寨卡病毒診斷研究進展與展望

尹景峰

（臨沂市農(nóng)業(yè)綜合執(zhí)法支隊，山東 臨沂 276000）

寨卡病毒病是由寨卡病毒（Zika viurs,ZIKV）引起的，以發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)痛或結(jié)膜炎為主要臨床癥狀的急性傳染病，主要通過蚊媒傳播，極少引起死亡，但孕婦感染后可能會導致胎兒小腦畸形甚至死亡[1-3]。2015年5月在巴西暴發(fā)大規(guī)模疫情，呈現(xiàn)蔓延擴大和跨境傳播趨勢。據(jù)世衛(wèi)組織估計，巴西約有150萬人感染了寨卡。在2015年10月至2016年1月期間，有超過3500例嬰兒畸形的病例。2016年2月世衛(wèi)組織稱，這種病毒很可能在大部分美洲國家暴發(fā)，且已被WHO列為全球緊急公共衛(wèi)生事件。因此，開展針對寨卡病毒的診斷快速檢測技術(shù)，對疾病的初期篩選、疫情防控有重要作用[4-6]。

1 當前診斷方法

1.1 分子診斷方法

分子檢測方法包括兩步：（1）細胞培養(yǎng)物中病毒的檢測；（2）利用PCR或熒光定量PCR （Real-time PCR，RT-PCR）進行基因組的檢測。在細胞培養(yǎng)物中，通過細胞病變確定病毒的存在，再利用TCID50確定陽性結(jié)果[7]。近幾年來，RT-PCR發(fā)展快速，可特異、敏感、快速、可重復的檢測較低含量的病毒[8]。這些方法的建立，均需要引物和探針的高特異，同時還需高敏感、定量的可靠性。

Calvet[9]通過病毒宏基因組學和基因序列分析，建立了針對孕婦檢測ZIKV的RT-PCR方法，其可在羊水中檢測病毒，但不能在尿液和血清樣品中進行病毒的檢測。Musso[7]使用NucliSENSR?easyMAGR?System（BioMérieux公司）對唾液樣本進行了RNA提取，再使用兩套引物進行RT-PCR擴增，結(jié)果在748份血液樣品中檢測到210份陽性（28.1%），在319份唾液樣本中檢測到182份陽性（57.1%），表明在唾液樣本中檢測到ZIKV RNA的比例比血液樣本中高。由于ZIKV與DENV和CHIKV有相似的臨床癥狀，因此有研發(fā)人員[1,3]已建立了一種可檢測ZIKV的一步熒光定量PCR方法，檢測最低線為140個病毒拷貝，在88份有疑似DENV臨床癥狀的病人血漿樣本中，成功檢測出ZIKV。Waggoner[4]建立了多重RTPCR方法，可同時檢測ZIKV，改善的方法檢測靈敏度與常規(guī)RT-PCR相當，并可檢出31份ZIKV陽性。這些結(jié)果均表明，在當前缺乏合適的替換檢測方法的前提下，對有低病毒血癥的臨床樣本（例如血漿）進行檢測時，提高檢測方法的敏感性是很重要的[2,5]。

盡管PCR為基礎(chǔ)的分子手段可實現(xiàn)對多種病毒的檢測，但仍有諸多局限，例如漏檢、假陰性、需要合適的質(zhì)量控制措施、需要將DENV/ZIKV基因組RNA轉(zhuǎn)為DNA。針對這些局限，已有相應(yīng)對策，例如樣品稀釋、使用小體積、反應(yīng)體系中加入化學試劑（例如吐溫）[2-3]。

1.2 免疫測定方法

當前ZIKV疫情的暴發(fā)，對孕婦有極大的威脅。由于孕期個體與非孕期個體的抗體反應(yīng)不同，因此對孕婦進行ZIKV免疫應(yīng)答檢測時，需要格外重視。黃病毒感染后數(shù)天機體即可產(chǎn)生IgM抗體，且可持續(xù)3個月[6]；IgM抗體產(chǎn)生后數(shù)天即可產(chǎn)生IgG抗體，并可持續(xù)數(shù)月。此方法已被FDA批準，且在2016年2月26日，被CDC推薦用于人血清和腦脊液中病毒的檢測[2,7]。根據(jù)CDC出具的臨床癥狀和流行病學標準，對疑似人群已經(jīng)使用ZIKV MAC-ELISA進行篩查[8]。雅浦島的寨卡疫情的暴發(fā)，僅記錄了少數(shù)感染者 （n=11）的免疫反應(yīng)情況[9]。當使用Zika MAC-ELISA和捕獲IgG的ELISA（使用滅活的全病毒和單克隆抗體）進行檢測時，發(fā)現(xiàn)IgM可在癥狀出現(xiàn)后3天即可檢測到，而IgG是在一個無黃病毒感染史的寨卡病人出現(xiàn)癥狀后10天檢測到[3]。隨后試驗也可在出現(xiàn)發(fā)燒癥狀的第5天檢測到特異性中和抗體。Euroimmun公司[2]研制了第一個完整的試劑盒，可利用ELISAs和間接免疫熒光法檢測針對病人血液中多種病毒的特異性抗體（IgM、IgG）。

將單克隆抗體應(yīng)用于檢測技術(shù)中有很大優(yōu)勢，由于其對抗原特異性位點的結(jié)合能力，因此會有強特異性，會降低交叉反應(yīng)。Adungo[3,5]建立了針對黃病毒的單克隆抗體，將Mabs應(yīng)用于檢測抗原或IgM的ELISA中，為建立和改善針對ZIKV的檢測試劑盒做準備。但有其他黃病毒感染史的病人進行ELISA方法時，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

1.3 紙盤結(jié)合支點開關(guān)技術(shù)

由于Zika病毒的全球傳播和小頭畸形的比例增加，建立特異、敏感的及時檢測方法，已成為公共衛(wèi)生事件急需解決的事情[6]。研究人員利用合成生物學，將支點開關(guān)技術(shù)[7]、可視化紙盤檢測技術(shù)[8]融合在一起，建立了可對ZIKV快速、低廉、便攜、特異的檢測方法[9]。首先，根據(jù)病毒RNA人工設(shè)計支點開關(guān)中的switch RNA序列，5`端有可與病毒RNA靶區(qū)域結(jié)合的序列，隨后是發(fā)卡結(jié)構(gòu)，包含有強核糖體結(jié)合位點（ribose-binding site，RBS）和起始密碼子，接著跟隨可編碼報告基因的序列。接著，又利用了可視化紙盤檢測技術(shù)，用于檢測報告基因的表達。可視化紙盤是將無細胞表達系統(tǒng)、支點開關(guān)、檢測底物加到紙片上并凍干，水化后即可啟動反應(yīng)，通過判斷紙盤的顏色變化，判斷檢測結(jié)果，間接反映病毒RNA的檢測結(jié)果。

1.4 磁性納米顆粒技術(shù)

磁性納米顆粒技術(shù)是將納米顆粒與某種分子相連，這種分子可有效的與病毒作用，通過磁性收集，富集病毒。但納米顆粒有不穩(wěn)定性，為了克服這一缺陷，使用石墨、二氧化硅或多聚物包裹磁性納米顆粒，用以提高化學穩(wěn)定性[4]。Sakudo[5]使用包裹石墨的磁性納米顆粒，表面結(jié)合抗DENV抗體后，建立了可敏感檢測DENV的新型檢測技術(shù)，且通過此方法富集的病毒可進行RT-PCR分析。

Tian[6]將環(huán)介導等溫擴增技術(shù)與磁性納米顆粒結(jié)合，建立了ZIKV寡核苷酸檢測方法，可在aM級別進行核酸的檢測。環(huán)介導等溫擴增技術(shù)顯著增加了鏈霉親和素-磁性納米顆粒的流體動力學體積，導致Brownian弛豫特征頻率的改變，可通過便攜式交流磁化率計進行信號的收集，進而定量ZIKV寡核苷酸含量。建立的方法對合成的ZIKV寡核苷酸的靈敏度為1aM，反應(yīng)時間僅需27min。這種新型策略為診斷和控制ZIKV提供新方向。

1.5 商品化試劑盒

基于長遠考慮，針對多種病毒的商品化的血清診斷試劑盒會日益增多。但最近一段時間，涉足商品化市場的試劑盒較少，檢測方法主要為抗體檢測方法和RT-PCR檢測方法。MyBiosource公司預計在美國上市ZIKV IgG/IgM ELISA試劑盒，原理是基于雙抗原夾心ELISA方法，但關(guān)于制備ELISA時使用的抗原信息、交叉反應(yīng)情況均無法獲悉。此外，還有美國InBIOS公司的ZIKV IgM ELISA、Mac ELISA試劑盒、德國Altona公司的Real star ZIKV熒光定量試劑盒、日本Tanaka Diagnostics公司的針對ZIKV的免疫色譜試劑盒、馬耳他Fast-Track公司的快速診斷多重RT-PCR試劑盒、美國Quest公司的針對ZIKV/DENV的RT-PCR試劑盒和針對ZIKV IgM的MAC-ELISA 試劑盒[5]。

2 新型診斷方法設(shè)想

由于ZIKV與DENV有序列同源性，因此在檢測技術(shù)和疫苗研發(fā)策略中，DENV方面的進展對ZIKV工作的推進，也有一定的參考，提供了方向和思路。基于脂質(zhì)體技術(shù)為基礎(chǔ)的生物傳感器為建立快速、低廉、可基層操作并可定量的檢測RNA技術(shù)提供可能[4,6]。

2.1 脂質(zhì)體-免疫層析技術(shù)

Baeumner[7]利用在聚醚砜膜上進行DNA/RNA雜交進而檢測脂質(zhì)體信號的原理，建立了檢測DENV的生物傳感器。作者先將普通的DNA探針與包有染料（磺酰羅丹明B）的脂質(zhì)體連接，形成磷脂復合物，再將保守或DENV血清特異性探針固定在聚醚砜膜上。最后通過肉眼觀察是否有粉色條帶出現(xiàn)即可判斷結(jié)果，或者使用便攜式反射計對脂質(zhì)體定量，間接反映病毒含量。Yafaev[8]基于此項技術(shù)，建立了可檢測DENV 4個血清型的生物傳感器，不同血清間區(qū)分有92%準確性。

2.2 免疫脂質(zhì)體-熒光免疫測定

當磺酰羅丹明 B高濃度包裹脂質(zhì)體后，可自我淬滅。因此，科學家們將磺酰羅丹明 B包裹入脂質(zhì)體中，后期通過加入試劑裂解脂質(zhì)體，釋放熒光，檢測目的信號。且隨著脂質(zhì)體體積的增加，由于被包裹的磺酰羅丹明 B數(shù)量增多，因此熒光信號會更強[5]。這種策略已在針對多種病毒的Elisa方法中應(yīng)用。此外，使用DNA適配體代替抗體與含有熒光的脂質(zhì)體連接也可作為一種選擇[4]，其中DNA適配體有諸多優(yōu)勢，例如穩(wěn)定、易生產(chǎn)、易修飾從而增加親和性和選擇性、有再生可能、分子量小[5]。

2.3 免疫脂質(zhì)體-磁性納米顆粒技術(shù)

Connelly[6]針對貓杯狀病毒 （feline calicivirus，F(xiàn)CV）建立了一種檢測方法，即進行了預先富集病毒，是先將待檢病毒與含有熒光素和單抗的脂質(zhì)體作用，再加到有標記多抗的磁性納米顆粒固定基質(zhì)上，實現(xiàn)預先富集；最后裂解脂質(zhì)體，釋放熒光，間接定量病毒含量。

3 小結(jié)

每種診斷技術(shù)都有其優(yōu)勢和局限。RT-PCR檢測方法較為準確，但需要昂貴的設(shè)備，在偏遠、不發(fā)達地區(qū)不容易實現(xiàn)?？贵w檢測方法只適用于急性和/或恢復期樣品，因為在感染早期IgM和IgG抗體滴度較低。且如果病人以前感染過其他黃病毒屬成員，在檢測寨卡病毒時，可能由于抗體交叉反應(yīng)而影響檢測結(jié)果。因此，亟需研制一種快速、低廉、便攜的診斷方法。此外，可同時實現(xiàn)多方位 （例如同時檢測RNA和IgM）的多重診斷方法[6]很有實用性，因為可同時覆蓋ZIKA病毒感染的整個時期，對疑似病人出現(xiàn)發(fā)熱或其他癥狀時的檢測很有幫助。從臨床和流行病學方面考慮，還需建立可同時檢測、區(qū)分多種病毒（尤其是ZIKA、DENV、CHIKV）的多重診斷方法。

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