豬流行性腹瀉傳染性胃腸炎雙重RT-PCR檢測方法的建立及優(yōu)化

趙光偉,涂少宇,汪 洋,賀 然,賴靖堯,譚陽春,郭道兵,牛晨霞,楊曉偉

(西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,重慶 榮昌 402460)

豬傳染性胃腸炎(TGE)與豬流行性腹瀉(PED)都是一種由冠狀病毒引起的一種急性胃腸道傳染病,臨床上以突然發(fā)病、傳播迅速、嘔吐、水樣腹瀉、脫水和2周齡以內(nèi)仔豬高病死率為特征[1]。本病可發(fā)生于各種年齡段的豬,但對仔豬的影響最為嚴(yán)重。10日齡以內(nèi)的仔豬病死率高達(dá)100%,5周齡以上的豬感染后病死率較低,成年豬感染后幾乎沒有死亡,但嚴(yán)重影響增重和降低飼料報酬,由此造成了藥物和人力增加等重大損失,是危害豬場最嚴(yán)重的疾病之一[2-3]。二者均為高度接觸性腸道疾病,分別由豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒引起。由于TGEV和PEDV有相似的臨床表現(xiàn)及傳染途徑,其鑒別診斷通常需借助實驗室診斷技術(shù),如病毒分離、免疫熒光試驗、PCR技術(shù)等[4]。傳統(tǒng)的診斷技術(shù)如病毒分離、免疫熒光試驗等費時費力,不適于臨床快速診斷,也不適于大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查;而PCR技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感度高、可進(jìn)行活體診斷等特點,在實驗室診斷中具有較突出的優(yōu)勢[5]。因此本研究通過對豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎的雙重RT-PCR檢測的建立和優(yōu)化為這兩種病毒的檢測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 豬流行性腹瀉病毒、傳染性胃腸炎病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病病毒,均于西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物疾病快速診斷中心保存。

1.1.2 主要試劑 Total RNA提取試劑、RT-PCR試劑盒、Permix TaqDNA聚合酶、DL-2 000 DNA Marker,均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.1.3 引物 根據(jù)豬流行性腹瀉和傳染性胃腸炎的基因序列,應(yīng)用Primer5.0分別設(shè)計了2對引物,序列見表1,引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 病毒RNA提取 分別從實驗室保存的流行性腹瀉、傳染性腹瀉毒株樣本中提取RNA,具體操作參見RNA試劑盒(TaKaRa)說明書方法。

1.2.2 雙重RT-PCR方法的建立

1.2.2.1 RT反應(yīng) 取PEDV和TGEV樣本各3 μL,反轉(zhuǎn)錄酶混合液(PrimeScript RT Master Mix)2 μL,無RNA酶的超純水(RNase Free dH2O)補(bǔ)足至10 μL?；靹蚝笠?7℃ 15 min,85℃ 5 s,4℃保存為反應(yīng)程序進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,得到病毒 cDNA,置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2 雙重RT-PCR反應(yīng)最佳退火溫度 取PEDV、TGEVcDNA 各 3 μL 為模版,Permix Taq TaqDNA 聚合酶 25 μL,上、下游引物各 1 μL,最后用ddH2O補(bǔ)足至50 μL。退火溫度在51.8℃ ～57.8 ℃ 區(qū)間設(shè)置 51.8、52.2、52.9、54.1、55.5、56.6、57.3、57.8℃八個溫度梯度進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.2.3 雙重RT-PCR反應(yīng)引物濃度稀釋 將設(shè)計的PEDV和TGEV引物用紫外分光光度計進(jìn)行OD260nm/OD280nm值測定,將引物作10倍稀釋,并分別測定稀釋后的濃度,各取1 μl加入到多重PCR最佳退火溫度反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)。

1.2.2.4 雙重RT-PCR反應(yīng)靈敏性檢測 將提取的PEDV和TGEV的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用紫外分光光度計進(jìn)行OD260nm/OD280nm值測定,將模版作10倍系列稀釋,并分別測定稀釋后的含量,并各取1 μL加入到最佳反應(yīng)程序,進(jìn)行靈敏性檢測。

1.2.2.5 雙重RT-PCR反應(yīng)特異性檢測 分別取CSFV、PCV2、PRRSV和 PRV的 DNA或 RNA按照相同條件代替PDEV和TGEV的cDNA模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,以檢測其特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重RT-PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化 以PEDV和TGEV基因組cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過電泳、測序分別得到462 bp和590 bp的cDNA序列,見圖1。

通過優(yōu)化確定最佳反應(yīng)體系(50 μL)為：25 μL 5X PeimeScript RT Master Mix酶,上、下游引物各1 μL,cDNA 模版 6 μL,ddH2O 補(bǔ)足至 50 μL。 對RT-PCR反應(yīng)溫度、時間和循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化,最后確定PEDV和TGEV的最佳反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性50 s、52.9 ℃退火 1 min、72 ℃延伸1 min、循環(huán) 35次、72℃終末 10 min、15℃保存。

圖1 PEDV和TGEV雙重RT-PCR反應(yīng)退火溫度優(yōu)化

2.2 雙重RT-PCR引物濃度稀釋 將PEDV和TGEV引物由原濃度10 μmol/L稀釋為1 μmol/L,5×10-1μmol/L,2.5 ×10-1μmol/L,1.25 ×10-1μmol/L,1×10-1μmol/L,1×10-2μmol/L,用雙重PCR最佳反應(yīng)條件進(jìn)行 PCR擴(kuò)增,電泳,結(jié)果見圖2。

通過圖像對比可看出,引物濃度為5×10-1μmol/L時,條帶最亮,其為最適引物濃度。

圖2 PEDV和TGEV雙重RT-PCR引物濃度稀釋

2.3 雙重RT-PCR靈敏性檢測 將cDNA濃度由原濃度93.3×101ng/μL以10倍梯度稀釋為93.3×100ng/μL,93.3 × 10-1ng/μL,93.3 × 10-2ng/μL,93.3×10-3ng/μL。用雙重PCR最佳反應(yīng)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增,跑電泳,結(jié)果見圖3。

通過圖像對比可以看出,cDNA濃度為93.3×101ng/μL時,條帶最亮,故其為最適cDNA濃度。

圖3 PDEV和TGEV雙重RT-PCR的敏感性

2.4 雙重RT-PCR的特異性 用建立的雙重RTPCR方法檢測豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)均未出現(xiàn)條帶,顯示陰性,可見其特異性好。結(jié)果見圖4.

3 討論

圖4 雙重RT-PCR特異性檢測

2010年以來,中國大陸大部分地區(qū)的豬場出現(xiàn)了仔豬腹瀉的疫情,與此同時韓國、日本、越南等亞洲國家及區(qū)域也發(fā)生腹瀉疫情,導(dǎo)致大量出生仔豬死亡。2013年4月以后,美國、加拿大、墨西哥等美洲國家,甚至有歐洲國家均有豬腹瀉疫情的報道,豬腹瀉病給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,其發(fā)病范圍的擴(kuò)大,再度引起了科研工作者們對引發(fā)腹瀉病相關(guān)病毒的研究熱情[6]。TGEV和PDEV這兩種病毒性腹瀉病是仔豬的常見疾病,發(fā)病率高,目前均無有效的藥物去預(yù)防和治療,且兩者在臨床癥狀、病理變化和流行病學(xué)上無明顯差異[7].傳統(tǒng)的檢測方法,如細(xì)胞培養(yǎng)、免疫學(xué)和動物試驗等雖能對兩者鑒別診斷,但它們最大的缺點是檢測靈敏度低、周期長[8]。RT-PCR技術(shù)是目前鑒別診斷TGEV和PEDV兩種病毒的特異性更強(qiáng)、敏感度更高的方法[9]。相對于傳統(tǒng)PCR檢測單一病原體,雙重RTPCR能同時進(jìn)行多種病原微生物的鑒定,且具有靈敏、快捷等優(yōu)點,適于大規(guī)模檢測,在動物疫病的流行病學(xué)調(diào)查和預(yù)防中,具有不可替代的作用。近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,某些新的檢測方法,如多重RT-PCR、實時熒光定量RT-PCR、恒溫隔熱RTPCR等也逐漸應(yīng)用于動物病原的檢測[10],在臨床應(yīng)用中,也越來越多的運用多重PCR技術(shù)解決疾病的診斷問題,用以提高檢測的效率。多重PCR技術(shù)能在同一個體系中實現(xiàn)對多個目的基因的特異性擴(kuò)增,相比普通單重PCR檢測效率更高、且節(jié)約試劑和人工成本,而較之熒光定量PCR、恒溫隔熱RT-PCR技術(shù),其靈敏度略低,但對儀器設(shè)備的要求、各項試劑耗材等成本也較低[11]。因此,雙重RT-PCR方法的建立對PEDV和TGEV的快速診斷有重要意義。

本試驗根據(jù)實驗室保存的PEDV和TGEV毒株設(shè)計特異性引物,建立了PEDV和TGEV雙重RT-PCR快速檢測方法。雙重RT-PCR檢測靈敏性顯示,該方法最低,cDNA模板檢出濃度為93.3×10-1ng/μL,表明本試驗建立的雙重RT-PCR檢測方法準(zhǔn)確性高,具有較高的檢測靈敏性。同時,該雙重RT-PCR特異性結(jié)果顯示,該方法僅能檢測到PEDV和TGEV,不能檢測到PRRSV、CSFV和PRV等,對PEDV和TGEV的快速診斷和疫病防控具有重要意義。