HPLC法測(cè)定鎮(zhèn)寧百香果中維生素C的含量

◎ 楊 文，李小敬

（1.安順市食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 安順 561000；2.安順市人民醫(yī)院，貴州 安順 561000）

百香果（Passion fruit）又稱西番蓮、巴西果、雞蛋果，是西番蓮科多年木質(zhì)藤本植物果實(shí)的通稱。百香果是一種原產(chǎn)南美洲的熱帶水果，因其果汁具有蟠桃、石榴、菠蘿、芒果、香蕉等多種水果的香氣而得名[1-2]，1913年引入中國(guó)，現(xiàn)已在我國(guó)南方地區(qū)大面積種植，2018年被引進(jìn)貴州安順鎮(zhèn)寧簡(jiǎn)噶鄉(xiāng)，作為該地區(qū)的扶貧產(chǎn)業(yè)。百香果果肉為黃色，味微酸，氣味芳香濃郁，含有17種氨基酸，豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、糖、維生素、鈣、磷、鐵、鉀、SOD酶和超纖維等165種對(duì)人體有益物質(zhì)，更被稱為水果中的“維生素C之王”。維生素C又叫L-抗壞血酸，是一種含不飽和烯酯結(jié)構(gòu)的酸性多羥基化合物，為水溶性維生素，分子式為C6H8O6，相對(duì)分子量質(zhì)為176.13，維生素C具有不飽和共軛結(jié)構(gòu)，在紫外-可見光區(qū)有吸收，紫外吸收最大波長(zhǎng)在244 nm附近。維生素C呈無(wú)色無(wú)臭的片狀晶體，易溶于水，不溶于脂溶劑。在酸性環(huán)境中穩(wěn)定，遇空氣中氧、熱、光、堿性物質(zhì)，特別是有氧化酶及痕量銅、鐵等金屬離子存在時(shí)，具有抗氧化作用，是知名度最高的營(yíng)養(yǎng)素[3]。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品購(gòu)于貴州省安順市鎮(zhèn)寧縣簡(jiǎn)噶鄉(xiāng)，屬于2018年該地區(qū)新引進(jìn)的扶貧產(chǎn)業(yè)，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥用植物栽培與鑒定教研室魏升華教授鑒定為西番蓮科西番蓮屬（Passionfora edulisf. flavicarpa Deg）的草質(zhì)藤本植物。

1.2 儀器與試劑

Agilent1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）、雙光束紫外可見分光光度計(jì)T1901（北京通用儀器有限責(zé)任公司）、超聲機(jī)（深圳市方奧微電子有限公司）、打漿機(jī)（九陽(yáng)股份有限公司）、雷磁PHS-3CPH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）、萬(wàn)分之一電子分析天平（AY-120，梅特勒-托利多）、十萬(wàn)分之一電子天平（梅特勒-托利多）、HPD-25無(wú)油真空泵（天津恒奧科技發(fā)展有限公司）。

維生素C對(duì)照品（批號(hào)100425-201504，中國(guó)食品藥品檢定研究院），娃哈哈純凈水（貴陽(yáng)娃哈哈飲料有限公司），甲醇（色譜純，美國(guó)天地），蒸餾水，亞硫酸鈉，磷酸二氫鉀。

2 方法

2.1 供試品的制備

把果汁取出，放到打漿機(jī)中打漿，混勻，稱取樣品約2 g，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加入0.5%亞硫酸氫鈉溶液40 mL，放到超聲機(jī)中超聲提取20 min，取出，放冷，用0.5%亞硫酸氫鈉溶液定容，混勻，過(guò)濾，待測(cè)。

2.2 對(duì)照品的制備

精密稱取維生素C對(duì)照品14.28 mg，放到50 mL容量瓶中，用入0.5%亞硫酸氫鈉溶液溶解、定容，配制的對(duì)照品質(zhì)量濃度為0.285 6 mg·mL-1對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3 最大吸收波長(zhǎng)的確定

精密稱取上述貯備液2 mL，放到25 mL的容量瓶中，用0.5%亞硫酸氫鈉溶液定容，即得維生素C使用液（質(zhì)量濃度為22.848 μg·mL-1），以維生素C標(biāo)準(zhǔn)使用液為待測(cè)樣，以0.5%亞硫酸氫鈉溶液作為空白，于200～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定吸光度。

從吸收曲線上看，維生素C在244 nm附近有最大吸收波長(zhǎng)（244 nm±2 nm都可取作為檢測(cè)波長(zhǎng)）。所以，選擇246 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。見圖1。

圖1 最大吸收波長(zhǎng)測(cè)定圖譜圖

2.4 色譜條件

百香果中維生素C的最佳色譜條件為：Phenomenex-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：采用等度洗脫，甲醇與0.01 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液（調(diào)pH至2.4）的比例為5∶95；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)246 nm；柱溫20 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 系統(tǒng)適用性

按照上述供試品制備條件下制備樣品，并進(jìn)樣得到樣品的色譜圖如圖2所示，其結(jié)果顯示維生素C的分離度，均符合要求，其理論塔板數(shù)高于10 000。

圖2 維生素C液相色譜圖

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

分別吸取維生素C使用液0、1、2、5 mL和10 mL到10 mL的容量瓶中，用入0.5%亞硫酸氫鈉溶液定容，混勻。各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液按2.4色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)；對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行回歸計(jì)算。研究得出回歸方程為Y=30.448X-1.1883，R2=0.999 9。表明維生素C在0～22.848 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。見圖3。

圖3 維生素C標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5.3 精密度的測(cè)定

按照2.1項(xiàng)下供試品溶液制備樣品連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，峰面積分別為134.803、130.364、134.715、129.691、125.433和130.497，計(jì)算精密度，其精確度RSD為2.68%，儀器符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.5.4 重復(fù)性

按照2.1項(xiàng)下供試品溶液制備樣品6份進(jìn)樣測(cè)定，分別記錄峰面積，計(jì)算含量，分別為126.6、123.1、124.3、127.8、129.0 μg·g-1和 126.0 μg·g-1，其重復(fù)性RSD為1.73%，試驗(yàn)方法符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.5.5 加標(biāo)回收率的測(cè)定

稱取樣品1 g，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加入5 mL維C標(biāo)準(zhǔn)使用液，加0.5%亞硫酸氫鈉溶液35 mL，放到超聲機(jī)中超聲提取20 min，取出，放冷，用0.5%亞硫酸氫鈉溶液定容，混勻，過(guò)濾，待測(cè)。計(jì)算加標(biāo)回收率范圍在94.43%～105.06%，見表1。試驗(yàn)方法符合實(shí)驗(yàn)要求。

表1 加標(biāo)回收率及其結(jié)果表

3 結(jié)果與分析

通過(guò)在最大吸收波長(zhǎng)246 nm處測(cè)定6個(gè)試樣的峰面積，平行測(cè)2次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算百香果中維生素C的含量。百香果維生素C平均含量為12.61 mg/100 g[4]。本次實(shí)驗(yàn)采用高效液相法的測(cè)新鮮百香果中維生素C含量處于較低水平，而蔣紅芝[2]測(cè)得百香果中維生素C含量高達(dá)50 mg/100 g，其原因可能是采摘時(shí)間與品種，亦或者是由于產(chǎn)地環(huán)境造成的。針對(duì)這一原因我們將進(jìn)行下一步的跟蹤分析，提升鎮(zhèn)寧百香果，本文采用超聲提取與高效液相色譜法測(cè)定了鎮(zhèn)寧百香果果肉中維生素C的含量。百香果果肉經(jīng)超聲提取后，用反相高效液相色譜測(cè)定[5]。實(shí)驗(yàn)測(cè)得百香果果肉中的維生素C質(zhì)量濃度為12.61 mg/100 g。這種測(cè)量方法具有高效便捷的特點(diǎn)，其測(cè)量結(jié)果更為真實(shí)準(zhǔn)確，且溶劑用量少，節(jié)約環(huán)保，可為開發(fā)利用豐富的百香果資源提供理論參考。