 銀川 750001；2.寧夏回族自治區(qū)食品檢測(cè)研究院，寧夏 銀川 750001）

堿性嫩黃O，又稱奧拉明O，呈黃色粉末狀，是一種工業(yè)染料，主要用于醋纖、棉織品的染色，還可用于紙張、皮革、油漆等的著色，一般接觸或者吸入都會(huì)引起中毒。GB 2760-2014《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[1]規(guī)定，嚴(yán)禁將堿性嫩黃O作為食品添加劑使用，但一些不法商販為使腐竹、豆皮的色澤光亮，把堿性嫩黃O非法加入到豆制品中（如腐竹、豆皮、豆干等），嚴(yán)重危害了廣大消費(fèi)者的身體健康[2]。目前，對(duì)食品中堿性嫩黃O的檢測(cè)方法有高效液相色譜法[3-8]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]，相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)有DB33/T 703-2008《食品和農(nóng)產(chǎn)品中多種堿性工業(yè)染料的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[10]和DBS 22/006-2012《食品中酸性橙、堿性橙2和堿性嫩黃的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》[11]。食品中堿性嫩黃O檢測(cè)時(shí)往往受到其他組分的干擾，一般需要采用梯度洗脫，有的食品基質(zhì)中其他組分的干擾較多，在前處理過程中需要凈化。目前建立的許多液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法都未經(jīng)凈化處理，很大程度上影響了檢測(cè)效果。本方法優(yōu)化了樣品處理方式，引入GPC凈化系統(tǒng)，建立了測(cè)定食品中堿性嫩黃O的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測(cè)方法并對(duì)市場(chǎng)上的部分豆制品樣品進(jìn)行抽檢，以確定建立的UPLC-MS/MS檢測(cè)方法的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

①樣品。樣品為市場(chǎng)隨機(jī)抽查的各類豆制品，包括豆干、豆腐、豆皮、腐竹、油皮。②儀器。安捷倫液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀(安捷倫公司出品)、離心機(jī)、電子天平、凝膠色譜儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。③試劑。甲醇（AR，國外進(jìn)口）、甲酸（色譜純）、環(huán)己烷（AR）、乙酸乙酯（AR），所用試劑除特別標(biāo)注外均為分析純?cè)噭?，水為超純水。④定溶液?.1%甲酸甲醇溶液+0.1%甲酸水溶液=70+30（V/V）。⑤標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Ecipse-C18，3.5 μm，2.1×100 mm；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液∶0.1%甲酸甲醇溶液=30∶70；流速：0.2 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相梯度洗脫情況見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件表

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；電噴霧電壓：4 000 V；霧化器壓力：10 L·min-1；離子源溫度：350 ℃。質(zhì)譜分析參數(shù)見表2。

表2 堿性嫩黃O的監(jiān)測(cè)離子對(duì)表

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制

準(zhǔn)確稱取堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用定溶液配制成100μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。臨用前，用定溶液根據(jù)需要稀釋配制成適當(dāng)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別為2.50、5.00、10.00、20.00、50.00 ng·mL-1和 100.00 ng·mL-1。

1.2.4 樣品的處理

1.2.4.1 提取

稱取200 g樣品，破碎均勻，然后稱取1.00 g樣品置于10 mL具塞玻璃離心管中，加入（1+1）乙酸乙酯：環(huán)己烷溶解，定容至10.0 mL，渦旋混合1 min，超聲提取 10 min，4 000 r·min-1離心 5 min。

1.2.4.2 凈化

凝膠色譜條件：凝膠凈化柱，流動(dòng)相為乙酸乙酯∶環(huán)己烷（1∶1），流速3.5 mL·min-1，5 mL定量環(huán)，預(yù)淋洗20 min，凝膠色譜平衡8 min，8～18 min收集。吸取5.0 mL離心上清液（1.2.4.1）過GPC柱進(jìn)行凈化。將收集的洗脫液旋轉(zhuǎn)至干。加入1.0 mL定溶液定容。0.22 μm膜過濾，上機(jī)測(cè)定。

1.2.5 計(jì)算公式

樣品中堿性嫩黃O的含量X按公式（1）計(jì)算：

式中，X-試樣中待測(cè)組分含量，單位為μg·kg-1；C-待測(cè)液中堿性嫩黃O的濃度，單位為ng·mL-1；C0-空白待測(cè)液中堿性嫩黃O的濃度，單位為ng·mL-1；V-樣品測(cè)試樣的最后定容體積，單位mL；m-樣品質(zhì)量，單位為g。

2 檢驗(yàn)結(jié)果

2.1 定性與定量

（1）定性。采用保留時(shí)間及相對(duì)離子豐度的最大允許偏差來定性，見表3。樣品譜圖中定性離子的相對(duì)豐度與濃度接近的標(biāo)準(zhǔn)品譜圖中定性離子的相對(duì)豐度進(jìn)行比較，偏差若在表3允許的偏差范圍內(nèi)，則可判定該待測(cè)物為目標(biāo)物。

表3 定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差表

（2）定量。將標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品同時(shí)上機(jī)，進(jìn)樣量為10 μL，采用外標(biāo)法定量。其中，定量離子對(duì)（m/z）268.2/147.1用來定量，定性離子對(duì)（m/z）268.2/252.1輔助定性。標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜圖及MRM譜圖見圖1～2，樣品的質(zhì)譜圖見圖3。

圖1 堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖

圖2 堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)品MRM譜圖

圖3 豆腐樣品質(zhì)譜圖

2.2 方法的線性范圍及檢出限

在優(yōu)化的條件下，測(cè)定配制的2.50、5.00、10.00、20.00、50.00 ng·mL-1和 100.00 ng·mL-1系 列 濃度的堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)使用液，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示。由圖4可知，其峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=3891.17X-2210.36，相關(guān)系數(shù)達(dá)0.999 4，重現(xiàn)性好，靈敏度高，儀器的檢測(cè)限為0.25 ng·mL-1，方法的檢出限為 0.5 μg·kg-1。經(jīng)測(cè)試，含量為 0.5 μg·kg-1時(shí)的色譜峰信噪比S/N＞3。

圖4 堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3 回收率及精密度試驗(yàn)

2.3.1 精密度實(shí)驗(yàn)

將配制的20 ng·mL-1堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)反復(fù)進(jìn)樣6次（n=6），結(jié)果表明堿性嫩黃O含量RSD為1.2%，說明在該質(zhì)譜條件下實(shí)驗(yàn)設(shè)備具有良好的可靠性。

2.3.2 不同樣品在同一加標(biāo)水平的回收率

隨機(jī)選取不同樣品統(tǒng)一加入1.0 mL 100 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，樣品平行測(cè)定6次，同時(shí)做空白樣試驗(yàn)，檢測(cè)其本底成分，結(jié)果見表4。由表4可知：樣品中均含有不同量的本底值，扣除空白后，樣品本身含量為零?；厥章史秶鸀?8.6%～115.3%、RSD值在8.0%～9.7%，說明基質(zhì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響很小，方法重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確可靠。

表4 堿性嫩黃O的回收率及精密度試驗(yàn)表

2.3.3 同一樣品在不同加標(biāo)水平的回收率

取1.0 g空白樣品（豆腐）添加堿性嫩黃O標(biāo)準(zhǔn)溶液，其濃度依次為 10.0、20.0、50.0 ng·mL-1，每個(gè)添加量平行6份，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)，回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差如表5所示。

表5 豆腐中堿性嫩黃O的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表

2.4 實(shí)際樣品測(cè)定

采用1.2的方法對(duì)市售的豆干、豆腐、豆皮、腐竹和油皮豆制品，共25份樣品中的堿性嫩黃O進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果所有樣品均未檢出堿性嫩黃O。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了測(cè)定食品中堿性嫩黃O的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）檢測(cè)方法。該方法前處理采用GPC進(jìn)行凈化，能夠很好的凈化和富集樣品并解放勞動(dòng)力，大大提高工作效率。該方法操作簡便、靈敏度高、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性好，儀器檢測(cè)限為0.25 ng·mL-1，方法的檢出限為0.5 μg·kg-1（S/N＞3），可作為食品安全檢測(cè)中檢測(cè)堿性嫩黃O的快速有效檢測(cè)方法。