抗菌肽Indolicidin的研究進展

王 婧， 刁小龍， 陳曉蘭， 王帥兵， 陳海峰， 張 龍

(1.江蘇農牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300； 2.中崇信諾生物科技泰州有限公司，江蘇 泰州 225300)

抗菌肽又叫抗微生物肽、抗生素肽，是由多種生物細胞特定基因編碼經外界條件誘導產生的一類具有廣譜抗細菌、真菌、病毒、原蟲，抑殺腫瘤細胞等活性作用的多肽，是宿主細胞先天性免疫的重要效應分子。由于天然生物抗菌肽具有抗菌譜廣，熱穩(wěn)定性和水溶性好，對高等動物的正常細胞幾乎無毒害作用，不易產生耐藥性，安全環(huán)保，能提高免疫力，抗氧化[1-2]等諸多優(yōu)點使其成為國內外研究和開發(fā)的熱點，有著廣闊的開發(fā)應用前景。

隨著上世紀70年代Boman等首次在惜古比天蠶中發(fā)現(xiàn)天蠶抗菌肽以后，至今已從微生物以及動植物中分離得到上千種抗菌肽。來源于哺乳動物的抗菌肽可根據(jù)其結構和生物學特征分為防御素類和Cathelicidins兩大類[3]。其中，Cathelicidins是哺乳動物抗菌肽前體的一個大家族，最先在豬骨髓中被發(fā)現(xiàn)，后來陸續(xù)在人、鼠、羊、牛、馬等哺乳動物骨髓、外周血、睪丸等組織中被發(fā)現(xiàn)，由于這類抗菌肽存在共同相似的Cathelin功能域，故人們稱之為Cathelicidins家族。

Indolicidin即為Cathelicidins家族成員之一，它是從牛中性粒細胞胞質顆粒中分離得到的一種抗菌肽，其結構為ILPWKWPWWPWRR-NH2，僅包含6種共13個氨基酸，是目前為止已知的最小的天然線性抗菌肽，該多肽的羧基端被酰胺化，共包含39%的色氨酸殘基和23%的脯氨酸殘基，這是Cathelicidins家族，甚至是目前已知蛋白質中色氨酸含量最高的[4]。

1 Indolicidin的作用

Indolicidin抗菌譜廣，對多種需氧革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌都有很強的抗菌活性，例如銅綠假單胞菌、念珠菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、臨床分離的表皮葡萄球菌等，其殺菌量為 0.1～1.0 μmol[5]。Ando利用倍比稀釋法研究Indolicidin對于枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用，結果顯示其對這3種細菌的最低抑菌質量濃度(MIC)分別為3.13 μg/ml、1.56 μg/ml和25.00 μg/ml[6]。Selsted在10 mmol/L的磷酸鈉緩沖液中考察indolicidin對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對數(shù)期的殺滅作用，其最低殺菌質量濃度為10 μg/ml[4]。還有學者考察了諸如蜂毒肽、indolicidin、黃蜂毒素等15種短鏈抗菌肽對粘菌素敏感和粘菌素耐藥型的鮑氏不動桿菌的體外活性，結果表明Indolicidin對這2種細菌均具有一定程度的抑制作用，對粘菌素敏感型和粘菌素耐藥型的鮑氏不動桿菌的MIC50值分別為8 μg/ml 和16 μg/ml[7]。

不僅如此，Indolicidin還對一些寄生蟲(如微小隱孢子蟲和卡氏肺囊蟲)和病毒有抑制作用。有研究結果表明，單獨使用Indolicidin濃度達到50 μmol/L可降低微小隱孢子蟲裂殖子濃度至38.5%，與其他藥物配合使用效果更好。

還有研究結果表明Indolicidin可以抗人類免疫缺陷病毒(HIV-1)、單純皰疹病毒，它抗病毒所需濃度比抗細菌和抗真菌時高。Robinson等的研究結果表明Indolicidin對于HIV-1病毒的殺病毒質量濃度為333 μg/ml，37 ℃條件下IC50為 67～100 μg/ml，且表現(xiàn)出直接的劑量依賴性和時間依賴性的殺病毒活性，37 ℃作用5 min即可抑制50%的HIV病毒，而要起到完全抗病毒作用大約需作用60 min[8]。

2 Indolicidin的抗菌機理

由于Indolicidin具有廣譜抗細菌活性，加之抗菌肽所具有的優(yōu)勢使其在被發(fā)現(xiàn)以來受到了廣泛地關注和研究，但是到目前為止它的作用機制并不十分清楚。大多認為多肽的陽離子凈電荷數(shù)與其抗菌活性關系密切，而其疏水性則與溶血性一致。

早期的研究結果認為，Indolicidin可與細菌胞膜相互作用并形成跨膜離子通道，導致跨膜電位遠遠偏離正常值，引起細胞內容物外流而使細菌死亡。用Indolicidin處理大腸桿菌細胞時，能誘導細胞出現(xiàn)絲狀物質，且在抗細菌物質存在時能夠阻礙DNA合成[5]。并且Indolicidin需要達到最低濃度才可影響雙脂層的結構，低于該最低濃度檢測不到其對細胞膜的影響，而高于該濃度有嚴重的影響，即使是在高濃度下對膜引起可見的變化仍需一定的時間。在某種意義上Indolicidin在破壞膜的連續(xù)性方面有類似于表面活性劑的作用[9]。Yeh等[10]從自由能的變化角度解釋了Indolicidin更易吸附于原核細胞而不是真核細胞膜的原因，他認為決定Indolicidin特異性吸附作用的能量因素是由吸附和被吸附兩側的能量總和決定的?；贗ndolicidin的抗菌機制可能是靶向于細胞膜，有學者認為這可能是它對有囊膜的病毒也有抑制或殺滅作用的原因[8]。

不僅如此，Indolicidin被證明可以與遺傳物質和一些生物大分子相結合，最早由Falla等提出當其濃度足夠高時，Indolicidin可能抑制RNA和蛋白質大分子的合成，加之其對細胞膜的滲透作用，推測這可能是其抑菌作用的機理[5]。在隨后的研究中，有學者通過利用化學交聯(lián)和質譜足跡法進行了Indolicidin抑制HIV-1 整合酶的作用機理研究，結果表明Indolicidin可直接與DNA結合阻礙整合酶-DNA復合物的形成，而不是與整合酶相結合。同時它還能影響拓撲異構酶I對DNA進行調節(jié)使DNA結構松弛，就此推測Indolicidin通過與DNA的結合可能抑制大量的與DNA加工相關的酶。凝膠電泳試驗結果顯示隨著多肽濃度的增加，所形成的整合酶-DNA復合物逐漸減少，也就是說Indolicidin影響了整合酶與DNA的結合，尤其是Indolicidin的無精氨酸替代物RIN-25濃度在 37～333 μmol/L時可完全抑制整合酶DNA復合物的形成[11]。

雖然有一些學者提出了相反的觀點，認為Indolicidin不能與DNA結合[12-13]。但在2014年， Ghosh等[14]在試驗中發(fā)現(xiàn)Indolicidin十三肽中間的PWWP結構域是一個特殊的結構原件，該結構域能夠包繞B-型DNA雙螺旋結構，使其穩(wěn)定性更好，從而對DNA的復制和轉錄起到了抑制作用。通過熒光顯微鏡觀察利用FITC標記的Indolicidin不僅能夠定位于A549肺癌細胞細胞膜，而且能夠定位至細胞核，證實了Indolicidin可以結合于雙螺旋DNA上，這也間接證明了Indolicidin可能是通過與DNA結合而發(fā)揮抑制作用。

雙螺旋DNA結構由于有氫鍵和堿基堆積的作用格外穩(wěn)定，但是受熱后會受到影響，進一步利用圓二色譜和質譜對Indolicidin和DNA復合物熱變性進行研究，結果表明，正常DNA解鏈溫度為52.2 ℃左右，而Indolicidin與DNA的復合物的解鏈溫度為63.2 ℃，Indolicidin與DNA的復合物比DNA單獨存在時更加穩(wěn)定。Ghosh等進一步利用A-A、H-H或P-P代替PWWP結構中的WW之后，大大影響了其穩(wěn)定雙螺旋DNA的能力，推測這可能是由于WW被替換后減少了多肽的表面積和疏水性。表明PWWP作為與DNA結合時的識別區(qū)域具有重要作用，且其中的色氨酸殘基起到了重要作用[14]。

綜上所述，推測Indolicidin的抑菌機制可能是由于通過增加細胞膜的通透性，使自身進入細菌內部，一方面能夠促使細菌內容物外流，另一方面能夠與細菌DNA及DNA復制相關的蛋白質大分子相結合，抑制DNA的復制，從而起到殺菌的作用。

3 Indolicidin的構效關系

研究一個蛋白質或一個基因的功能及其分子機制的主要方法包括過表達、異源表達，基因打靶和基因沉默等手段。而蛋白質實現(xiàn)它的不同功能主要是依靠構成它的氨基酸的化學性質的多樣性以及肽鏈折疊方式的多樣性。因此有必要對蛋白質中發(fā)揮關鍵作用的氨基酸功能進行深入研究，可以通過點突變或缺失蛋白質或多肽中的關鍵氨基酸來探討其在蛋白質或多肽中的作用以及該蛋白質發(fā)揮作用的機理等。

天然抗菌肽具有較多優(yōu)勢，Indolicidin的抗菌活性較廣，然而它對真核細胞具有細胞毒性，靜脈注射毒性較大，并且具有溶血性等作用限制了其應用和發(fā)展。因此對于Indolicidin多肽中各個氨基酸在其活性以及細胞毒性方面發(fā)揮的作用有必要進行詳細的研究，為了探索Indolicidin中電荷以及色氨酸和脯氨酸對其生物活性的重要性，有學者合成一系列單個或組合突變氨基酸和脯氨酸衍生物并考察其生物活性，從而分析色氨酸及脯氨酸在Indolicidin發(fā)揮生物活性過程中的重要角色，為后期對該抗菌多肽進行人工改造等提供科學依據(jù)。

3.1 羧基端修飾的重要性

天然Indolicidin的羧基端被酰胺化，為了探討羧基端被修飾對于Indolicidin的抗菌活性是否有影響，有學者合成了一系列的衍生物。Falla等的試驗結果顯示，在合成Indolicidin衍生物中羧基端甲酯化比羧基端未甲酯化的Indolicidin抗菌效果好，尤其是對于野生型的大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌以及葡萄球菌屬細菌作用效果好，MIC介于 4～64 μg/ml[5]。而另一缺乏C端精氨酸殘基的衍生物顯示出比Indolicidin的抗細菌活性和抗真菌活性都有所降低[8]。羧基端被修飾后的Indolicidin表現(xiàn)出對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有更好的活性，這可能是由于增加了凈正電荷，同時也印證了其能夠增加對脂多糖(LPS)的結合能力，從而提高其外膜滲透作用[5]。

3.2 色氨酸的重要性

色氨酸殘基能夠提高多肽分子進入脂質雙分子層的能力，同時也導致了溶血作用的產生。用苯丙氨酸完全取代其中的5個色氨酸對于其抗菌活性并無顯著影響，但是其溶血性幾乎完全消失。替換后的多肽不能夠形成α螺旋或者β-折疊，同時也不能像其他內源性抗菌肽一樣透過細胞膜[15]。

后來，Subbalakshmi等[16]進一步合成了在Indolicidin第4位、第8位、第11位中分別保留單個色氨酸，而其他色氨酸被亮氨酸替代，例如：ILPWKLPLLPLRR-am、ILPLKLPWLPLRR-am等，并考察了這些衍生物的生物活性，結果顯示這些衍生物對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌仍具有活性，但是與Indolicidin相比稍有降低，但這些衍生物的溶血性卻消失了。

Ryge等[17]也證實色氨酸對于Indolicidin的抗菌活性并不是必須的，盡管它含有5個色氨酸。通過利用衍生化的甘氨酸殘基或其他非天然氨基酸取代其中的5個色氨酸，并測定這些衍生物的抗菌活性。結果表明，用3-(2-萘基)甘氨酸取代色氨酸的Indolicidin抗菌活性最佳，對于金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC值分別為1.2 μmol/L和2.3 μmol/L。用5個修飾的脯氨酸取代色氨酸的Indolicidin顯示出抗金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的MIC值至少提高3倍。

后來，Ando等[6]合成了一系列Indolicidin中色氨酸單個替換的衍生物，并考查了這些多肽的抗菌活性和溶血作用，結果顯示Indolicidin中第11位的色氨酸對于抗菌活性和溶血活性都相當重要且不可替換成其他氨基酸，而第4位和第9位的色氨酸分別對抗菌活性和溶血活性具有重要作用,第6位和第8位的色氨酸對于生物活性幾乎無作用。而Indolicidin的逆向衍生物比Indolicidin具有更好的抗革蘭氏陽性菌(G+)和革蘭氏陰性菌(G-)的活性，且其溶血活性顯著降低。

3.3 脯氨酸的重要性及其他

Indolicidin中含有大量的色氨酸和脯氨酸，脯氨酸主要位于第3位、第7位和第10位，最初有人認為Indolicidin中的3個脯氨酸殘基對于其生物活性并無重要作用，利用丙氨酸替換其中的3個脯氨酸后抗菌活性并未消失，然而溶血活性卻有所增加[15]。利用丙氨酸取代脯氨酸的衍生物，可增強其抗G+菌的活性[18]。用賴氨酸替換脯氨酸合成一系列衍生物，其抑菌活性、抗炎活性、中和LPS的能力與Indolicidin相當，且對機體沒有細胞毒性，有望成為新型的抗菌藥物[19]。

后來有試驗用丙氨酸替換1個或多個脯氨酸后，考察脯氨酸對Indolicidin的結構和功能的影響。最低抑菌濃度試驗和掃描電鏡試驗結果證明脯氨酸對抗菌活性和對細胞膜的分解具有重要作用。利用熒光光譜和動態(tài)光散射儀研究這些多肽與脂多糖LPS的親和力試驗證實其能分解LPS膜。這些結果表明脯氨酸對Indolicidin與脂多糖的相互作用至關重要，且第3位和第10位脯氨酸殘基對Indolicidin發(fā)揮抗菌活性尤為重要。推測該抗菌肽中出現(xiàn)多個脯氨酸是為了讓Indolicidin能夠更好地適應不同構型的“LPS”，可能是Indolicidin有多重作用機制的原因[20]。

在Indolicidin中引入賴氨酸(例如：ILKKWPWWPWRRK)，并且將其C端甲基酯化，該衍生物較Indolicidin活性提高4倍且無溶血性[21]。研究結果反映了凈正電荷對于其抗細菌活性的重要性。其他一些Indolicidin衍生物，用異亮氨酸或甘氨酸分別替換第4位、第6位、第8位的色氨酸，衍生物顯示出更好的抗細菌活性，然而缺乏這些衍生物溶血性的報道[22]。

4 Indolicidin的其他衍生物

由于Indolicidin具有較大的細胞毒性限制了其使用，為了減少其細胞毒性并提高其抗菌活性，對其進行結構修飾或者在其基礎上設計衍生物或新型抗菌肽是較常見的方法。在Park等合成的一系列衍生物中，除K2L6W3外的其他衍生物對耐甲氧西林葡萄球菌和多重耐藥綠膿桿菌的抑菌作用均比Indolicidin強。在Indolicidin的基礎上合成了一系列富含色氨酸的抗菌多肽，并比較了這些多肽與Indolicidin的抗菌活性以及治療指數(shù)等。最終表明其合成的K6L2W3展示出的最佳治療指數(shù)大約是Indolicidin的40倍[13]。

還有人采用和現(xiàn)有抗生素或抗菌肽聯(lián)合用藥或合成雜合肽的方式來考察其抗菌活性及其細胞毒性的變化情況，并發(fā)現(xiàn)了一些對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)有效的合成肽。Tsai等[23]還通過試驗證實可以通過氨基酸殘基的疏水性模塊推算對細胞滲透型抗菌肽衍生物進行前期的設計指導。

利用羥基乙酸或者甘氨酸將左氧氟沙星與Indolicidin或細胞滲透型肽(TAT)等抗菌肽相連接，發(fā)現(xiàn)左氧氟沙星與Indolicidin的結合物具有穩(wěn)定的抗菌活性。有趣的是，直接將左氧氟沙星和Indolicidin混合后其抗G-菌的活性也有所提高[24]。有研究結果表明陽離子抗菌肽與抗生素合用時能夠起到協(xié)同抗菌的作用，并能夠協(xié)同增強對MRSA細胞膜的破壞作用，因此陽離子抗菌肽也許能夠通過單獨或聯(lián)合抗生素使用來治療MRSA[25]。Jindal等[26]合成了Indolicidin和Rnanlexin天然抗菌肽的13個雜合衍生肽，其中有4個雜合抗菌肽對臨床分離的30株肺炎球菌表現(xiàn)出較好的活性，MIC為 7.81～15.62 μg/ml,且這4個雜合肽表現(xiàn)出較好的廣譜抗菌活性，抗菌譜包括敏感性和耐多種藥的金黃色葡萄球菌等。

Chang等[27]通過固相合成的方法合成了LD-indolicidin，該肽為立體異構型，由交替出現(xiàn)的順式和反式氨基酸順次組成，并且該肽對酶的降解具有更好的耐受性。在以LD-indolicidin作為佐劑的H5N1亞型流感滅活苗免疫過的小鼠脾細胞中的IFN-γ比未添加的有明顯增高,而特異性抗體IgG沒有明顯變化，表明LD-indolicidin或許可作為調節(jié)免疫反應的佐劑。Huang 等[28]也證實由乳化顆粒和LD-indolicidin組成的聯(lián)合免疫佐劑能夠增強流感滅活疫苗的血清學免疫力。還有研究者發(fā)現(xiàn)Indolicidin的衍生物能夠使燒傷模型中的抗氧化酶活性先減少后增加，表明其對燒傷有一定的修復作用[29]。Hu等[30]還報道Indolicidin具有一定的基因傳遞的能力。

5 Indolicidin的發(fā)展前景

近年來，對于Indolicidin的結構特性、生物學活性、作用機制及構效關系等的研究取得了顯著的進展。Indolicidin的衍生物MBI-226已進入Ⅲ期臨床階段，而Indolicidin的一些其他衍生物已作為治療痤瘡的藥物進入Ⅱ期臨床試驗[31]。但抗菌肽的純化技術存在困難，合成成本較高，因此利用體外表達技術，通過構建基因工程菌提高其表達量，進一步改進分離和純化技術，降低其生產成本，對其臨床制劑的開發(fā)和廣泛應用具有重要意義。