基于Dusp9介導的ASK1-JNKp38信號通路探討當歸芍藥散對非酒精性脂肪肝模型小鼠的作用機制

施凱舜 徐 崢 陳 巖 黃 潔

（浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院老年科，浙江 杭州 310005）

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝病，大約15%的NAFL患者會進展為相關的肝纖維化[1]，有效控制NAFL的發(fā)生發(fā)展對延緩疾病進程至關重要。研究發(fā)現(xiàn)，當歸芍藥散加減治療NAFL療效顯著，故進一步研究當歸芍藥散對NAFL的藥理機制對于指導臨床、優(yōu)化制劑有較大意義。

雙特異性磷酸酶（dual specificity phosphatase-9，Dusp9）是近十年發(fā)現(xiàn)的一類酪氨酸特異性的磷酸酶。最新研究發(fā)現(xiàn)，Dusp9可通過抑制肝細胞凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）活性，調(diào)控p38絲裂酶原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）和c-jun氨基末端激酶（JNK）的磷酸化而顯著改善非酒精性脂肪性肝炎（NASH）[2]。我們運用轉錄組芯片分析技術，對高脂高糖飲食誘導的NAFL小鼠進行了肝組織轉錄組表達譜分析，發(fā)現(xiàn)當歸芍藥散組Dusp9基因mRNA表達量較模型組顯著升高，是模型組的數(shù)倍。故本研究基于Dusp9介導探討當歸芍藥散對NAFL模型小鼠肝臟ASK1-JNKp38信號通路的影響，現(xiàn)報告如下。

1 實驗材料

1.1 動物 C57BL/6雄性小鼠，體質(zhì)量16～20 g，SPF級，購于中國科學院上海實驗動物中心。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK2018（滬）-0062。動物使用許可證號：SYXK（滬）2018-0167。所有動物均飼養(yǎng)于中國科學院上海實驗動物中心SPF級動物房，溫度20～26 ℃，相對濕度40%～70%，光照循環(huán)條件是12 h明12 h暗。飼料采用實驗室等級顆粒料，鼠采食量一般為5～6 g/d，通過水瓶自由飲水，飲水量一般為8～10 mL/d。

1.2 藥物與試劑 當歸芍藥散藥液制備：取當歸9 g、芍藥20 g、茯苓12 g、白術12 g、澤瀉20 g、川芎12 g（藥材購于上海雷允上藥業(yè)有限公司），參照授權專利ZL200610009140.0制備工藝制備成濃度分別為1.29、2.58及5.16 g/mL的低、中、高劑量藥液，冰箱冷藏備用。ASK1抑制劑Selonsertib，購于美國MCE公司（批號：00057884）。

RNAiso Plus（貨號9109），TAKARA公司；Prime Script? RT Master Mix Perfect Real Time，貨號RR036A），TAKARA公司；Power SYBR Green PCR Master Mix（貨號4367659），Thermo公司；RIPA裂解液（貨號P0013B），碧云天公司；PMSF（貨號ST506），碧云天 公 司；Dusp9抗 體（貨 號10826-1-AP），Proteintech公司；p-ASK1抗體（貨號ab278547），Abcam公司；ASK1抗體（貨號28201-1-AP），Proteintech公司；p-JNK抗 體（貨 號4168s），CST公 司；p-P38抗 體（貨 號ab170099），Abcam公司；1×PBS（貨號B548117-0500），生工生物公司；EGFR抗體（貨號10826-1-AP），Proteintech公司；Goat anti-rabbit IgG（H+L）-HRP二抗（貨號111-035-003），Jackson Immuno Research公司；封閉用羊血清（貨號ZLI-9056），北京中杉金橋公司；DAB顯色液（貨號ZLI-9018），北京中杉金橋公司；蘇木精染液（貨號BA-4097），珠海貝索生物公司。

1.3 儀器 離心機（型號：5810R），德國Eppendorf公司；熒光定量PCR儀（型號：ViiA7），美國ABI公司；漩渦混合器（型號：QL-901），海門齊林貝爾公司；紫外可見分光光度計（型號：BioPhotometer），德國Eppendorf公司；烘箱（型號：DHG-9140A），上海精宏有限公司；小型高速冷凍離心機（型號：5417R），德國Eppendorf公司；電泳儀（型號：EPS300），上海天能科技公司；化學發(fā)光儀（型號：4600），上海天能科技公司；石蠟包埋機（型號：KD-BM），浙江科迪儀器設備；石蠟切片機（型號：FINESSEME），美國Thermo公司；烤片機（型號：ZPJ-1A），天津天利航空機電公司。

2 實驗方法

2.1 分組與造模、給藥 取雄性C57BL/6小鼠參照文獻[3]的方法制作小鼠NAFL模型，予高反式脂肪酸高果糖飼料復合高糖飲水誘導10周（在此期間自由進食與飲水）。高脂飼料每克熱量為5.56 kcal，其中58%的能量來源于脂肪；高糖飲水按照42 g/L濃度配制，糖配方為55%果糖∶45%蔗糖。另取10只小鼠作為正常組，飼以對照低脂飼料，自由進食與飲水。對照飼料每克熱量為4.07 kcal，其中11%的能量來源于脂肪，飲水為正常飲用水。10周后取造模小鼠檢測血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、門冬氨酸氨基轉移酶（AST），血清和肝臟甘油三酯（TG），肝臟組織HE染色觀察病理變化，血清ALT、AST，血清和肝臟TG濃度明顯升高，肝臟組織有不同程度的脂肪變性、炎細胞浸潤和肝細胞的氣球樣變，肝細胞因脂肪變性腫脹呈橢圓形或圓形，大量的脂肪空泡充斥于胞漿內(nèi)，混合的中性粒細胞及單核細胞浸潤可見于肝小葉，提示造模成功。

取造模成功的大鼠50只，按照隨機數(shù)字表隨機分為模型組、ASK1抑制劑組和當歸芍藥散低、中、高劑量組，每組10只。當歸芍藥散低、中、高劑量組每日分別灌胃給予1.29、2.58、5.16 g/kg體質(zhì)量的當歸芍藥散藥液，小鼠用藥劑量根據(jù)《金匱要略》臨床用藥劑量按照小鼠體表面積比例換算[4]；ASK1抑制劑組每日灌胃給予30 mg/kg體質(zhì)量的ASK1抑制劑藥液，用藥劑量參照文獻[5]；模型組與正常組每日灌胃等量飲用水。各組均每日灌胃1次，連續(xù)6周，此期間各組繼續(xù)給予相應飼料及飲水。

2.2 取材 實驗第16周末，各組小鼠禁食12 h后，用2%戊巴比妥鈉（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，打開腹腔，在同一肝葉和位置切取兩小塊組織，一塊置入10%中性福爾馬林緩沖液中固定，另一塊用OCT包埋后于液氮內(nèi)冷凍，-70 ℃低溫保存，用于冰凍切片，另定位取肝組織分裝于離心管中，于-70 ℃條件下低溫保存。

2.3 觀察指標

2.3.1 肝組織Dusp9基因表達 采用Real-time PCR檢測肝組織Dusp9基因表達。取組織樣本，加1 mL RNAiso Plus（Trizol）充分裂解，混勻后室溫放置5 min；5000×g離心15 min，吸取上層水相，至另一離心管中；加入1 mL 75%乙醇，溫和顛倒離心管，4 ℃，7500×g離心5 min，棄上清；室溫晾干10 min，用20 μL DEPC H2O溶解RNA沉淀；檢測RNA純度和濃度后進行mRNA反轉錄，按照試劑盒說明書，配制mRNA逆轉錄反應體系20 μL，反應條件為37 ℃、60 min，85 ℃、5 s，反轉錄產(chǎn)物放在冰上備用；熒光定量PCR擴增，用ABI ViiA7熒光定量PCR儀進行Real time PCR反應。引物信息見表1。

表1 引物信息

2.3.2 肝組織Dusp9、p-ASK1、p-JNK以及p-p38蛋白表達水平 用Western blot檢測相關蛋白質(zhì)的表達水平。取出組織，加入RIPA裂解液使組織充分裂解后離心收集上清，即為提取的總蛋白；測好濃度的蛋白放于-80 ℃保存，將蛋白與loading buffer一起混勻后，放入100 ℃水浴5～6 min；12 000×g離心15 min，放置冰上，待上樣；電泳結束后將凝膠中的蛋白質(zhì)轉移至膜上，PBS中浸泡3～5 min，剪膜；用5%脫脂牛奶在37 ℃封閉1～2 h；洗膜3次；按抗體說明書稀釋一抗，4 ℃，搖床過夜；加二抗，37 ℃，2 h，搖床；洗膜5次；將蛋白化學發(fā)光顯影，記錄、拍照、掃描和保存。

2.3.3 免疫組化檢測肝組織Dusp9蛋白表達 取出經(jīng)4%多聚甲醛固定后的小鼠肝臟組織，脫水、包埋、切片、烤片；進行抗原修復后PBS洗3次；孵化抗體，一抗，用PBS以1∶100稀釋，滴加抗體，4 ℃過夜后室溫孵育30 min；辣根酶標記的二抗[Goat anti-Rabbit IgG（H+L）]，用PBS以1∶1000稀釋，37 ℃孵育30 min；PBST浸洗3次，每次5 min；DAB顯色，自來水終止顯色，鏡檢；蘇木素復染；經(jīng)4個濃度乙醇脫水，中性樹膠封片。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理。計量資料以（）表示，采用One-way ANOVA分析，組間多重比較采用LSD（方差齊）或Dunnett（方差不齊）法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組小鼠肝組織Dusp9基因表達 結果見圖1。模型組小鼠肝組織Dusp9基因表達較正常組顯著降低（P＜0.01），當歸芍藥散中、高劑量組Dusp9基因表達較正常組顯著升高（P＜0.01）；當歸芍藥散各劑量組以及ASK1抑制劑組Dusp9基因表達均顯著高于模型組（P＜0.01）；各給藥組組間比較見圖1，當歸芍藥散中、高劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組小鼠肝組織Dusp9基因表達比較（n=10）

3.2 各組小鼠肝組織Dusp9、p-ASK1、p-JNK及p-p38蛋白表達比較

3.2.1 各組小鼠肝組織Dusp9和p-ASK1蛋白表達比較 結果見圖2。模型組和當歸芍藥散中、高劑量組小鼠肝組織Dusp9蛋白表達與正常組比較有極顯著性差異（P＜0.01），當歸芍藥散低劑量組和ASK1抑制劑組Dusp9蛋白表達與正常組比較有顯著性差異（P＜0.05）；當歸芍藥散各劑量組以及ASK1抑制劑組Dusp9蛋白表達均顯著高于模型組（P＜0.01），且隨著當歸芍藥散濃度的增加，Dusp9蛋白表達也逐漸增加，有劑量依賴性。

圖2 各組小鼠肝組織Dusp9、p-ASK1蛋白表達western blot檢測結果比較（n=10）

模型組和當歸芍藥散各劑量組小鼠肝組織p-ASK1蛋白表達明顯高于正常組（P＜0.01），ASK1抑制劑組p-ASK1蛋白表達明顯低于正常組（P＜0.01）；各給藥組p-ASK1蛋白表達均顯著低于模型組（P＜0.01）；當歸芍藥散各劑量組組間比較，低劑量組和中劑量組無顯著性差異（P＞0.05），高劑量組顯著低于中、低劑量組（P＜0.01）。

3.2.2 各組小鼠肝組織p-JNK及p-p38蛋白表達比較 見圖3。模型組和當歸芍藥散各劑量組小鼠肝組織p-JNK蛋白表達顯著高于正常組（P＜0.01）；當歸芍藥散各劑量組p-JNK蛋白表達均顯著低于模型組（P＜0.01），且隨劑量升高，p-JNK蛋白表達逐漸降低，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）；ASK1抑制 劑組p-JNK蛋白表達較其他各組均顯著降低（P＜0.01）。

圖3 各組小鼠肝組織p-JNK及p-p38蛋白表達western blot檢測結果比較（n=10）

模型組與當歸芍藥散各劑量組小鼠肝組織p-p38蛋白表達均顯著高于正常組（P＜0.01）；當歸芍藥散中、高劑量組p-p38蛋白表達顯著低于模型組和低劑量組（P＜0.01），中、高劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；ASK1抑制劑組p-p38蛋白表達明顯低于模型組和當歸芍藥散各劑量組（P＜0.01），但與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3.3 免疫組化檢測各組小鼠肝組織Dusp9蛋白表達比較 見圖4。模型組小鼠肝組織Dusp9蛋白表達較正常組顯著降低（P＜0.01），當歸芍藥散高、中劑量組Dusp9蛋白表達較正常組顯著升高（P＜0.01）；當歸芍藥散各劑量組Dusp9蛋白表達均明顯高 于 模 型 組（P＜0.05，P＜0.01），中、高劑量組明顯高于低劑量組（P＜0.01），而中、高劑量組組間比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；ASK1抑制劑組Dusp9蛋白表達明顯低于當歸芍藥散中、高劑量組（P＜0.01）。

圖4 免疫組化檢測各組小鼠肝組織Dusp9蛋白表達比較（n=10）

4 討論

在我國，由于生活水平的提高，生活方式和飲食結構的改變，NAFL發(fā)病率快速上升。NAFL具有高患病率、低齡化趨勢以及可誘發(fā)心血管事件和肝細胞癌等特點，日益顯示出其臨床預防和治療的重要性。然而，NAFL的治療仍缺乏有效的藥物，以飲食結構調(diào)整為基礎的生活方式干預是治療NAFL的基本措施，但在臨床實踐中難以被患者廣泛接受，且治療效果也難以得到重復[6]。因此，開發(fā)有效的治療NAFL的藥物是我們面臨的重要課題。

當歸芍藥散源于經(jīng)典名著《金匱要略》，由白芍、當歸、白術、茯苓、澤瀉、川芎等藥物組成。初步臨床觀察其治療NAFL有良好的效果，對實驗性脂肪肝尤其是脂肪性肝炎治療的藥物效應強度相當理想[7]。該方以祛濕化瘀為法，組方中的6味中藥為臨床多種疾病常用藥，安全可靠。若能闡明其藥理作用機制，有望為當歸芍藥散治療NAFL提供循證醫(yī)學證據(jù)，并為促進經(jīng)方現(xiàn)代開發(fā)應用奠定基礎。

Dusp9也稱為絲裂酶原活化蛋白激酶磷酸酶4（MKP-4），是ASK1上游重要的抑制因子。YE P團隊[8]最新發(fā)表于《Hepatology》的研究表明：高脂飲食誘導NAFL小鼠肝組織中Dusp9蛋白表達顯著低于正常小鼠；肝臟特異性Dusp9基因敲除小鼠給予高脂喂養(yǎng)，肝臟甘油三酯含量顯著高于未敲除小鼠，且肝臟脂肪變性、胰島素抵抗和炎性細胞浸潤程度較未敲除鼠更加嚴重；但若過表達肝臟Dusp9基因，這些相關病理表現(xiàn)均顯著緩解。進一步機制研究證實，肝細胞Dusp9通過其201-384氨基酸結構域與ASK1蛋白上的1-678氨基酸結構域直接綁定結合，抑制ASK1磷酸化激活，進而降低肝細胞p38和JNK的磷酸化水平，緩解胰島素抵抗、肝臟脂肪沉積、炎癥，改善實驗性NAFL[9]。鑒于此，Dusp9有望成為治療NAFL的重要靶點。

當歸芍藥散治療NAFL療效確切，結合我們前期對NAFL小鼠進行的肝組織轉錄組表達譜分析，結果顯示，當歸芍藥散組Dusp9基因mRNA表達量較模型組顯著升高。本實驗發(fā)現(xiàn)，造模后模型組小鼠肝組織Dusp9基因表達較正常組顯著降低（P＜0.01），說明非酒精性脂肪肝小鼠Dusp9基因表達受到抑制。而除ASK1抑制劑組外，經(jīng)當歸芍藥散灌胃的模型小鼠出現(xiàn)了Dusp9基因表達較模型組顯著升高（P＜0.01），且當歸芍藥散中、高劑量組Dusp9基因表達較正常組也顯著性升高（P＜0.01），說明即使非酒精性脂肪肝Dusp9基因表達受到抑制，中、高劑量當歸芍藥散對Dusp9基因表達的影響也能超過正常肝臟Dusp9基因表達。進一步對Dusp9蛋白表達進行Western blot檢測，結果顯示當歸芍藥散各劑量組Dusp9蛋白表達均較模型組顯著升高，且隨著當歸芍藥散濃度的增加，Dusp9蛋白表達也逐漸增加，表明劑量依賴性。我們還對Dusp9蛋白進行了免疫組化實驗，結果也顯示和Western blot檢測結果相似：當歸芍藥散各劑量組小鼠肝組織Dusp9蛋白表達均較模型組顯著升高。以上說明當歸芍藥散治療非酒精性脂肪肝的作用靶點是Dusp9。

ASK1作為MKKK家族成員之一，是調(diào)節(jié)JNK、p38的重要激酶[10]，ASK-1控制的蛋白激酶級聯(lián)通路也被稱為ASK1-JNK/p38通路。在NAFL患者中，此通路是高度激活的，且這種過度激活與胰島素抵抗、脂肪沉積和炎癥呈正相關[11]。ASK1抑制劑被證實可顯著改善NAFL模型小鼠相關代謝參數(shù)以及肝脂肪變性、炎癥和肝纖維化程度[12]。從p-ASK1蛋白水平實驗結果來看，模型組和當歸芍藥散各劑量組p-ASK1蛋白表達較正常組顯著升高（P＜0.01），證實了非酒精性脂肪肝模型小鼠肝組織ASK1是高度激活的。進一步與模型組比較，當歸芍藥散各劑量組p-ASK1蛋白表達顯著降低（P＜0.01），且高劑量組較中、低劑量組下降更為明顯（P＜0.01），也進一步證實了當歸芍藥散是通過蛋白激酶級聯(lián)通路作用于非酒精性脂肪肝。

JNK及p38 MAPK（簡稱p38）作為MAPK家族中兩個重要的成員，參與NAFL“首次打擊”和“第二次打擊”過程，在肝臟胰島素抵抗、脂肪沉積、炎癥、壞死及纖維化等病理過程中發(fā)揮重要作用[13]。本實驗結果顯示，NAFL模型小鼠JNK蛋白和p38蛋白表達較正常組顯著升高（P＜0.01），但和模型組相比，經(jīng)當歸芍藥散灌胃處理的各組小鼠JNK蛋白和p38蛋白表達均有不同程度降低，且JNK蛋白表達顯示出隨當歸芍藥散濃度的增高表達逐漸降低的趨勢。研究結果說明當歸芍藥散的確是通過ASK1-JNKp38信號通路控制NAFL的胰島素抵抗、炎癥及纖維化等病理過程。

綜上，本實驗驗證當歸芍藥散是通過上調(diào)Dusp9抑制ASK1的磷酸化，進而調(diào)控NAFL的脂肪代謝、胰島素抵抗及炎癥，揭示該方治療NAFL的關鍵藥理機制。本課題組擬進一步研究當歸芍藥散是如何通過信號通路上調(diào)Dusp9基因表達，以徹底揭示當歸芍藥散治療NAFL的藥理機制。