4,7-二甲基香豆素的合成及潛在靶標(biāo)

劉潤(rùn)藝，薛禮運(yùn)，周 化，劉曉玲，梁曉東

(1.深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司,廣東深圳518029；2.億帆醫(yī)藥股份有限公司,安徽合肥230000)

香豆素又名苯并吡喃酮，具有抗菌、抗凝、抗腫瘤、抗癌及消炎等生理活性和光學(xué)活性，常用于食品、化妝品、醫(yī)藥、染料及光學(xué)等領(lǐng)域，用途廣泛。4,7-二甲基香豆素是一種重要的香料和醫(yī)藥中間體，一般由間甲酚與乙酰乙酸乙酯為原料進(jìn)行合成[1-2]，多用硫酸、磷酸、多聚磷酸等作為溶劑兼催化劑，但這些反應(yīng)體系較粘稠，不利于大規(guī)模生產(chǎn)，且廢酸過(guò)多，后處理較為麻煩。本實(shí)驗(yàn)以間甲酚和乙酰乙酸乙酯為原料，二氯甲烷為溶劑，硫酸為催化劑，采用Pechmann縮合反應(yīng)合成4,7-二甲基香豆素，用正交實(shí)驗(yàn)法[3]優(yōu)化4,7-二甲基香豆素的最佳合成反應(yīng)條件。該方法反應(yīng)條件溫和、后處理簡(jiǎn)單便捷、反應(yīng)體系均勻，適宜大批量生產(chǎn)，且所用硫酸量較少，對(duì)環(huán)境更為友好。為探索研究該化合物的潛在藥用價(jià)值，利用Discovery Studio進(jìn)行反向模擬找靶，4,7-二甲基香豆素的潛在靶標(biāo)可能為糖原合成酶激酶-3β。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑和儀器

間甲酚（工業(yè)級(jí)，安徽海華科技股份有限公司），乙酰乙酸乙酯（分析級(jí)，上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司），二氯甲烷（分析級(jí)，上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司），硫酸（分析級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），無(wú)水硫酸鈉（分析級(jí)，上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司），無(wú)水乙醇（分析級(jí)，上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司），實(shí)驗(yàn)用水為蒸餾水。

YRE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），YRT-3熔點(diǎn)儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司），BRUKERAVANCE III HD 400 MHz核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司），LC-20A島津液相色譜儀（日本島津儀器公司）。

1.2 合成路線

酚和β-酮酸（或酮酸酯）在酸性條件下反應(yīng)合成香豆素類化合物的反應(yīng)稱為Pechmann反應(yīng)，反應(yīng)機(jī)理為經(jīng)酯化（或酯交換）、分子內(nèi)親電取代成環(huán)、失水得到產(chǎn)物[4-5]，常用質(zhì)子酸或路易斯酸作為催化劑[6-8]。本文采用間甲酚和乙酰乙酸乙酯作為起始原料，以二氯甲烷作為反應(yīng)溶劑，硫酸作為催化劑，經(jīng)Pechmann反應(yīng)得到4,7-二甲基香豆素，反應(yīng)方程式見(jiàn)圖1。

圖1 4,7-二甲基香豆素的合成Fig.1 Synthesis of 4,7-dimethylcoumarin

1.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)得知：硫酸用量、反應(yīng)溫度和溶劑用量對(duì)反應(yīng)摩爾收率可能影響較為顯著。因此，本實(shí)驗(yàn)以4,7-二甲基香豆素摩爾收率為考核指標(biāo)，在保持n（間甲酚）∶n（乙酰乙酸乙酯）=1∶1.1的前提下，考察硫酸與間甲酚質(zhì)量比X1、反應(yīng)溫度X2和溶劑比X3三個(gè)因素對(duì)反應(yīng)的影響。具體方案見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)因素及水平Tab.1 Experimental factors and levels

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

在裝有溫度計(jì)、干燥管和攪拌子的250 mL三口燒瓶中加入6.3 g（0.058 mol）間甲酚、8.3 g（0.064 mol）乙酰乙酸乙酯和31.5 mL二氯甲烷，攪拌均勻。在5℃（低于反應(yīng)溫度約5℃）下緩慢滴加12.45 g的硫酸，0.5 h滴畢。滴畢后在10℃下保溫反應(yīng)8 h。反應(yīng)完畢后，緩慢地向反應(yīng)液中滴入60 mL水，充分?jǐn)嚢?，分出二氯甲烷層。水層以二氯甲烷提取兩次?0 mL×2）。合并二氯甲烷層，分別以60 mL水、60 mL飽和碳酸氫鈉溶液、60 mL水洗滌，加入無(wú)水硫酸鈉干燥2 h，過(guò)濾，濾液40℃下濃縮至干，得粗品，所得粗品以2倍體積的無(wú)水乙醇重結(jié)晶，得白色針狀結(jié)晶。

4,7-二甲基香豆素，熔點(diǎn)132℃（文獻(xiàn)值130～132 ℃[1]）。1H NMR(400 MHz,CDCl3)δ 7.48(d,J=8.0 Hz,1H,ArH),7.13(s,1H,ArH),7.10(d,J=8.0 Hz,1H,ArH),6.22(s,1H,CH),2.45(s,3H,CH3),2.42(s,3H,--CH3)。HPLC圖譜見(jiàn)圖2，純度99.95%，HPLC歸一化法：色譜柱為島津C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動(dòng)相為50 mmol醋酸銨緩沖液（以三氟乙酸調(diào)節(jié)pH至4.0）與乙腈的體積比為35∶65；流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm；柱溫35℃。

圖2 4,7-二甲基香豆素HPLC圖譜Fig.2 HPLC chromatogram of 4,7-dimethylcoumarin

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表3為正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。表3中K值（Ki為任意列上水平號(hào)為i時(shí)所對(duì)應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果之和）為各因素水平對(duì)指標(biāo)的總影響，R值（各列中最大K值與最小K值之差）為極差，表明各水平因素對(duì)指標(biāo)的敏感度，極差越大，所對(duì)應(yīng)的因素越重要。由表2可以得知，硫酸用量影響最大，反應(yīng)溫度次之，溶劑用量影響最小。由正交實(shí)驗(yàn)得出的最佳反應(yīng)條件為：硫酸與間甲酚質(zhì)量比為2.5；反應(yīng)溫度為20℃，二氯甲烷與間甲酚體積質(zhì)量比為15 mL/g，此時(shí)，4,7-二甲基香豆素的摩爾收率可達(dá)63.9%。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2_ Orthogonal experimental results

2.2 反應(yīng)條件對(duì)合成的影響

2.2.1 硫酸用量

在此反應(yīng)中，硫酸既是催化劑也是吸水劑。Pechmann反應(yīng)有一分子水生成，硫酸的吸水作用能有效地促使反應(yīng)向正向進(jìn)行。硫酸用量過(guò)少，反應(yīng)不能完全進(jìn)行，摩爾收率較低。從表2可以看出硫酸的最合適用量應(yīng)為間甲酚質(zhì)量的2.5倍，如果再增加硫酸，摩爾收率反而下降，可能是因?yàn)殚g甲酚在過(guò)量硫酸中發(fā)生了磺化反應(yīng)。因此，硫酸用量應(yīng)控制在2.5倍左右。

表3 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析Tab.3 Analysis of orthogonal experimental results

2.2.2 反應(yīng)溫度

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在10℃下反應(yīng)時(shí)，摩爾收率較低，可能是反應(yīng)速率過(guò)慢而導(dǎo)致間甲酚未能完全轉(zhuǎn)化。當(dāng)溫度升至30℃時(shí)，摩爾收率略微下降，可能是產(chǎn)物在較高溫度下發(fā)生磺化導(dǎo)致。因此，反應(yīng)溫度應(yīng)控制在20℃左右。

2.2.3 溶劑用量

從表2結(jié)果可以看出，溶劑對(duì)摩爾收率影響很小。二氯甲烷量增加時(shí)，摩爾收率略有增加，但增量很小。理論上二氯甲烷作為提取溶劑，量越多時(shí)提取效果越好，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示二氯甲烷與間甲酚體積質(zhì)量比為15 mL/g時(shí)摩爾收率最高。從成本考慮，在實(shí)際生產(chǎn)中選用二氯甲烷與間甲酚體積質(zhì)量比為10 mL/g。

3 潛在藥物作用靶標(biāo)探測(cè)

糖原合成酶激酶-3(GSK-3)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，以α和β兩種亞型存在，參與多種細(xì)胞功能[9]。其主要作用是糖原合成酶（GS）的磷酸化，因此GSK-3參與了2型糖尿病的發(fā)生[10]。此外，抑制GSK-3可能有助于治療神經(jīng)退行性疾病，如阿爾茨海默病[11]和神經(jīng)疾病，如雙相情感障礙[12]。由于GSK-3抑制劑具有很高的治療價(jià)值，尋找和發(fā)現(xiàn)GSK-3抑制劑具有很高的實(shí)際意義。

3.1 小分子的處理與準(zhǔn)備

將Chem Draw繪制的二維結(jié)構(gòu)導(dǎo)入DS（Discovery Studio 2018 Client）窗口中。采用Prepare Ligand工具，將小分子轉(zhuǎn)化為三維結(jié)構(gòu)，再用Full Minimization進(jìn)行能量最小化處理，此處理會(huì)對(duì)訓(xùn)練集小分子加氫和賦予CHARMm力場(chǎng)。

3.2 反向找靶

將處理好的分子作為反向找靶的配體，用DS中的Ligand Profiler功能進(jìn)行反向找靶。在PharmaDB pharmacophores中勾選Shape，添加形狀束縛的搜索限制。在Input PharmaDB pharmacophores中Model Selection設(shè)置為Most Selective，其中Most Selective便是只搜索每個(gè)蛋白的第一個(gè)藥效團(tuán)模型，最后點(diǎn)擊運(yùn)行。

3.3 找靶結(jié)果

計(jì)算機(jī)找靶發(fā)現(xiàn)5千多個(gè)靶標(biāo)，根據(jù)FitValue值，確定靶標(biāo)的可靠程度，選擇打分值較高的前20個(gè)靶標(biāo)（表4），表中具有ShapeSimilarity值的靶標(biāo)說(shuō)明4,7-二甲基香豆素與共晶復(fù)合物中的配體具有一定的形狀相似性，且值越高相似程度越大。綜合分析，PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)）中，ID號(hào)為3zrl（蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中一種蛋白質(zhì)）可能為4,7-二甲基香豆素的潛在靶標(biāo)，此靶標(biāo)為糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）。

表4 反向找靶結(jié)果Tab.4_ Results of reverse targeting

3.4 分子對(duì)接

用篩選得到的靶標(biāo)（PDB：3zrl）進(jìn)行分子對(duì)接，探究4,7-二甲基香豆素與糖原合成酶激酶-3β的分子-蛋白相互作用。

3.5 受體配體的準(zhǔn)備

在DS中，通過(guò)Prepare Protein進(jìn)行糖原合成酶激酶-3β蛋白的預(yù)處理，給蛋白去水加氫，去除雜原子。將共晶復(fù)合物配體的結(jié)合位點(diǎn)定義為對(duì)接的結(jié)合位點(diǎn)，用來(lái)進(jìn)行分子對(duì)接（圖3），球形部分為結(jié)合位點(diǎn)。4,7-二甲基香豆素作為配體，按照反向找靶的方式進(jìn)行準(zhǔn)備。對(duì)接過(guò)程中將共晶復(fù)合物的配體和4,7-二甲基香豆素一起進(jìn)行對(duì)接。

圖3 定義的活性位點(diǎn)Fig.3 Defined active site

3.6 對(duì)接參數(shù)的設(shè)置

先通過(guò)共晶復(fù)合物的配體進(jìn)行對(duì)接，計(jì)算RMSD（Root Mean Square Deviation，均方根偏差）值，保證對(duì)接參數(shù)的可靠性。通過(guò)對(duì)接結(jié)果得出的10個(gè)構(gòu)象與原共晶中的配體對(duì)比計(jì)算得出RMSD為0.4527，說(shuō)明對(duì)接參數(shù)可進(jìn)行接下來(lái)的對(duì)接程序。

3.7 對(duì)接結(jié)果

分子對(duì)接能量打分值中，原共晶配體的能量值為-33.110 9，4,7-二甲基香豆素的能量值為-24.737 4（如表5）。

表5 分子對(duì)接能量值Tab.5_ Molecular docking energy value

在對(duì)接結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，4,7-二甲基香豆素結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酯鍵的羰基氧與受體中的賴氨酸有氫鍵相互作用，與天冬氨酸有弱的碳?xì)滏I相互作用。此外，4,7-二甲基香豆素結(jié)構(gòu)中的苯環(huán)以及甲基與受體中的丙氨酸、酪氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸都有弱的相互作用（圖4，5）。

圖4 對(duì)接結(jié)果2D圖Fig.4 2D graph of docking result

圖5 對(duì)接結(jié)果3D圖Fig.5 3D graph of docking result

4 結(jié) 論

以間甲酚和乙酰乙酸乙酯為原料，以二氯甲烷為溶劑、硫酸為催化劑合成4,7-二甲基香豆素，工藝簡(jiǎn)單，摩爾收率較高。經(jīng)過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的合成條件為硫酸與間甲酚質(zhì)量比為2.5；反應(yīng)溫度為20℃，二氯甲烷與間甲酚體積質(zhì)量比為15 mL/g，4,7-二甲基香豆素摩爾收率可達(dá)63.9%。產(chǎn)品HPLC純度99.95%。利用Discovery Studio進(jìn)行反向模擬找靶，4,7-二甲基香豆素的潛在靶標(biāo)可能為糖原合成酶激酶-3β。