藍舌病流行特點及診斷方法研究進展

董承帆，唐麗杰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150030）

藍舌病(Bluetongue，BT)由藍舌病病毒(Bluetongue virus，BTV)引起的家養(yǎng)或野生反芻動物的一種典型的非接觸性病毒性傳染病。目前，這一疾病是 OIE劃定的 A類疫病之一，我國已將其規(guī)定為一類動物傳染病。該病自1905年被科學(xué)家Theiler確認以后，在世界各地均有發(fā)生，感染動物的死亡率高，疾病若不能被盡早發(fā)現(xiàn)將很難得到有效控制，因此，選擇并建立有效的檢測方法是控制本病的關(guān)鍵。

1 藍舌病的流行特點

BTV是一種嚴重危害反芻動物的一類動物烈性傳染病。BTV感染綿羊，主要危害羔羊。感染羊主要表現(xiàn)為發(fā)熱、精神不振、食欲廢絕，隨著病程的進一步發(fā)展可見，口鼻部典型的“藍舌”病變。BTV可經(jīng)胎盤感染胎兒，引起流產(chǎn)、死胎或胎兒先天性異常，嚴重時可使整個羊群喪失一個產(chǎn)羔期的全部羔羊。BT主要通過媒介昆蟲傳播，因此當(dāng)媒介昆蟲盛行的季節(jié)，極易引起本病的發(fā)生。庫蠓作為主要的傳播媒介在傳播疾病的過程中扮演著重要的角色。感染未發(fā)病的反芻動物，如牛、鹿等成為陰性攜帶者。

BTV在世界范圍內(nèi)分布和流行，已有流行的BTV可分為 26個血清型，且型與型之間無交叉保護作用。BTV因血清型的原因，需要針對特定血清型制定相應(yīng)的解決辦法。近年來，在瑞士和科威特的山羊和綿羊體內(nèi)又分離到兩個新的血清型BTV，分別為BTV-25和BTV-26。新的血清型的出現(xiàn)會使未免疫的易感動物感染而發(fā)病，甚至死亡，造成嚴重的經(jīng)濟損失，因此使用適宜的診斷方法對BTV進行檢測至關(guān)重要。

2 藍舌病的診斷方法

2.1 病原學(xué)檢查

（1）病料采集 宜采全血(加2U肝素/mL)、動物病毒血癥期的肝、脾、腎、淋巴結(jié)、精液(置冷藏容器保存，24h內(nèi)送到實驗檢查處理)。

（2）直接鏡檢 取病羊的脾、細胞培養(yǎng)物或雞胚組織制作超薄切片，負染后置電鏡下觀察，可發(fā)現(xiàn)球形，有雙層蛋白外膜，直徑55～70nm的藍舌病病毒。

（3）分離培養(yǎng) 病毒培養(yǎng)在綿羊腎單層細胞上，48h左右出現(xiàn)細胞病變，幾天內(nèi)細胞全部感染，之后細胞脫落；感染非洲綠猴細胞后出現(xiàn)空斑，而抗病毒血清能夠抑制空斑的形成。

（4）動物接種試驗 采集病毒液經(jīng)腦感染幼齡小鼠，6d左右出現(xiàn)致死性腦炎，將病毒液分別靜脈或皮內(nèi)接種易感羊和免疫羊，幾天后易感羊出現(xiàn)典型的藍舌病變，而免疫羊確無任何藍舌病相關(guān)癥狀。

2.2 藍舌病血清學(xué)檢測方法

2.2.1 瓊脂糖免疫擴散試驗（AGID）

瓊脂擴散試驗為可溶性抗原與相應(yīng)抗體在含有電解質(zhì)的半固體凝膠(瓊脂或瓊脂糖)中進行的一種沉淀試驗。先將BTV用Vero或BHK-21進行擴增和培養(yǎng)，然后將所得的BTV抗原和待檢血清加入到0.9%的瓊脂糖凝膠中，分別設(shè)置陰性對照和陽性對照。該法的特點是在沒有實驗設(shè)備時，可以對大量血清樣品進行檢驗。

2.2.2 血清中和實驗（MTSN）

中和試驗是利用同一病毒的不同型的毒株或不同型標(biāo)準(zhǔn)血清,即可測知相應(yīng)血清或病毒的型。這個方法是將Vero或BHK-21細胞鋪到96孔板中,待細胞的面積占孔面積的80%時,向96孔板中加入不同血清型的病毒，放到37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；與此同時，將待檢血清進行滅活處理，然后按10倍連續(xù)稀釋后加到培養(yǎng)板中，37℃溫箱放置1h，試驗結(jié)果若顯示有1/4的孔中細胞發(fā)生病變則判定為BTV陽性血清。這個方法的不足是試驗的準(zhǔn)確性和所測定的效價會受到很多因素度影響，如：細胞培養(yǎng)的條件，培養(yǎng)液的成分，細胞類型等。

2.2.3 過氧化物酶染色法（IPS）

該方法是利用標(biāo)記抗體來檢測蛋白抗原，該方法主要包括：間接過氧化物酶檢測法（IP）、熒光抗體檢測法(FA)及過氧化物抗過氧化物酶檢測法(PAP)等三種方法。其中敏感性最高的是IP中以抗生物素及生物素的復(fù)合物標(biāo)記過氧化物酶為基礎(chǔ)的ABC-IP檢測方法，目前在生產(chǎn)實踐中應(yīng)用；其缺點是制備抗原蛋白和相應(yīng)度抗體操作步驟多，而且易受外界影響因素的限制，無法長期保存的原材料。

2.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）

ELISA是指將可溶性的抗原或抗體吸附到聚苯乙烯等固相載體上，進行免疫反應(yīng)的定性和定量方法。以重組VP7蛋白和抗VP7蛋白的McAb為基礎(chǔ)的競爭ELISA方法作為OIE推薦的BTV血清學(xué)診斷方法已經(jīng)商品化。這種方法在檢測藍舌病病毒群特異性抗原時，較間接ELISA、AGID等方法敏感。競爭 ELISA法以抗NS1蛋白單抗和抗VP7蛋白單抗作為檢測用單抗，任何動物體內(nèi)的藍舌病抗體都可以被檢測到。這一方法的優(yōu)點是特異性高，即使樣品中混有EHDV抗體，也不會有假陽性的結(jié)果出現(xiàn)。

2.3 藍舌病分子生物學(xué)檢測方法

2.3.1 PCR檢測技術(shù)

PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，又稱體外DNA擴增技術(shù)，用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA片段。對于BTV這類RNA病毒需要先進行反轉(zhuǎn)錄，得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA后，以此為模板進行PCR擴增得到BTV片段。利用RT-PCR方法，具有靈敏度高，特異性強，產(chǎn)率高，重復(fù)性好，在感染早期病毒量少時適用于臨床檢測，但這一方法技術(shù)性強，而且比較耗時，需要實驗儀器輔助，在基層較難推廣。

2.3.2 核酸分子雜交技術(shù)

核酸分子雜交技術(shù)是利用不同來源的DNA單鏈與RNA鏈彼此有互補的堿基序列而結(jié)合來檢測相應(yīng)的病原核酸。在BTV核苷酸序列的檢測中，設(shè)計BTV cDNA探針，利用其與BTV病毒RNA進行核酸雜交以檢測BTV抗原。該方法的操作步驟較多，而且樣品需要進行特殊處理，實驗人員需要經(jīng)過長期積累的操作經(jīng)驗才能掌握，并不適用于常規(guī)的病原檢測。

3 結(jié)論

隨著藍舌病對養(yǎng)殖業(yè)危害的加劇，不僅僅是單獨依靠疫苗來控制本病，發(fā)病初期的診斷也至關(guān)重要，目前有很多診斷方法可供我們選擇，如病毒分離鑒定、血清學(xué)檢測方法以及分子生物學(xué)檢測方法。因地制宜，選擇適合的診斷方法，制定全面有效的監(jiān)測和控制措施將更有利于藍舌病的綜合防治工作。

[1]殷震,劉景華.1997.動物病毒學(xué)(第二版).北京:科學(xué)出版社,549-554.

[2]董長垣.現(xiàn)代分子病毒學(xué)[M].武漢:武漢大學(xué)出版，1996.

[3]Huismans H,et al.Characterization of the tubules associated with the replication of three different orbiviruses[J].Virology,1979,92(2):397-406.

[4]Maan S,et al.Complete genome Characterisation of a novel 26th bluetongue virus serotype from Kuwait[J].PLoS One,2011,6(10):26-47.

[5]Squire K R,et al.Detecting bluetongue virus RNA in cell culture by dot hybridization with a cloned genetic probe[J].J Virol Methods,1985,10(1):59-68.

[6]Ritter D G,et al.Genetic relationships of bluetongue virus serotypes isolated from different parts of the world[J].Virus Res,1988,11(1):33-47.

[7]Ismail I M.Bluetongue neutralization test with different Virus under variable conditions[J].Agr Res Rev,1987，65:867-872.