活血消異方對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠盆腔粘連及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的影響*

李田田 孫偉偉 趙瑞華

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053)(2.北京市回民醫(yī)院，北京 100054)

盆腔粘連是子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EMs)的特征性表現(xiàn)，它與EMs相關(guān)疼痛[1]、不孕[2]及復(fù)發(fā)[3]等密切相關(guān)，且盆腔粘連使腹腔鏡手術(shù)操作困難，增加手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。本課題組前期研究表明，活血消異方能顯著改善EMs患者盆腔疼痛癥狀[4]；提高EMs小鼠IVF-ET成功率[5]；可通過(guò)下調(diào)“AAA通路”相關(guān)因子表達(dá)，抑制EMs的發(fā)生及發(fā)展[6]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)觀察活血消異方對(duì)EMs大鼠盆腔粘連程度及TGF-β1的表達(dá)影響，進(jìn)一步探討其抑制EMs盆腔粘連可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用SPF級(jí)健康性成熟未孕雌性SD大鼠54只，體質(zhì)量(220±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(京)2006-0009。飼養(yǎng)于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室:SYXK(京)2012-0001，燈光(12 L∶12D)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

水合氯醛(批號(hào)：20140304，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，中國(guó))：用100 mL無(wú)菌蒸餾水溶化10 g水合氯醛晶體，配制成10%水合氯醛溶液；苯甲酸雌二醇(批號(hào)：B131204，規(guī)格4 mg:2mL，寧波市三生藥業(yè)有限公司，中國(guó))：將2 mL苯甲酸雌二醇與植物油18 mL混合均勻，配成1∶10的苯甲酸雌二醇溶液；青霉素鈉(國(guó)藥準(zhǔn)字：H13020657，規(guī)格：80萬(wàn)單位/支，華北制藥股份有限公司，中國(guó))。注射用醋酸亮丙瑞林：(進(jìn)口注冊(cè)號(hào)：H20110290，規(guī)格：3.75 mg，IPSEN PHARMA BIOTECH-Signes-法國(guó))用無(wú)菌生理鹽水溶解，配制成0.1 mg/mL溶液；活血消異方由丹參、莪術(shù)、赤芍、雞內(nèi)金、生薏仁等組成(由中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院中藥房提供)，以上生藥加10倍量水，煎煮2次，合并煎液、過(guò)濾，藥物濃縮使藥物濃度為1.8 g生藥/mL，藥液4 ℃冰箱保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及設(shè)備

TGF-β1大鼠酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Elisa)試劑,由達(dá)科為生物科技有限公司提供； BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào)23225，規(guī)格：ReagentA：2×500 mL, ReagentB：1×25 mL,Albumin Standard：10×1 mL，美國(guó)Pierce公司)；倒置顯微鏡：IX-70，日本Olympus公司產(chǎn)品；離心機(jī)：CT15 RE型，日本HITACHI公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀：Stat Fax-2100,Awareness公司產(chǎn)品。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1EMs盆腔粘連模型制備:模型組大鼠禁食12 h后，采用自體移植法在無(wú)菌條件下進(jìn)行造模。大鼠稱重，10%水合氯醛(0.38 mL/100 g)腹腔麻醉，置于超凈臺(tái)，腹部備皮，在尿道口上約1 cm處靠左側(cè)做平行于正中線長(zhǎng)約1.5 cm的縱切口進(jìn)腹，進(jìn)腹后在膀胱背側(cè)找到子宮，游離左側(cè)子宮，近端離左子宮角 1 cm 處結(jié)扎，遠(yuǎn)端離卵巢 2 cm 處結(jié)扎，并結(jié)扎兩端間的子宮系膜血管，切除約 1.0 cm 長(zhǎng)子宮段，立即放入盛有無(wú)菌生理鹽水的培養(yǎng)皿中，用眼科剪沿系膜部剪開(kāi)管狀子宮，切割成3 mm×3 mm大小的子宮碎片，共4片，注意區(qū)分肌層與內(nèi)膜面，內(nèi)膜面朝向腸系膜，用5-0線縫合于右側(cè)腸系膜血管豐富處，檢查腹腔無(wú)出血后，腹腔留置青霉素鈉0.25 mL，5-0線縫合腹壁，2-0線縫合皮膚進(jìn)行逐層關(guān)腹。分籠喂養(yǎng)，待其自然蘇醒。術(shù)后連續(xù)3 d肌注青霉素鈉0.25 mL，每天1次，以預(yù)防術(shù)后感染，術(shù)后第二天開(kāi)始肌注苯甲酸雌二醇0.1 mg/kg·d-1，以促進(jìn)異位灶的生長(zhǎng)。

假手術(shù)組術(shù)前準(zhǔn)備、麻醉、子宮的切除方法同模型組，緊貼腸系膜縫4針5-0尼龍線。

1.4.2分組及給藥:將54只大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對(duì)照組(6只)、假手術(shù)組(8只)、造模組(40只)，其中造模組及假手術(shù)組按照上述方法建立模型，其中造模組術(shù)后7 d內(nèi)死亡5只，假手術(shù)組死亡2只。術(shù)后7 d隨機(jī)抽取造模組大鼠5只、假手術(shù)組2只開(kāi)腹觀察，其中造模組5只大鼠均有不同程度的盆腔粘連，假手術(shù)組未見(jiàn)明顯盆腔粘連。根據(jù)體質(zhì)量，將剩余的造模組30只大鼠隨機(jī)分為模型組(10只)、中藥組(10只)、西藥組(10只)，并開(kāi)始連續(xù)給藥，共28 d。中藥組：根據(jù)表面積換算，每只大鼠灌胃活血消異方藥液1.2 mL/日；模型組、假手術(shù)組及正常對(duì)照組，均予相同容積的生理鹽水灌胃。西藥組：醋酸亮丙瑞林0.04 mg·kg-1/日，肌肉注射，連續(xù)給藥 7 d，后 21 d按起始劑量的1/5 維持。

1.4.3取材方法:連續(xù)給藥28 d后，麻醉狀態(tài)下開(kāi)腹，對(duì)各組大鼠進(jìn)行盆腔粘連評(píng)分后，模型組、中藥組、西藥組分別采取異位灶周圍粘連腹膜組織，假手術(shù)組、正常對(duì)照組留取盆腔正常腹膜組織。將采取的組織分成兩份，第一份經(jīng)生理鹽水沖洗、濾紙吸水、稱重、機(jī)械勻漿、離心等預(yù)處理后置于-80 ℃冷凍，第二份迅速包埋于鋁箔中置于-80 ℃冷凍。

1.4.4檢測(cè)指標(biāo):

1.4.4.1 EMs盆腔粘連建模成功判定方法：造模術(shù)后第7 d開(kāi)腹觀察，若發(fā)現(xiàn)移植處有透明的小囊泡，囊內(nèi)有液體積聚，并可見(jiàn)異位灶與周圍有不同程度的粘連，則可證實(shí)造模成功。

1.4.4.2 粘連評(píng)分方法：連續(xù)給藥28 d后，開(kāi)腹充分暴露大鼠盆腔，首先由兩位研究人員參照Haber等[7]標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立進(jìn)行粘連程度評(píng)分，取二者所評(píng)分?jǐn)?shù)的平均分作為最終粘連評(píng)分：0分：無(wú)粘連-無(wú)粘連帶；1～2分：輕微粘連-有少許粘連帶，幾乎難以辨認(rèn)；3～4分：輕中度粘連-移植物周圍可見(jiàn)一些粘連帶，不需要分解；5分：中度粘連-移植物周圍有一些粘連帶，相對(duì)容易分解；6～7分：中重度粘連-粘連帶較多，大部分圍繞移植物，在腸管間也可見(jiàn)粘連帶，難以分解；8～9分：重度粘連-腸管間有很多粘連帶，粘連分解困難；10分：嚴(yán)重粘連-大量的粘連帶使腸管、腸系膜、腹膜嚴(yán)重粘連，在不損傷臟器的情況下無(wú)法分解粘連。

1.4.4.3 TGF-β1含量Elisa檢測(cè)：先按照美國(guó)Pierce公司BCA蛋白定量試劑盒使用說(shuō)明書(shū)對(duì)所取組織勻漿上清液進(jìn)行總蛋白濃度測(cè)定；然后嚴(yán)格按照Elisa試劑盒說(shuō)明書(shū)流程進(jìn)行檢測(cè)，中止反應(yīng)后在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔A405值；最后根據(jù)TGF-β1含量(ng/mg)=測(cè)定上清液樣品TGF-β1濃度(ng/mL)×稀釋倍數(shù)/上清液樣品總蛋白濃度(mg/mL)計(jì)算每毫克組織中TGF-β1蛋白含量。

1.4.4.4 TGF-β1 mRNA檢測(cè)：引物采用使用primer3.0和NCBI-primer 合成，由北京信諾金達(dá)生物技術(shù)有限公司完成，PCR所用引物序列(TGF-β1基因：上游引物5′-CACTCCCGTGGCTTCTAGTG-3′；下游引物5′-GGACTGGCGAGCCTTAGTTT-3′，擴(kuò)增大小145 bp,GAPDHmRNA上游引物5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′；下游引物5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′，擴(kuò)增大小150 bp。總RNA的提取方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并測(cè)定總RNA濃度，吸光度A260 nm/A280 nm,比值在1.8～2.0。取2 μL總RNA逆轉(zhuǎn)錄，擴(kuò)增條件：65 ℃孵育5 min，迅速冰浴2～10 min，短暫離心后加入反應(yīng)液，37 ℃孵育40 min，95 ℃孵育5 min，-20 ℃保存?zhèn)溆?，cDNA聚合酶連反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性30 s，59 ℃退火60 s,72 ℃延伸30 s，45個(gè)循環(huán),72 ℃終末延伸10 min。結(jié)果分析：取8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用BIOER PCR儀，采用2-△△ct方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的相對(duì)定量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 模型建立情況

肉眼觀察結(jié)果：5只大鼠均有不同程度的盆腔粘連，粘連部位多見(jiàn)于病灶周圍的腸管與腸管、腸管與腸系膜之間，病灶周圍與腹壁之間的粘連少見(jiàn)；移植處可見(jiàn)大小不等囊泡，囊泡內(nèi)充滿淡黃色清亮透明液體，表面有豐富的血管網(wǎng)覆蓋。假手術(shù)組腸系膜脂肪組織增厚，縫合線處未見(jiàn)明顯粘連，見(jiàn)圖1。

圖1 造模術(shù)后7 d模型組和假手術(shù)組盆腔狀況注：a.模型組；b.假手術(shù)組Fig.1 The pelvic adhesion of the model group and the sham operation group after operation 7 daysNote：a.the model group； b.the sham operation group

正常子宮內(nèi)膜及異位灶HE染色：與正常子宮內(nèi)膜相比較，異位灶呈囊狀，囊內(nèi)有黏液及炎性細(xì)胞，被覆上皮薄，腺體少，間質(zhì)薄，見(jiàn)圖2。

圖2 正常子宮內(nèi)膜與異位灶HE染色注：c.正常子宮內(nèi)膜 ×100；d.正常子宮內(nèi)膜 ×400； e.異位灶 ×100；f.異位灶 ×400Fig.2 Normal endometrial and ectopic lesions HE stainingNote: c.Normal endometrial ×100；d.Normal endometrial ×400； e.ectopic lesions ×100；f.ectopic lesions ×400

由此可見(jiàn)，隨機(jī)抽取的5只已建模大鼠均已形成EMs盆腔粘連模型，造模成功率100%。進(jìn)一步可假設(shè)造模組剩余30只大鼠已成為EMs盆腔粘連模型。

2.2 用藥后各組大鼠盆腔粘連程度比較

結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠均發(fā)生盆腔粘連，且粘連程度較重。西藥組、中藥組盆腔粘連評(píng)分均明顯低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)；西藥組盆腔粘連評(píng)分平均值略低于中藥組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3、表1。

圖3 各組大鼠盆腔粘連情況注：h.假手術(shù)組；i.模型組；j.中藥組；k.西藥組Fig.3 The pelvic adhesions of each group rats after dministrationNote: h.the sham group；i.the model group； j.Huoxue xiaoyi Fang group；k.GnRh-α group

2.3 TGF-β1蛋白表達(dá)量比較

結(jié)果顯示，模型組TGF-β1蛋白表達(dá)量顯著高于假手術(shù)組及空白組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；假手術(shù)組與空白組TGF-β1蛋白表達(dá)量相當(dāng)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；中藥組、西藥組TGF-β1蛋白表達(dá)量均顯著低于模型組，高于假手術(shù)組及空白組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；西藥組TGF-β1蛋白表達(dá)量低于中藥組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(見(jiàn)表2)

表1 各組大鼠盆腔粘連程度比較Table 1 Comparison of pelvic adhesion degree

注：*與模型組比較，P<0.05；**與模型組比較，P<0.01；#與假手術(shù)、空白組比較，P<0.01

Note：*Compared with the model group,P<0.05;**compared with the model group,P<0.01;#and sham surgery, blank group,P<0.01

2.4 TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

結(jié)果顯示，模型組TGF-β1mRNA表達(dá)量較空白組及假手術(shù)組顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；空白組與假手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組相比較，中藥組、西藥組TGF-β1 mRNA表達(dá)量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；西藥組TGF-β1 mRNA表達(dá)量低于中藥組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。(見(jiàn)表3)

表2 各組大鼠腹膜組織TGF-β1蛋白含量比較Table 2 Comparison of TGF-β1 protein relativeexpression in peritoneum among each

注：*與模型組比較，P<0.05；**與模型組比較，P<0.01；#與假手術(shù)、空白組比較，P<0.01

Note：*Compared with the model group,P<0.05;**compared with the model group,P<0.01;#and sham surgery, blank group,P<0.01

表3 各組大鼠腹膜組織TGF-β1mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Table 3 Comparison of TGF-β1 mRNA relative expressionin peritoneum among each group

注：*與模型組比較，P<0.05；**與模型組比較，P<0.01；#與假手術(shù)、空白組比較，P<0.01

Note：*Compared with the model group,P<0.05;**compared with the model group,P<0.01;#and sham surgery, blank group,P<0.01

3 討論

EMs盆腔粘連發(fā)病機(jī)制尚未明確，目前多認(rèn)為與腹膜間皮細(xì)胞的損傷和缺失、組織缺氧和炎癥相關(guān)[8]。有研究表明多種細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)參與機(jī)械性損傷腹腔粘連的形成過(guò)程，其中實(shí)驗(yàn)研究多集中在調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的合成、纖維蛋白的沉積和降解之間的平衡等方面。EMs是一種免疫性炎性疾病[9]，研究表明TGF-β與臟器纖維化相關(guān)[10]，TGF-β1 可以通過(guò)下調(diào) T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活性而抑制免疫反應(yīng)[11]，有利于內(nèi)膜細(xì)胞在腹膜腔內(nèi)逃脫機(jī)體的免疫監(jiān)視而存活，此后在異位灶的刺激下，腹腔產(chǎn)生大量的炎性因子介導(dǎo)一系列炎性反應(yīng)，導(dǎo)致盆腔粘連的形成。有研究發(fā)現(xiàn)EMs患者腹腔液中 TGF-β1 在有粘連組明顯高于無(wú)粘連組，且與粘連程度呈正相關(guān)關(guān)系[12]，這說(shuō)明TGF-β1很可能參與了EMs盆腔粘連的發(fā)生、發(fā)展。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為EMs歸屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“癥瘕”、“痛經(jīng)”、“不孕”等范疇，其病理實(shí)質(zhì)是“血瘀”，瘀血既是其致病因素，又是其病理產(chǎn)物，瘀血阻滯，日久不化而成癥瘕。李光榮教授以“離經(jīng)之血”立論，組成系列方藥，趙瑞華教授在師承李教授學(xué)術(shù)思想的基礎(chǔ)上，提出從“郁”論治，提煉核心藥物組成活血消異方。許多研究表明活血化瘀中藥有調(diào)節(jié)免疫及內(nèi)分泌、改善局部血液循環(huán)、抑制血管生成的作用，可促進(jìn)異位內(nèi)膜細(xì)胞凋亡、粘連軟化、包塊吸收、恢復(fù)卵巢功能[13-14]。活血消異方以丹參、赤芍、莪術(shù)等活血消癥中藥為主，配伍柴胡、香附疏肝理氣，共奏活血化瘀、緩消癥塊之效。

本研究通過(guò)建立EMs盆腔粘連大鼠模型，圍繞TGF-β1這一粘連形成機(jī)制的靶點(diǎn)，以活血消異方及達(dá)菲林作為干涉手段，從盆腔粘連情況、TGF-β1蛋白和基因水平進(jìn)行比較，研究?jī)?nèi)異癥盆腔粘連的發(fā)生發(fā)展與TGF-β1的關(guān)系。結(jié)果表明，假手術(shù)組在盆腔粘連發(fā)生率、盆腔粘連程度上遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于模型組；與模型組相比，活血消異方與達(dá)菲林組在給藥4周后均能改善盆腔粘連程度，顯著下調(diào)粘連組織中TGF-β1基因及蛋白表達(dá)水平，且組間無(wú)顯著性差異。說(shuō)明EMs盆腔粘連與單純機(jī)械性損傷造成的粘連不同，活血消異方和達(dá)菲林均能阻斷TGF-β1的表達(dá)以抑制盆腔粘連的形成，且兩者在抑制EMs盆腔粘連方面的療效相當(dāng)。