啤酒生產(chǎn)中的有害菌污染來源及相關(guān)檢測(cè)

◎ 胡逸帆

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023）

啤酒生產(chǎn)中染菌的危險(xiǎn)隨時(shí)存在，所以必須進(jìn)行廣泛、有規(guī)律、持續(xù)不斷的檢測(cè)才能真正起到監(jiān)控生產(chǎn)過程的微生物狀況的目的。了解污染來源和染菌途徑以及微生物通過何種途徑進(jìn)到企業(yè)生產(chǎn)中，并從哪兒進(jìn)入生產(chǎn)過程。只要了解了污染來源和染菌途徑，就可以采取針對(duì)性措施，防范污染，嚴(yán)格檢查，以保障生產(chǎn)安全性和達(dá)到食品安全衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)。

1 污染來源及染菌途徑

啤酒生產(chǎn)原料中帶有大量微生物，大麥和麥芽帶菌量可高達(dá)2×108個(gè)，主要通過灰塵擴(kuò)散到周圍空氣中，再隨空氣進(jìn)入敞口設(shè)備中。水也含有大量細(xì)菌，釀造水含菌量原則上說無意義，因?yàn)檫@些菌在麥汁煮沸時(shí)可以被殺死，重要的是生產(chǎn)用水、設(shè)備沖洗水、頂水等，它們直接與設(shè)備和啤酒接觸。酒花因要煮沸，且對(duì)微生物有抑制作用，故基本無危險(xiǎn)[1]。

空氣自身帶菌，由空瓶和原料擴(kuò)散到空氣中的菌，增加了空氣的含菌量?？掌繋в写罅康母鞣N菌，卸瓶和運(yùn)輸進(jìn)車間的過程中擴(kuò)散到灌裝車間，下料時(shí)原料上附著的灰塵連同微生物向周圍環(huán)境中擴(kuò)散。壓縮空氣同樣也可帶菌，特別是空氣管道。空氣除菌過濾器只是空氣管道得到正確維護(hù)時(shí)的補(bǔ)充，無菌要求高的需使用空氣干燥器，否則被抽進(jìn)來的水氣會(huì)一起被壓縮進(jìn)到地下室領(lǐng)域，而在地下室中水氣低于露點(diǎn)會(huì)冷凝下來，潮濕的除菌過濾器會(huì)讓微生物生存下來，特別危險(xiǎn)的是麥汁通風(fēng)、罐備壓以及皇冠蓋的壓縮空氣輸送[2]。

接種酵母擴(kuò)培過程中，保存和處理不當(dāng)都有可能染菌，如長時(shí)間存放于酵母盆中會(huì)使酵母失去活力而容易染菌，每一步操作如篩洗酵母都會(huì)增加染菌的可能性，洗酵母和將酵母保存在水中不僅會(huì)奪走酵母的營養(yǎng)物質(zhì)，而且如果水（管道、橡皮管）不是完全無菌也會(huì)導(dǎo)致染菌。設(shè)備污染主要是由于未清洗干凈或清洗水帶菌，密封圈以及密封圈下的凹槽是清洗的薄弱環(huán)節(jié)。硅藻土和穩(wěn)定劑很少帶菌，必要時(shí)需檢查。瓶蓋一般不會(huì)染菌，但也應(yīng)定期檢查。此外，在手工操作時(shí)，操作者的個(gè)人衛(wèi)生及手的清洗殺菌也不容忽視[3]。

了解了污染來源和染菌途徑，就可以有針對(duì)性地采取措施，防范污染，嚴(yán)格檢查以保障生產(chǎn)的生物安全性和啤酒的生物穩(wěn)定性。

2 啤酒生產(chǎn)麥汁、發(fā)酵液及酵母樣的處理

2.1 各樣品檢測(cè)目的

實(shí)驗(yàn)室中的樣品處理有2個(gè)目的：增殖和檢查是否存在有害菌。在實(shí)際檢測(cè)過程中，需根據(jù)所檢測(cè)樣品性質(zhì)的不同采用不同的處理方法，再根據(jù)所檢微生物的類型選擇所需的培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法。

2.1.1 培養(yǎng)基

麥汁瓊脂培養(yǎng)基可檢出酵母菌、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于檢出一般細(xì)菌，

NBB-A、NBB-B、NBB-C培養(yǎng)基可檢出啤酒有害菌。

2.1.2 樣品處理方法

（1）澄清液體樣品。用0.45 μm過濾膜過濾。

（2）混濁液體樣品。加入NBB-C培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入量為空瓶總量的3%～5%。

（3）酵母。①直接鏡檢，檢查污染程度、檢查死亡率。②加入NBB-B培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)酵母樣品。

其中，混濁液體樣品和酵母樣都可用于檢查異類酵母，麥汁樣可少量做膜過濾，濾膜可置異類酵母選擇性培養(yǎng)基上，發(fā)酵液可先放冰箱靜置讓酵母沉降，然后倒掉上清液，底部沉淀同酵母樣的處理。

2.2 材料的準(zhǔn)備

生產(chǎn)麥汁、發(fā)酵液、酵母、NBB培養(yǎng)液、美藍(lán)染色液、純培養(yǎng)酵母、接種環(huán)、1 mL無菌吸管、5 mL無菌吸管、酒精燈以及超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱等。

2.3 麥汁的處理

取40 ml生產(chǎn)麥汁樣置于50 mL取樣瓶中，加入1～2菌耳純培養(yǎng)酵母，裝上發(fā)酵栓，于25～28 ℃發(fā)酵2 d，然后加入約2 mL NBB-C培養(yǎng)基，用無菌水裝滿取樣瓶，裝上發(fā)酵栓，25～28 ℃繼續(xù)厭氧培養(yǎng)7 d。

2.4 發(fā)酵液的處理

取40 mL發(fā)酵液樣置于50 mL取樣瓶中，加入約2 mL NBB-C培養(yǎng)基，用無菌水填充取樣瓶，裝上發(fā)酵栓，25～28 ℃厭氧培養(yǎng)7 d。

2.5 酵母樣的檢測(cè)

①初步鏡檢。用接種環(huán)以無菌操作取酵母樣并制片，在顯微鏡下觀察是否有啤酒有害菌，并作記錄。②酵母死亡率的檢查。滴一滴美藍(lán)染色液在載玻片上，用接種環(huán)取酵母樣與美藍(lán)染色液混合攪勻，制成切片，5 min后，在明場(chǎng)顯微鏡下數(shù)出被染成藍(lán)色的酵母細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出藍(lán)色酵母細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比，即死亡率。被染成藍(lán)色的細(xì)胞即為死細(xì)胞。③增殖培養(yǎng)。用無菌吸管吸取1 mL稠酵母接入10 mL NBB-B培養(yǎng)基中，25～28 ℃有氧培養(yǎng)7 d。需要注意的是，取樣后如不馬上檢驗(yàn)，需儲(chǔ)存于1～5 ℃冰箱中，最長不超過20 h，4 h內(nèi)使用較好，15 min內(nèi)處理完畢最佳[4]。

3 壓縮氣體及室內(nèi)空氣的處理

3.1 材料

麥汁瓊脂培養(yǎng)基、NBB瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基以及氣體取樣器等。

3.2 壓縮氣體

將麥汁瓊脂培養(yǎng)平板、營養(yǎng)瓊脂平板及NBB-A培養(yǎng)基平板對(duì)著壓縮氣體出口處吹2～5 min，也可用專用取樣器取樣，然后帶回實(shí)驗(yàn)室。麥汁瓊脂平板和營養(yǎng)瓊脂平板上置于25～28 ℃培養(yǎng)箱中有氧培養(yǎng)2 d，NBB-A平板上置于25～28 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)5～7 d。

3.3 室內(nèi)空氣

將麥汁瓊脂平板、營養(yǎng)瓊脂平板、NBB-A培養(yǎng)基平板放在所需檢查的車間，揭開培養(yǎng)皿蓋，讓培養(yǎng)基在空氣中暴露30 min，然后蓋上培養(yǎng)皿蓋，帶回實(shí)驗(yàn)室。麥汁瓊脂平板和營養(yǎng)瓊脂平板置于25～28 ℃培養(yǎng)箱中有氧培養(yǎng)2 d，NBB-A培養(yǎng)基平板置于25～28 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)5～7 d。

4 水樣的處理

4.1 材料的準(zhǔn)備

生產(chǎn)熱水樣、釀造水樣、無菌生理鹽水、無菌棉簽、火槍、取樣瓶、酒精、棉花、膜過濾裝置、過濾膜、NBB-瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基以及麥汁瓊脂培養(yǎng)基、超凈工作臺(tái)、恒溫培養(yǎng)箱。

4.2 水樣

取3個(gè)100 mL水樣，用膜過濾方法處理，過濾后過濾膜分別置于NBB瓊脂培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和麥汁瓊脂培養(yǎng)基上。NBB瓊脂培養(yǎng)基置于25～28 ℃培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)5～7 d。營養(yǎng)瓊脂和麥汁瓊脂培養(yǎng)基置25～28 ℃培養(yǎng)箱中有氧培養(yǎng)1～2 d。

5 各樣品培養(yǎng)結(jié)果鑒定

5.1 鑒定原理及方法

培養(yǎng)后有生長現(xiàn)象的樣品，需做結(jié)果鑒定。對(duì)于使用一般細(xì)菌和酵母的基礎(chǔ)培養(yǎng)基：數(shù)菌落數(shù)，看其是否符合標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)于使用異類酵母選擇性培養(yǎng)基的樣品（表1檢測(cè)），觀察生長情況，結(jié)合微生物及宏觀特征進(jìn)行鑒定。

5.1.1 宏觀特征

①是否產(chǎn)酸，對(duì)含指示劑的培養(yǎng)基觀察顏色變化，NBB-瓊脂培養(yǎng)基若有酸產(chǎn)生，顏色會(huì)由紅變黃。對(duì)不含指示劑的培養(yǎng)基，測(cè)pH值。②是否有雙乙酰氣味或其他異味。③菌落形態(tài)特征（在固體培養(yǎng)基上）。

5.1.2 微觀特征

對(duì)產(chǎn)酸和有繁殖現(xiàn)象的樣品進(jìn)行鏡檢，觀察其菌落形態(tài)、細(xì)胞排列、暗視場(chǎng)顯微鏡中的折光性、運(yùn)動(dòng)性。

5.1.3 樣品培養(yǎng)鑒定試驗(yàn)（拔絲實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)氣實(shí)驗(yàn)）

①氫氧化鉀實(shí)驗(yàn)。從培養(yǎng)基上取出一耳菌待試驗(yàn)菌與一滿耳菌5%KOH混合于載玻片上，繼續(xù)攪動(dòng)，如果形成粘稠液，抬起接種環(huán)有拉絲現(xiàn)象，說明被試驗(yàn)細(xì)菌為KOH陽性，為革蘭氏陰性菌；如果攪動(dòng)過程中無反應(yīng)，說明被試驗(yàn)菌為KOH陰性，為革蘭氏陽性菌。②過氧化氫實(shí)驗(yàn)。在待實(shí)驗(yàn)菌的菌落上滴一滴3%～5%過氧化氫溶液，若有氣體產(chǎn)生，說明該菌為過氧化氫酶陽性，為需氧菌；若無反應(yīng)，則說明該菌為過氧化氫酶陰性，為厭氧菌；若菌落太密集，可用接種環(huán)刮取一個(gè)待試驗(yàn)菌菌落置于載玻片上，滴加過氧化氫。該試驗(yàn)主要是為了區(qū)別需氧細(xì)菌與厭氧細(xì)菌，需氧菌具有過氧化氫酶，可將過氧化氫分解為水和氧氣，厭氧菌不含過氧化氫酶，不能分解過氧化氫。

5.2 各樣品取樣結(jié)果

啤酒麥汁和發(fā)酵液測(cè)定結(jié)果表如表1、表2、表3。

表1 啤酒生產(chǎn)麥汁、發(fā)酵液測(cè)定結(jié)果表

表2 壓縮空氣及室內(nèi)空氣結(jié)果表

表3 水樣檢查結(jié)果表

6 討論

對(duì)培養(yǎng)基上的微生物進(jìn)行宏觀、微觀及試驗(yàn)觀察，對(duì)照有害菌的性質(zhì)特征，最后確定所檢出的細(xì)菌的種類。需要指出的是，未檢出結(jié)果只能說明在所處理的樣品量內(nèi)，在所用的培養(yǎng)基上，在所給定的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)以及給定的培養(yǎng)環(huán)境中無微生物生長，不能說明其他問題。

以上為在啤酒日常微生物檢測(cè)中的一些總結(jié)體會(huì)，啤酒生產(chǎn)中微生物對(duì)啤酒質(zhì)量的影響至關(guān)重要，隨著科學(xué)進(jìn)步的發(fā)展，啤酒衛(wèi)生相關(guān)檢測(cè)將進(jìn)一步大幅度的提高，以此來滿足啤酒生產(chǎn)所需要達(dá)到的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[5]。