二甲雙胍對(duì)人胰腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響及機(jī)制*

徐萍，蔣小猛，葛璐，黃紅梅，周朦，張尤歷，徐岷

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科，2.消化內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001）

基礎(chǔ)研究·論著

二甲雙胍對(duì)人胰腺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響及機(jī)制*

徐萍1，蔣小猛2，葛璐2，黃紅梅2，周朦2，張尤歷2，徐岷2

（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院 1.內(nèi)分泌科，2.消化內(nèi)科，江蘇 鎮(zhèn)江 212001）

目的探索不同濃度二甲雙胍對(duì)人胰腺癌Panc-1細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響及其可能的分子機(jī)制。方法用不同濃度的二甲雙胍處理人胰腺癌Panc-1細(xì)胞后，采用MTT法檢測(cè)其對(duì)癌細(xì)胞增殖能力的影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，Western blot觀察PTEN、p-Akt（Ser473）、mTOR蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果干預(yù)48 h時(shí)，不同濃度二甲雙胍（0.5、2.0和8.0 mmol）對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率依次為（7.20±5.92）%、（18.35±4.77）%和（33.45±4.10）%；72 h時(shí)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為（24.81±4.04）%、（53.42±4.18）%和（61.36±2.00）%。該抑制作用隨著藥物濃度增加和干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，呈藥物濃度依賴性和時(shí)間依賴性。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，二甲雙胍干預(yù)48 h時(shí)，8.0 mmol組G1期細(xì)胞比例與對(duì)照組和0.5 mmol組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），8.0 mmol組低于對(duì)照組和0.5 mmol組；G2/M期細(xì)胞比例與對(duì)照組和0.5 mmol組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），8.0 mmol組高于對(duì)照組和0.5 mmol組。二甲雙胍作用48 h時(shí)8.0 mmol組細(xì)胞的中晚期凋亡率為（12.64±2.74）%，與對(duì)照組（7.01±1.14）%和0.5 mmol組（6.19±0.32）%比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），8.0 mmol組高于對(duì)照組和0.5 mmol組。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示二甲雙胍作用48 h時(shí)，2.0 mmol組和8.0 mmol組與對(duì)照組和0.5 mmol組比較，PTEN蛋白表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），2.0 mmol組和8.0 mmol組升高，而p-Akt（Ser473）和mTOR的表達(dá)水平降低。結(jié)論二甲雙胍能抑制人胰腺癌Panc-1細(xì)胞的增殖能力，引起G2/M細(xì)胞周期阻滯，同時(shí)誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡，其可能的機(jī)制是通過激活PTEN的表達(dá)，抑制PI3K/Akt/mTOR通路。

二甲雙胍；胰腺腫瘤；增殖；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡；PTEN；PI3K/Akt/mTOR

二甲雙胍是臨床上用于治療2型糖尿病的一種安全有效的藥物，它通過減少糖異生，促進(jìn)外周組織對(duì)糖的攝取和利用，從而在機(jī)體內(nèi)發(fā)揮降低血糖的作用[1]。近來有研究[2-4]已證實(shí)二甲雙胍可以抑制胃癌、乳腺癌及肺癌等癌細(xì)胞的增殖，具有抗腫瘤的作用。本研究探索不同濃度二甲雙胍對(duì)人胰腺癌Panc-1細(xì)胞株的作用，觀察其對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡及細(xì)胞周期的影響，并進(jìn)一步探討二甲雙胍在胰腺癌細(xì)胞中的抗腫瘤作用的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和試劑

人胰腺癌Panc-1細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞所（由江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所保存），細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基及雙抗（鏈霉素、青霉素）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，二甲雙胍、MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，Annexin V-FITC流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒為南京凱基生物科技公司產(chǎn)品，兔抗PTEN、p-Akt、雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、actin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruze公司，碘化丙啶（propidium iodide，PI）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀為美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為美國(guó)Becton Dickinson公司產(chǎn)品。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和二甲雙胍干預(yù)

人胰腺癌Panc-1細(xì)胞培養(yǎng)于37℃，5%二氧化碳CO2的無菌、濕潤(rùn)環(huán)境中，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 ng/ml鏈霉素、100 u/ml青霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Panc-1細(xì)胞消化收集，按細(xì)胞量5×103個(gè)/孔于96孔板中均勻種板或3×105個(gè)/孔接種于6孔板中。實(shí)驗(yàn)分為4組，分別是對(duì)照組、二甲雙胍0.5 mmol組、2.0 mmol組和8.0 mmol組。細(xì)胞接種24和48 h后，各組分別更換含有二甲雙胍的細(xì)胞培養(yǎng)基，藥物終濃度分別為0.5、2.0和8.0 mmol，對(duì)照組的培養(yǎng)基中加入體積相同的PBS。

1.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率

處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人胰腺癌Panc-1細(xì)胞均勻接種于96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。二甲雙胍作用24、48和72 h后，每孔加入10μl、5 mg/ml的MTT試劑后培育4 h，移液器謹(jǐn)慎吸出每孔培養(yǎng)液，再加入DMSO 150μl，于避光條件下輕微震蕩5～8 min使結(jié)晶完全溶解，吸光度（A）值由酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀檢出，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為570 nm，以不含細(xì)胞的全細(xì)胞培養(yǎng)液孔調(diào)零。根據(jù)A值計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)孔A570-調(diào)零孔A570）/（對(duì)照孔A570-調(diào)零孔A570）×100%。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Panc-1細(xì)胞消化收集，均勻接種于6孔板中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。二甲雙胍處理48 h后將各組細(xì)胞收集，并以預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入預(yù)冷70%乙醇固定，4℃環(huán)境下過夜。加入濃度 100μg/ml的 RNase 10μl，濃度 50μg/ml的 PI緩沖液300μl，4℃環(huán)境中避光條件下孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期。

1.5 Western blot檢測(cè)PTEN、p-Akt、mTOR蛋白的表達(dá)

用RIPA裂解液常規(guī)提取細(xì)胞總蛋白，100℃加熱10 min，高速離心5 min，-20℃保存待用。12%SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上?室溫條件下5%脫脂奶粉封閉1.5 h，一抗（PTEN、p-Akt、mTOR、actin），4℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1～2 h，用ECL發(fā)光試劑檢測(cè)顯影，圖像用灰度分析軟件處理分析?

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍抑制人胰腺癌Panc-1細(xì)胞的生長(zhǎng)

二甲雙胍處理24 h時(shí)，細(xì)胞存活率僅8.0 mmol組與其他各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其他各組之間的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。干預(yù)48 h時(shí)，0.5、2.0和8.0 mmol組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率分別為（7.20±5.92）%、（18.35±4.77）% 和（33.45±4.10）%；干預(yù)72 h時(shí)各組細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率分別為（24.81±4.04）%、（53.42±4.18）% 和（61.36±2.00）%，二甲雙胍處理癌細(xì)胞48和72 h后，與對(duì)照組比較，二甲雙胍0.5、2.0和8.0 mmol組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且隨著二甲雙胍藥物濃度的增加或干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，其對(duì)Panc-1細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)。見圖1。

圖1 不同濃度二甲雙胍干預(yù)對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞存活率的影響

2.2 二甲雙胍對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞凋亡的影響

二甲雙胍干預(yù)48 h后，2.0 mmol組與8.0 mmol組癌細(xì)胞的早期凋亡與中晚期凋亡的比例呈現(xiàn)增高趨勢(shì)，但各組之間早期細(xì)胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與對(duì)照組比較，僅8.0 mmol組中晚期細(xì)胞凋亡率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與0.5 mmol組比較，8.0 mmol組的中晚期細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），凋亡率增加。見圖2。

2.3 二甲雙胍對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞周期的影響

二甲雙胍干預(yù)48 h時(shí)，8.0 mmol組G1期細(xì)胞所占比例與對(duì)照組和0.5 mmol組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），8.0 mmol組低于對(duì)照組和0.5 mmol組；8.0 mmol組G2/M期細(xì)胞所占比例與其他各組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），8.0 mmol組高于其他各組，表明在胰腺癌Panc-1細(xì)胞中，二甲雙胍干預(yù)能夠使細(xì)胞周期阻滯于G2/M期。見圖3。

2.4 二甲雙胍對(duì)PTEN、p-Akt、mTOR蛋白的影響

圖2 二甲雙胍對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞凋亡的影響

圖3 不同濃度的二甲雙胍干預(yù)48 h后對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞周期的影響

二甲雙胍干預(yù)48 h時(shí)，2.0 mmol組和8.0 mmol組中PTEN表達(dá)水平與對(duì)照組和0.5 mmol組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），PTEN表達(dá)水平升高，而p-Akt（Ser473）和mTOR表達(dá)水平降低。見圖4。

圖4 不同濃度的二甲雙胍干預(yù)48 h后對(duì)PTEN、p-Akt、mTOR的影響

3 討論

胰腺癌是一種惡性度高，病情進(jìn)展快的消化道惡性腫瘤，2型糖尿病與其的關(guān)系目前尚未完全闡明。一方面，胰腺癌可以導(dǎo)致2型糖尿病，另一方面，2型糖尿病也是少數(shù)胰腺癌患者的早期臨床表現(xiàn)之一。近期研究[5]揭示降糖藥物二甲雙胍的使用可以減少糖尿病患者發(fā)生胰腺癌的可能，引起了人們對(duì)二甲雙胍的抗腫瘤機(jī)制的研究興趣。

二甲雙胍作為一種安全有效的降糖藥物，其降血糖的機(jī)制被認(rèn)為與激活腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）有關(guān)。AMPK信號(hào)通路的激活可能調(diào)控某些腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡過程。有學(xué)者用二甲雙胍干預(yù)卵巢癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的增殖活性降低，AMPK信號(hào)通路被活化，磷酸化的AMPK表達(dá)增加，進(jìn)而抑制其下游的mTOR信號(hào)分子的表達(dá)，導(dǎo)致與增殖相關(guān)的蛋白分子合成受抑制。QUEIROZ等[6]證實(shí)依賴于AMPK信號(hào)通路的二甲雙胍在乳腺癌細(xì)胞中同樣有抑制增殖的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，用不同濃度的二甲雙胍作用于胰腺癌Panc-1細(xì)胞48及72 h后，細(xì)胞的生長(zhǎng)情況均受到抑制，且隨著二甲雙胍藥物濃度的遞增或藥物干預(yù)時(shí)間的增加，其對(duì)胰腺癌Panc-1細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制逐漸增強(qiáng)。這表明二甲雙胍能夠較有效地抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

二甲雙胍同樣可通過激活A(yù)MPK途徑下調(diào)mTOR信號(hào)來誘發(fā)細(xì)胞凋亡，QUEIROZ等[6]和HAN等[7]分別證實(shí)了二甲雙胍對(duì)乳腺癌細(xì)胞和胃癌細(xì)胞的促凋亡作用。WANG等[8]用二甲雙胍處理4種胰腺癌細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)的促凋亡趨勢(shì)。本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍干預(yù)48 h后，細(xì)胞早期及中晚期凋亡比例均呈增高趨勢(shì)。8.0 mmol組的細(xì)胞凋亡率與0.5 mmol組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示二甲雙胍對(duì)胰腺癌細(xì)胞的促凋亡作用有可能存在時(shí)間及劑量依賴。

本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍8.0 mmol組G1期細(xì)胞所占比例降低，G2/M期細(xì)胞所占比例升高，提示G2/M期細(xì)胞周期阻滯。這與BEN等[9]提出二甲雙胍聯(lián)合2-脫氧葡萄糖可以使前列腺癌細(xì)胞周期阻滯于G2/M期結(jié)果相一致。但也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以使細(xì)胞阻滯在G0/G1期[10]，并假設(shè)二甲雙胍可能通過腫瘤抑制激酶LKB1使得磷酸化AMPK增加，活化后的AMPK通過上調(diào)P53-P21軸和抑制mTOR途經(jīng)使得細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期[11]。二甲雙胍對(duì)不同細(xì)胞株的周期阻滯時(shí)期不同，仍需深入研究闡明。

KARNEVI等[12]發(fā)現(xiàn)正常血糖濃度下，二甲雙胍能夠激活胰腺癌細(xì)胞的AMPK Thr172，抑制其下游PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路。本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍作用48 h后，mTOR和p-Akt（Ser473）表達(dá)水平下降，說明二甲雙胍抑制了這一細(xì)胞生長(zhǎng)通路。本研究還發(fā)現(xiàn)二甲雙胍作用48 h后，PTEN表達(dá)增高。PTEN作為一種新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡等過程中具有重要作用。正常機(jī)體中，抑癌基因PTEN拮抗磷酸肌醇激酶PI3K的作用，從而抑制調(diào)控細(xì)胞增殖和存活的重要信號(hào)分子—蛋白激酶Akt的磷酸化，對(duì)Akt的活化起負(fù)性調(diào)控作用，從而使Akt的活性維持在正常范圍[13]。KIM等[14]發(fā)現(xiàn)，在血管平滑肌細(xì)胞中，AMPK能啟動(dòng)PTEN的表達(dá)。這一研究提示，二甲雙胍具有抗腫瘤作用的分子機(jī)制有可能為其激活A(yù)MPK的表達(dá)，從而啟動(dòng)PTEN，繼而抑制下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路PI3K/Akt/mTOR。

上述實(shí)驗(yàn)初步探明二甲雙胍能夠抑制胰腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，阻滯細(xì)胞周期，并促進(jìn)凋亡，并可能存在時(shí)間及劑量依賴性，其機(jī)制是通過激活PTEN的表達(dá)，抑制PI3K/Akt/mTOR通路。需注意的是，目前關(guān)于二甲雙胍與腫瘤生長(zhǎng)的相關(guān)性的體外實(shí)驗(yàn)中，所使用的二甲雙胍的藥物濃度（0.5～8.0 mmol）均高于其作為降糖藥物所需的血藥濃度。但是，有研究認(rèn)為二甲雙胍在外周組織中聚集濃度數(shù)倍高于其血液中的濃度，從而提示二甲雙胍用于人體腫瘤治療中，有可能達(dá)到足夠有效的抗腫瘤藥物濃度。二甲雙胍抗腫瘤效應(yīng)中涉及到的靶點(diǎn)（PTEN、Akt、mTOR等）及其相關(guān)通路的變化也為胰腺癌的分子靶向治療提供了新的研究方向。

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In fl uence of Metformin on proliferation, cell cycle and apoptosis in human pancreatic adenocarcinoma cells and mechanisms*

Ping Xu1, Xiao-meng Jiang2, Lu Ge2, Hong-mei Huang2, Meng Zhou2, You-li Zhang2, Min Xu2
(1. Department of Endocrinology, 2. Department of Gastroenterology, Aff i liated Hospital of Jiangsu University, Zhenjiang, Jiangsu 212001, China)

ObjectiveTo investigate the effect of Metformin on proliferation, cell cycle and apoptosis of pancreatic adenocarcinoma Panc-1 cellsin vitro, and appraise the possible mechanism.MethodsPanc-1 cells were treated with 0.5, 2.0 and 8.0 mmol Metforminin vitro. Cell proliferation was measured by MTT assay. Cell apoptosis and cell cycle distribution were detected by fl ow cytometery. The expression of PTEN, p-Akt (Ser473) and mTOR were dected by Western blot.ResultsAfter 48 h, the inhibition rates of Metformin at dosage of 0.5, 2.0 and 8.0 mmol were (7.20 ± 5.92)%, (18.35 ± 4.77)% and (33.45 ± 4.10)%, respectively. After 72 h, the inhibition rates of Metformin at dosage of 0.5, 2.0 and 8.0 mmol were (24.81 ± 4.04)%, (53.42 ± 4.18)% and (61.36 ± 2.00)%,respectively. The proliferation of Panc-1 cells was inhibited by Metformin in a dose- and time-dependent manner.After 48 h, the percentage of G1 phase cells in the 8.0 mmol Metformin group was signi fi cantly lower than that in the controlled group and the 0.5 mmol Metformin group (P＜ 0.05). The percentage of G2/M phase cells in the 8.0 mmol Metformin group was remarkably higher than that in the other groups (P＜ 0.05). After 48 h, the percentage of cells in the middle and late stages of apoptosis was increased from (7.01 ± 1.14)% in the controlled group and(6.19 ± 0.32)% in the 0.5 mmol Metformin group to (12.64 ± 2.74)% in the 8.0 mmol Metformin group (P＜ 0.05).After 48 h, compared with the controlled group and the 0.5 mmol Metformin group, the expression of PTEN was activated and the expressions of p-Akt (Ser473) and mTOR were reduced in the 2.0 and 8.0 mmol Metformin groups(P＜ 0.05).ConclusionsMetformin can suppress the proliferation of human pancreatic adenocarcinoma Panc-1 cells, cause G2/M phase checkpoint arrest and induce cell apoptosisin vitroat moderate to high dosage. The mechanism may be inhibition of the PI3K/Akt/mTOR pathway by activating the expression of PTEN.

Metformin; pancreatic neoplasm; proliferation; cell cycle; apoptosis; PTEN; PI3K/Akt/mTOR

10.3969/j.issn.1005-8982.2018.01.001

1005-8982（2018）01-0001-05

2017-03-27

國(guó)家自然科學(xué)基金（No：81472333；No：81672402）

徐岷，E-mail：peterxu1974@163.com

R735.9

A

（張蕾 編輯）