犬場暴發(fā)犬瘟熱原因分析

王思瑩,呂艷麗,張兆霞,肖 園,周靂威,夏兆飛

(中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 海淀 100193)

犬瘟熱是由副黏病毒科麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒引起多種犬的一種高度接觸性、致死性傳染病。臨床上以雙相熱、急性鼻卡他、支氣管炎、卡他性肺炎、胃腸炎、神經(jīng)癥狀為特征,部分患犬的鼻鏡和爪墊可發(fā)生過度角化[1]。犬瘟熱感染率高、發(fā)病急,患犬易繼發(fā)其他病毒或細菌感染,死亡率極高,一旦暴發(fā),可對犬業(yè)經(jīng)濟造成嚴重危害[2]。近年來犬瘟熱的感染范圍不斷擴大,成為目前對養(yǎng)犬業(yè)、野生動物保護業(yè)及經(jīng)濟動物繁殖業(yè)影響最大的一類疫病[3]。

2017年1月,北京某犬場暴發(fā)犬瘟熱疫情,通過對犬群的病史、免疫程序、血清學和病原學檢查分析發(fā)現(xiàn),導致犬群暴發(fā)犬瘟熱的主要原因為犬群疫苗免疫保護力低下,從外部引進的犬只攜帶犬瘟熱強毒,并未出現(xiàn)超強毒株。

1 發(fā)病情況

2016年10月底至11月初,該犬場先后從山東和東北地區(qū)分別引入10余只和20余只青年犬,不久后來自東北的2只犬出現(xiàn)犬瘟熱,但病犬未及時銷毀或移出場區(qū)而采用了在場區(qū)內(nèi)隔離進行姑息治療,隨后,來自山東的犬中出現(xiàn)犬瘟熱病例。之后,病情逐步蔓延至犬場內(nèi)1歲齡左右的青年犬,多只犬CDV膠體金抗原檢測結(jié)果為陽性,部分患犬病情加重并陸續(xù)死亡。與此同時,種犬場內(nèi)也發(fā)生犬瘟熱疫情,經(jīng)CDV膠體金抗原檢測,有15只犬檢測結(jié)果呈陽性。這些陽性犬只臨床癥狀輕重不一,從無癥狀、輕微臨床癥狀到嚴重臨床癥狀、死亡。本次疫情持續(xù)至2017年1月下旬,之后無新病例出現(xiàn)。

2 犬場免疫程序

該犬場犬只于1月齡時采用犬瘟熱-犬細小病毒2聯(lián)疫苗首免,然后,每間隔2周,采用犬瘟熱病毒(CDV)、犬細小病病毒(CPV)、犬腺病毒2型(CAV-2)和犬副流感病毒(CPiV)4聯(lián)疫苗(簡稱4聯(lián)苗)進行2免和3免;此后,與犬場其他犬只一起在春季和秋季分別加強免疫接種一次。在本次疫情發(fā)生前,于2016年10月進行了最后一次免疫,該免疫程序已經(jīng)在犬場使用10余年,無犬瘟熱病例發(fā)生。

3 樣品采集與CDV膠體金抗原檢測卡現(xiàn)場檢測

本次調(diào)查對16只犬間隔1個月先后兩次采集樣本。根據(jù)初次采樣前犬場工作人員測得的CDV膠體金抗原檢測結(jié)果,將犬只分為健康組(檢測結(jié)果陰性)和發(fā)病組(檢測結(jié)果陽性),健康組編號1～6號,發(fā)病組編號7～16號。樣本包括全血、血清、眼鼻口拭子以及發(fā)病組犬只的糞便樣本。為檢測犬場使用的CDV膠體金抗原檢測卡的特異性和敏感性,我們對其與北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)的CDV膠體金檢測卡同時對發(fā)病組的10只犬進行了CDV抗原檢測,結(jié)果顯示,發(fā)病組的10只犬中,有5只為陽性(編號7～11號),其余犬只為陰性,詳見表2。

發(fā)病組犬只臨床表現(xiàn)：初診時,7號犬極度消瘦,可視黏膜蒼白,眼角大量黃色膿性分泌物;8號犬于采樣前3天出現(xiàn)黑便,呼吸急促,鼻鏡干燥;9號犬于采樣前2天嚴重腹瀉;11號犬和13號犬發(fā)生腹瀉。其余犬只眼觀未見異常。

4 實驗室診斷

初診時采集16只犬的眼鼻口拭子、糞便和血清：對初診采集的眼鼻口拭子進行了CDV普通RT-PCR 檢測以及 CDV、CAV-1、CAV-2、CPiV實時熒光RT-PCR檢測,對血清進行了CDV抗體效價檢測,對糞便樣本進行了CPV-2通用和CPV-2野毒實時熒光RT-PCR檢測以及寄生蟲檢查;對二診采集的樣本進行了CDV實時熒光RT-PCR和普通RT-PCR檢測,對血清進行了CDV抗體效價檢測;對死亡和危重病例的DNA樣本進行了CDV F和H基因的序列測定與分析。

4.1 CDV普通RT-PCR和實時熒光定量PCR檢測 初診和二診分別采集16只犬的眼鼻口拭子,采用本實驗室建立的CDV RT-PCR方法對初診樣本進行CDV核酸檢測,如表1、表2所示,健康組中2(2/6)只犬的檢測結(jié)果為陽性,發(fā)病組中7(7/10)只犬的檢測結(jié)果為陰性。對初診和二診樣本進行了CDV實時熒光RT-PCR檢測,檢測結(jié)果均為陽性,但二診檢測結(jié)果中,被檢樣本的Ct值比初診時普遍升高,提示犬體內(nèi)病毒再亮顯著降低;同時進行了CAV-1,CAV-2和CPiV實時熒光RT-PCR檢測,對糞便樣本進行CPV-2實時熒光RT-PCR檢測,結(jié)果顯示,CAV-1、CPiV和CPV-2野毒均為陰性,部分犬只(12/17)呈CAV-2陽性。實時熒光RT-PCR檢測結(jié)果由北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司提供。

4.2 血清CDV抗體效價檢測 使用以色列Biogal公司的ImmunoComb Canine Vacci-CheckR三聯(lián)抗體試劑盒檢測健康組和發(fā)病組16只犬血清中的CDV抗體、CPV抗體和ICH(傳染性肝炎)抗體效價,檢測結(jié)果見表1和表2,根據(jù)試劑盒檢測說明書,當抗體效價達到S3時,表示疫苗免疫成功。12月齡以上的犬初診時CDV抗體效價均達到S3(1∶32)及以上,具有較強的免疫保護力;1歲齡以下的犬,僅有3只(3/9)抗體效價達到S3及以上;發(fā)病組中死亡和危重的4只犬年齡在6～9月齡,CDV抗體均為陰性。值得注意的是,初診時5月齡的4號犬和4月齡的16號犬,二診時抗體效價均有下降。

表1 血清CDV抗體水平檢測結(jié)果

4.3 CDV F和H基因序列分析 從7、8、9號犬和10號犬眼鼻分泌物樣品提取RNA,采用RT-PCR方法進行擴增,并將擴增產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行測序。將測序序列進行拼接,分別得到5 229 bp的基因(檢測結(jié)果由北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司提供)。序列分析顯示,4個被檢樣本的F和H基因彼此間同源性高達99%,表明親緣關(guān)系較近,可能為同一毒株或同一毒株的變異株,它們與強毒株CDV-RD-JL(KJ848781,中國農(nóng)業(yè)科學院,特種野生動植物科學研究所)親緣關(guān)系最近。

將F和H基因核苷酸序列編碼的氨基酸與CDV強毒和標準疫苗株進行了遺傳演化分析。F基因的氨基酸序列對比顯示,4個毒株的氨基酸同源性在99.5%以上,與國內(nèi)狐貍源強毒株LN(01)1(狐貍源CDV,KP765764)同源性最高,達到98.6%以上,而與標準疫苗株CDV3同源性不到89.4%。H基因的氨基酸比對結(jié)果顯示,4個毒株的氨基酸同源性高達99.7%以上,與強毒株LN(01)1毒株同源性在99%以上,與標準疫苗毒株CDV3同源性低于91.1%。F和H基因遺傳進化分析顯示,這4株病毒位于同一個小分支上,其余強毒株在同一個大的分支上,而與疫苗株相差較遠(見圖1和圖2)。

上述結(jié)果提示,該犬場感染犬的CDV毒株與強毒株親緣關(guān)系較近,屬于強毒。

圖1 CDV-F氨基酸同源性分析

4.4 糞便寄生蟲檢查 采集初診時發(fā)病組犬只的糞便樣本進行寄生蟲檢查,有3只(3/10)犬存在賈第鞭毛蟲和毛滴蟲。

5 分析與討論

圖2 CDV-F氨基酸系統(tǒng)進化樹

圖3 CDV-H氨基酸同源性分析

圖4 CDV-H氨基酸系統(tǒng)進化樹

5.1 引發(fā)本次疫情的直接原因 本次疫情發(fā)生的直接原因是引入了攜帶CDV強毒的犬只,并且在發(fā)現(xiàn)患犬后隔離措施不當、應(yīng)急措施不到位。疫情發(fā)生后,犬場未及時將發(fā)病犬只移出犬場,而是在場內(nèi)進行治療,隔離措施不嚴格是導致疫情蔓延的主要原因。嚴格按照防控措施進行管理對傳染病的防控極為重要,可以采用敏感性和特異性高的檢測方法,對引進的犬只進行重要傳染病篩查,經(jīng)檢測合格后再引進犬只;一旦發(fā)現(xiàn)患犬,立即隔離治療,病死犬及時移出場區(qū),并對犬舍和用具進行嚴格消毒。

5.2 引發(fā)本次疫情的內(nèi)部原因 犬場內(nèi)犬只疫苗免疫保護力不足是本次疫情暴發(fā)的內(nèi)部原因,該犬場的免疫程序已經(jīng)使用十余年,是國內(nèi)多數(shù)犬場使用的免疫程序,但隨著疫苗免疫應(yīng)用研究的不斷深入,免疫程序一直在逐步優(yōu)化完善。按照疫苗研發(fā)廠家或WSAVA疫苗指導小組的建議,該情況下,幼犬應(yīng)該在16～20周齡時加強免疫接種1次,或者根據(jù)疫苗免疫抗體效價選擇合理的免疫程序。本次調(diào)查中,間隔1個月的兩次血清CDV抗體效價檢測結(jié)果表明,1歲齡以下被檢犬只疫苗免疫合格率僅為33.3%(3/9),死亡的4只犬年齡在6～9月齡,體內(nèi)均無CDV抗體;初診4月齡和5月齡的兩只犬在二診時抗體效價呈下降趨勢,前者由S5下降至S4,后者由S3下降至陰性,結(jié)合死亡犬只的抗體效價分析,疫苗免疫保護力低是疫情蔓延并且造成死亡的重要原因。應(yīng)改進疫苗免疫程序,12周齡之前完成首輪免疫的犬可在16～20周齡時加強免疫1次,之后在6月齡或1歲齡時加強免疫1次。條件允許的情況下,推薦通過抗體效價檢測來確定免疫時機和免疫次數(shù)。

CDV核酸基因組編碼8種蛋白質(zhì),其中F蛋白介導病毒與宿主細胞的融合,影響CDV在宿主體內(nèi)的擴散能力,雖然F基因相對保守,但其微小的變化也會對CDV毒力產(chǎn)生重要改變;H蛋白誘導機體產(chǎn)生中和抗體,H基因變異可能導致H蛋白抗原性改變,從而使CDV逃避機體的免疫監(jiān)視[4],H蛋白和F蛋白變異可能是導致犬瘟熱在不同地區(qū)暴發(fā)的原因[5]。在疫苗免疫的壓力下,CDV易向遠離疫苗株的方向發(fā)生變異,從而導致病毒毒力的變化,這可能是導致已免疫動物仍然發(fā)病的原因之一[6]。CDV的F和H基因序列分析和遺傳演化分析結(jié)果顯示,本次導致疫情的毒株與國內(nèi)之前分離的狐貍源性毒株同源性高,說明犬只是感染了強毒株而發(fā)病?？贵w效價較高的犬只雖然發(fā)生感染,但最終康復,說明接種的疫苗對流行的強毒株有很好的抵抗力。

5.3 關(guān)于膠體金抗原檢測、普通RT-PCR和實時熒光PCR的敏感性和臨床應(yīng)用 發(fā)病組為采樣前經(jīng)膠體金抗原檢卡檢測為CDV陽性,這些犬部分無明顯臨床癥狀,在對其進行再次現(xiàn)場采樣檢驗時,部分犬只檢測結(jié)果變?yōu)殛幮?經(jīng)普通RT-PCR檢測時,檢出率明顯高于膠體金抗原檢測,而經(jīng)實時熒光PCR檢測時全部為陽性,這是由于不同檢測方法的敏感性不同。結(jié)合抗體檢測結(jié)果來看,膠體金抗原檢測結(jié)果轉(zhuǎn)為陰性可能是因為患犬機體存在CDV特異性抗體且效價較高,抵御住了抗原侵襲。健康組中,普通RT-PCR和實時熒光PCR均檢測到陽性結(jié)果,說明膠體金抗原檢測的敏感性相對較低且仍有出現(xiàn)新病例的可能。二診時,實時熒光PCR檢測為陽性而不表現(xiàn)臨床癥狀的犬只,應(yīng)為健康帶毒犬。犬瘟熱的主要傳染源為病犬、帶毒犬及病死犬,健康犬通常與病犬直接或間接接觸后通過氣溶膠微滴或飛沫經(jīng)呼吸道、消化道感染病毒[3],未發(fā)病犬只可能處于病毒感染的潛伏期,臨床癥狀不易被察覺。犬在感染的5～7 d開始排毒,由于檢測樣本為鼻咽拭子,如果犬未開始排毒,可導致病原學檢測結(jié)果為CDV陰性。