茶多酚的化學(xué)組成及其含量測(cè)定與結(jié)構(gòu)鑒定

江　瀅　沈思婷　夏如楓　樊雪怡　韓　偉

（華東理工大學(xué)藥學(xué)院中藥現(xiàn)代化工程中心，上海200237）

0　引言

茶多酚（Tea Phlyphenols）又名茶單寧，是天然茶葉中分離提純的30多種酚類化合物的復(fù)合體，是茶葉中含生物活性成分的一類重要化合物。茶多酚具有極強(qiáng)的抗氧化性，能起到防治心血管疾病、提高免疫力、防衰老、抑菌、抗癌等多種藥理作用。茶多酚近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、保健品、醫(yī)藥等領(lǐng)域，被譽(yù)為21世紀(jì)對(duì)人類健康產(chǎn)生巨大影響的化合物。

茶多酚的主要化學(xué)成分為黃烷醇（兒茶素）類、花青素類、黃酮及黃酮醇類和酚酸類等。其中，兒茶素類化合物為主要成分，占茶多酚總量的65%～80%。本文對(duì)茶多酚中主要化學(xué)成分的含量測(cè)定和結(jié)構(gòu)鑒定方法進(jìn)行了歸納和總結(jié)。

1　茶多酚分析

許陳和張紅雨[1]對(duì)現(xiàn)有的茶多酚分析測(cè)試方法進(jìn)行了介紹，其含量測(cè)定方法主要有：高錳酸鉀氧化法、分光光度法、原子吸收法、近紅外光譜分析法、氣相色譜法、高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜法、微乳電動(dòng)色譜法、高速逆流色譜法和質(zhì)譜聯(lián)用法等。

1.1　茶多酚的含量測(cè)定

1.1.1分光光度法

對(duì)于茶多酚總量的測(cè)定，現(xiàn)在使用最廣泛的是分光光度法。我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用的是酒石酸亞鐵比色法[2-3]，其原理是茶多酚和酒石酸亞鐵產(chǎn)生的藍(lán)紫色或紅紫色絡(luò)合物在540 nm處的吸光度與茶多酚的濃度成正比。然而，國(guó)際上大多使用沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品，用Folin-Denis試劑與茶多酚生成一定條件下遵從朗伯-比耳定律的絡(luò)合物來(lái)測(cè)定茶多酚的總量。

肖純[4]等探討了使用該試劑分光光度法測(cè)量茶多酚的適用條件，得出以下結(jié)論：Folin-Denis試劑雖然專一性較差，但它能和一元、二元、多元酚反應(yīng)呈色，并且靈敏度高，分光光度法可以作為茶或茶湯中酚類物質(zhì)的總量分析方法。

1.1.2高錳酸鉀氧化滴定法

因?yàn)榉恿u基具有還原性，所以酚羥基能和高錳酸鉀發(fā)生氧化還原反應(yīng)。通過(guò)滴定后計(jì)算高錳酸鉀的消耗量即可得到茶多酚的含量。該方法雖然操作簡(jiǎn)單，但是不易控制滴定終點(diǎn)。同時(shí)，高錳酸鉀是強(qiáng)氧化劑，選擇性不高，得到的結(jié)果容易有誤差。

1.1.3紫外分光光度法

茶多酚可溶于有機(jī)溶劑乙醇，在其最大吸收波長(zhǎng)處，可采用紫外分光光度法測(cè)定其含量。

張洪杰[5]等使用該方法快速測(cè)定了口香糖中茶多酚的含量，得到茶多酚的測(cè)定波長(zhǎng)為274 nm，平均回收率為95.1%～102.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于0.29%。該方法簡(jiǎn)易快速，測(cè)定茶多酚含量具有一定的可行性。

1.2　茶多酚的組分測(cè)定

1.2.1高效液相色譜（HPLC）法

對(duì)于茶多酚各組分的分析測(cè)定，最常用的是高效液相色譜法。其優(yōu)點(diǎn)是樣品預(yù)處理簡(jiǎn)單，色譜柱選擇范圍廣，流動(dòng)相種類和比例可以任意變化，分析時(shí)間短，檢測(cè)方式多。

首次使用該方法是在1976年，Hoefler[6]等將綠茶用丙酮/水混合液進(jìn)行預(yù)處理，以乙酸/甲醇/N,N-二甲基乙酸銨/水為流動(dòng)相對(duì)兒茶素進(jìn)行了分析，得到了EGC、C、EC、EGCG、ECG 5種兒茶素和咖啡因含量。

經(jīng)過(guò)不斷研究和發(fā)展，于海寧[7]等建立了一種非梯度洗脫的兒茶素定性定量分析方法，得到最佳色譜條件：采用ODS柱，柱溫40℃，以重蒸水:乙睛:乙酸乙酯=86:12:2為流動(dòng)相，用濃硫酸調(diào)節(jié)pH值至3～4，流速1 mL/min，UV檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm。

1.2.2毛細(xì)管電泳法

利用茶多酚中各組分在電場(chǎng)作用下遷移速率不同的原理，毛細(xì)管電泳法也越來(lái)越趨于成熟。1997年，Horie[8]等用CZE模式分析了綠茶浸提液，在硼酸鹽的緩沖體系下，200 nm紫外檢測(cè)10 min內(nèi)測(cè)出了5種兒茶素和咖啡因、茶氨酸和維生素C。在Bonoli[9]提出的新方法中，使用毛細(xì)管電泳法分析了茶多酚成分的靈敏度，該法比HPLC法高20～100倍，使該方法成為食品領(lǐng)域中茶多酚的常規(guī)組分分析法。

1.2.3紙色譜法（PC）

Singh[10]等使用Whatman NO.1色譜紙分離了6種兒茶素類化合物，并通過(guò)在色譜紙上噴灑重氮化的對(duì)氨基苯磺酰胺，使其顯示亮黃色斑點(diǎn)來(lái)進(jìn)行定性分析，但含量則需要將未反應(yīng)的兒茶素從色譜紙移到試管后，與重氮化的對(duì)氨基苯磺酰胺形成絡(luò)合物后用分光光度法測(cè)量。該方法雖然簡(jiǎn)便、成本低、操作方便，但是定量并不精確。

1.2.4近紅外光譜分析技術(shù)（NIR）

近紅外光譜是介于可見(jiàn)光和中紅外光之間的電磁波譜。

夏賢明[11]等用近紅外光譜測(cè)量了粉碎的綠茶，并對(duì)茶多酚建立了多元回歸方程。

2　兒茶素分析

兒茶素又名兒茶酸、兒茶精，是從茶葉中提取出來(lái)的一類酚類活性物質(zhì)。它不僅具有較強(qiáng)的抗氧化性，還具有廣泛的藥理功效，如降血脂、降血糖、防治心血管疾病、預(yù)防癌癥、抗菌、抗病毒等。

2.1　兒茶素的含量測(cè)定

2.1.1香莢蘭素比色法

兒茶素的總量可通過(guò)運(yùn)用香莢蘭素比色法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定。其原理是兒茶素和香莢蘭素在強(qiáng)酸條件下生成橘紅到紫紅的產(chǎn)物，顏色的深淺與兒茶素的濃度成正比，以此計(jì)算兒茶素的含量。該反應(yīng)不受花青苷和黃酮苷的干擾，是一種快速的測(cè)定方法。

張佳[12]等利用香莢蘭素比色法測(cè)得鎖陽(yáng)中兒茶素含量為11.831 mg/g。

2.1.2高效液相色譜（HPLC）法

黃思勇[13]通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)分析了恩施硒茶中3種主要的兒茶素成分的含量。色譜條件：以Acclaim 120 C18為色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A、冰醋酸為流動(dòng)相B、水為流動(dòng)相C，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，進(jìn)樣量10μL，測(cè)得恩施硒茶中兒茶素含量為94.9～147.8 mg/g，平均含量為122.5 mg/g。

2.1.3反相高效液相色譜法

反相高效液相色譜（RP-HPLC）是由非極性固定相和極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系，它正好與由極性固定相和弱極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系（正相色譜）相反。RP-HPLC典型的固定相是十八烷基鍵合硅膠，典型的流動(dòng)相是甲醇和乙腈。

鄒盛勤[14]等建立了茶葉中沒(méi)食子酸、兒茶素和表兒茶素的反相高效液相色譜法。色譜條件：以Kromasil C18為色譜柱，流動(dòng)相為乙腈:水:磷酸=90:10:0.1，流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)278 nm，柱溫30℃，測(cè)得不同茶葉樣品中兒茶素含量最高為6.23mg/g，最低為2.37 mg/g；沒(méi)食子酸含量最高為2.84 mg/g，最低為0.84 mg/g；表兒茶素含量最高為4.82 mg/g，最低為0.70 mg/g。

2.1.4紫外分光光度法

管海波[15]等建立了紫外分光光度法測(cè)定當(dāng)歸藤中兒茶素含量的檢測(cè)方法，得出以下結(jié)論：在檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算兒茶素含量；在0.007 81～0.046 86 mg/mL濃度范圍內(nèi)，兒茶素對(duì)照品線性關(guān)系良好；平均回收率為98.72%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.09%；當(dāng)歸藤樣品中兒茶素的平均含量為2.88%。

2.2　兒茶素的結(jié)構(gòu)鑒定

兒茶素單體的測(cè)定可以在使用HPLC分離純化后，使用HPLC峰面積歸一化法檢驗(yàn)兒茶素純化產(chǎn)品的純度，同時(shí)根據(jù)保留時(shí)間來(lái)確認(rèn)初步定性的各兒茶素單體，并得到茶葉中提取的兒茶素單體的含量。若要進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)，則可以使用UV、IR、HNMR、ESI-MS四譜分析，以此來(lái)得到各兒茶素單體的結(jié)構(gòu)。

王洪新[16]等將茶多酚經(jīng)Sephadex LH-20柱層析分離，并將其中7種兒茶素分成2個(gè)流分，再用半制備型HPLC分離純化，用UV、IR、NMR、MS等方法鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)，成功地得到了茶葉中EGC、D-C、EGCG、EC、GCG、ECG、CG 7種兒茶素單體的含量，并用四譜分析確定了它們與相應(yīng)的兒茶素單體的結(jié)構(gòu)相吻合。

3　黃酮類化合物分析

黃酮類化合物是天然產(chǎn)物中非常重要的一類化合物，它表現(xiàn)出多種生物活性，能防治心腦血管和呼吸系統(tǒng)疾病，具有抗炎、抑菌、降血糖、抗氧化、抗腫瘤以及增強(qiáng)免疫力等多種作用。

黃酮類化合物的基本母核為2-苯基色原酮。天然黃酮類化合物母核上常含有羥基、甲氧基、烴氧基、異戊烯氧基等取代基。茶葉中的黃酮多數(shù)能與苷類結(jié)合，均屬黃酮醇類，是茶葉水溶性黃色素的主體。

3.1　黃酮類化合物的含量測(cè)定

3.1.1分光光度法

分光光度法最早應(yīng)用于茶葉中黃酮含量的測(cè)定，姚小敏[17]等采用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定茶葉中黃酮的含量，用95%的乙醇作為提取液，氫氧化鈉作為顯色劑，在500 nm處測(cè)定吸光度，最后測(cè)定樣品中總黃酮的含量為2.19%。但是，受多種因素的影響，分光光度法容易產(chǎn)生誤差。近些年絡(luò)合法成為出現(xiàn)頻率較高的檢測(cè)黃酮類化合物的方法。

3.1.2絡(luò)合法

絡(luò)合法的原理是金屬離子能和黃酮類成分反應(yīng)，形成有色的絡(luò)合物。一般用硝酸鋁-亞硝酸鈉或者三氯化鋁作為顯色劑，生成鋁螯合物，再在分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度，計(jì)算含量。

何書(shū)美[18]等對(duì)硝酸鋁-亞硝酸鈉法和三氯化鋁法測(cè)定茶葉中總黃酮含量的結(jié)果作了比較。結(jié)果表明，硝酸鋁-亞硝酸鈉法的測(cè)量結(jié)果比三氯化鋁法約高60 mg/g。三氯化鋁法在酸性環(huán)境下進(jìn)行，酸度實(shí)驗(yàn)顯示，其適宜酸度為pH≥5.0。鞣酸干擾實(shí)驗(yàn)表明，平均誤差為0.017 mg，隨鞣酸量的增加，沒(méi)有呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。因此，對(duì)含酚類較多的物質(zhì)應(yīng)采用三氯化鋁法測(cè)定總黃酮含量。

3.1.3高效液相色譜（HPLC）法

陳輝強(qiáng)[19]等用甲醇浸泡，超聲波振蕩提取苦丁茶中的黃酮類化合物，提取物選用Hypersil C12反相柱，以甲醇:水:冰乙酸=40:60:1為流動(dòng)相，采用高效液相色譜法測(cè)定提純后黃酮類化合物的含量。

王懷沖[20]等采用高效液相色譜法，以C18為固定柱，甲醇:0.025 mol/L磷酸溶液=50:50為流動(dòng)相，363 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)，測(cè)定了貫葉連翹提取物中金絲桃苷的含量。

高效液相色譜法方便簡(jiǎn)單，分離效果好。但是，其不足之處在于需要和高純度的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照或者和文獻(xiàn)資料對(duì)比，不適用于新物質(zhì)的結(jié)構(gòu)定性。因此，將HPLC與NMR、MS、UV、CD等多種光譜學(xué)技術(shù)聯(lián)用成為研究學(xué)者采用較多的研究手段。

3.1.4電化學(xué)法

電化學(xué)法建立在待測(cè)黃酮類化合物的電化學(xué)性質(zhì)上，主要包括庫(kù)侖滴定法、極譜法、離子選擇電極法。

余紅[21]采用庫(kù)侖滴定法，以羥基紅花黃色素為對(duì)照品，測(cè)定了北京、南昌、溫州以及開(kāi)封4個(gè)產(chǎn)地的紅花樣品中的總黃酮含量。

3.1.5毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法是一種以毛細(xì)管為分離通道、高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的新型液相分離技術(shù)，具有靈敏度高、分離效率高、經(jīng)濟(jì)、快速等優(yōu)點(diǎn)，適用于黃酮類化合物的快速定量分析。

吳婷[22]將毛細(xì)管電泳法與電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)結(jié)合起來(lái)，同時(shí)測(cè)定益母草以及3種益母草沖劑中橙皮素、根皮苷、山奈素、蘆丁、洋芹素及槲皮素6種黃酮類化合物的含量。

3.1.6熒光法

黃酮類化合物屬于平面共軛大分子，在紫外光照射下有強(qiáng)烈的熒光發(fā)射，從而可以通過(guò)熒光的強(qiáng)弱來(lái)分析黃酮類化合物的含量。

牟蘭[23]等應(yīng)用熒光法，以495 nm為發(fā)射波長(zhǎng)、433 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)定了蜂膠中總黃酮的含量。

3.2　黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

3.2.1顏色反應(yīng)法

黃酮類化合物中的酚羥基和苯并吡喃酮環(huán)可與鎂鹽、鋁鹽、鐵鹽以及硼酸、堿性試劑發(fā)生顯色反應(yīng)，通過(guò)觀察生成物的特殊顏色，初步分析黃酮類化合物。

常見(jiàn)的顏色反應(yīng)有鹽酸鎂粉反應(yīng)、氯化鋁反應(yīng)、氫氧化鈉反應(yīng)等。

3.2.2平板色譜法

平板色譜法主要包括薄層色譜法和紙色譜法。薄層色譜一般有硅膠薄層和聚酰胺薄層。硅膠薄層常用于分離和鑒定大多數(shù)黃酮苷元；聚酰胺薄層適用范圍廣，尤其適用于分離和鑒定具有游離酚羥基的黃酮苷類及苷元。紙色譜常用于鑒定植物粗提取物中的黃酮苷類和苷元的混合物。

李彩君[24]等以正己烷-乙酸乙酯-冰乙酸（10:1:0.5）為展開(kāi)劑，高良姜素為對(duì)照品，建立了高良姜藥材的薄層色譜定性鑒別法，高良姜素、山奈素等8個(gè)熒光斑點(diǎn)構(gòu)成了高良姜乙酸乙酯提取部位的薄層色譜指紋圖譜。

3.2.3紫外-可見(jiàn)分光光度法

紫外-可見(jiàn)分光光度法是鑒定黃酮類化合物的一種重要手段。首先測(cè)定試樣在甲醇溶液中的紫外光譜，再測(cè)定試樣在甲醇溶液中加入各種診斷試劑后的紫外光譜，黃酮苷類可在水解后測(cè)定苷元或衍生物的紫外光譜。黃酮類化合物主要有帶Ⅰ（300～400 nm）和帶Ⅱ（220～280 nm）兩個(gè)吸收帶，黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)不同，其帶Ⅰ和帶Ⅱ的峰形、峰位以及峰強(qiáng)都不同。因此，可以推測(cè)出黃酮類化合物的結(jié)構(gòu)。

3.2.4核磁共振波譜法

核磁共振波譜包括氫譜和碳譜。根據(jù)氫質(zhì)子共振吸收峰化學(xué)位移、偶合常數(shù)和峰面積等特征信息，可以獲取黃酮類化合物的母核類型以及取代基種類、位置和數(shù)量等。

張紅梅[25]等從卷柏中分離出5個(gè)雙黃酮類化合物，并利用核磁共振波譜法對(duì)其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。通過(guò)對(duì)卷柏屬中雙黃酮類化合物核磁共振特征的研究，首次歸納出卷柏屬雙黃酮類化合物核磁共振碳譜和氫譜的特征。

4　花青素分析

花青素是自然界中廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，也是植物花瓣中的主要呈色物質(zhì)，花青素具有清除自由基、抗氧化、抗突變、降血壓、改善肝機(jī)能等多種生理功能?；ㄇ嗨貙儆诜宇惢衔镏械念慄S酮類，基本結(jié)構(gòu)包含2個(gè)苯環(huán)，并由1個(gè)3碳的單位連結(jié)（C6-C3-C6）?；ㄇ嗨夭环€(wěn)定，自然界中少有游離的花青素，大多以糖苷化和?；男问酱嬖冢y(tǒng)稱為花色苷。

4.1　花青素的含量測(cè)定

4.1.1高效液相色譜（HPLC）法

20世紀(jì)70年代初，有研究者開(kāi)始利用HPLC對(duì)花青素類物質(zhì)進(jìn)行單組分成分的定性和定量研究。

Ka¨hko¨nen[26]等采用HPLC法對(duì)越橘、黑醋栗、牛莓總花青素含量分別進(jìn)行了測(cè)定。

岳喜慶[27]等將HPLC與分子質(zhì)量校正系數(shù)計(jì)算方法結(jié)合，對(duì)樣品中具有對(duì)應(yīng)母環(huán)的花青素進(jìn)行了定量計(jì)算，獲得了更為精確的結(jié)果。

然而，由于花青素糖苷化和酰基化的多樣性，如果采用色譜法檢測(cè)，需要多種標(biāo)準(zhǔn)品，成本高，再加上花青素核在可見(jiàn)光500～550 nm處強(qiáng)烈吸收，糖苷化和?；瘜?duì)其可見(jiàn)光譜性質(zhì)的影響不大，使得可見(jiàn)分光光度法成為一種比較方便的檢測(cè)花青素的方法。常見(jiàn)的分光光度法有色價(jià)法和pH示差法。

4.1.2色價(jià)法

色價(jià)法是我國(guó)常用的測(cè)量花青素含量高低的一種快速定性方法。色價(jià)指的是單位質(zhì)量原料提取物的吸光度。該方法操作簡(jiǎn)單且不需要標(biāo)準(zhǔn)品，具體操作是用移液管吸取2 mL樣品液，加入18 mL、pH=3.0的緩沖液后混勻，再將2 mL溶劑加入18 mL緩沖液混勻作空白樣品，紫外分光光度計(jì)在250～600nm范圍內(nèi)掃描，測(cè)定待測(cè)液的最大吸收波長(zhǎng)，并在其最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的吸光度[28]。按照公式E=A×10×a/W計(jì)算色價(jià)，其中，E為色價(jià)，A為峰值下的吸光度，W為取樣量，a為樣品液的稀釋倍數(shù)。

4.1.3pH示差法

pH示差法的原理是花青素的色調(diào)隨pH的變化而變化，但其他干擾物質(zhì)卻不受影響?；ㄇ嘬赵趐H為1.0時(shí)，生成特有的剛果紅，pH為4.5時(shí)變?yōu)闊o(wú)色。在這兩個(gè)pH值之間，花青素的吸光度與花青素的含量成正比[29]。

楊萍[30]等將pH示差法與HPLC法測(cè)定黑枸杞花青素進(jìn)行了比較，通過(guò)測(cè)定波長(zhǎng)、緩沖液pH、平衡溫度和平衡時(shí)間影響因素的研究，選擇pH示差法為測(cè)定方法，最優(yōu)實(shí)驗(yàn)參數(shù)為測(cè)定波長(zhǎng)525 nm、環(huán)境pH值為1.0和4.5、平衡溫度40℃。pH=1.0時(shí)的平衡時(shí)間為30 min，pH=4.5時(shí)的平衡時(shí)間為20 min，測(cè)得的花青素含量為60.59 mg/L，與HPLC法測(cè)定的結(jié)果60.94 mg/L非常接近，準(zhǔn)確度高，且方便快捷，成本低，更加適用于花青素的含量測(cè)定。

4.1.4紫外分光光度法

紫外分光光度法的原理是花青素在指定波長(zhǎng)處有特征性吸收峰，吸收峰的高度和面積與濃度呈正比，用已知含量的花青素標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到樣品中花青素的含量。我國(guó)學(xué)者利用該方法測(cè)定了玫瑰花[31]、茶樹(shù)芽葉[32]、葡萄酒[33]、紫色馬鈴薯[34]等的花青素含量。由于受到其他化合物的干擾，該方法只適用于純度較高或干擾含量低的花青素溶液，適用范圍較窄。

4.2　花青素的結(jié)構(gòu)鑒定

4.2.1顯色反應(yīng)法

張海悅[35]等將紙層析純化后的黑葵花籽殼花色苷樣品分別溶于50%乙醇溶液，加入少量鎂粉后再加入幾滴濃鹽酸，溶液產(chǎn)生大量氣泡，顏色變深；若只加鹽酸，則無(wú)氣泡，由此可證明該物質(zhì)為黃酮類化合物。加入幾滴萘酚乙醇溶液后再加入幾滴濃硫酸，靜置片刻后，溶液與濃硫酸交界處有紫色的環(huán)，溶液層為紅色，濃硫酸層為淡綠色，表明含有糖類物質(zhì)，與花色苷顯色特征一致。

4.2.2紫外可見(jiàn)光譜分析法

花色苷及其色素元在可見(jiàn)光465～550 nm、紫外光275 nm處有吸收峰[36]。通過(guò)測(cè)定樣品的紫外-可見(jiàn)光譜，可判斷為花色苷類物質(zhì)。

張海悅[35]等在黑葵花籽殼花色苷樣品溶液中加入3～5滴5 mol/L的三氯化鋁-甲醇溶液后，最大吸收波長(zhǎng)出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，說(shuō)明花色苷B環(huán)上含有2個(gè)相鄰的羥基。

4.2.3紙層析法與薄層層析法

根據(jù)花青素類物質(zhì)在不同溶劑中遷移值和顏色的不同，可對(duì)其進(jìn)行定性分析。該方法成本低、設(shè)備簡(jiǎn)單，并且直觀性和可比性好。

王本曉[37]等用薄層層析法分析得到玫瑰花中主要的花青素為矢車菊素-3,5-二葡糖糖苷。

王娜[38]等用紙層析法對(duì)樟樹(shù)果的花青素組成進(jìn)行了初步鑒定。

4.2.4紅外光譜分析法

王瓊[39]等采用沉淀法輔助提純七彩菊中的花青素，研究發(fā)現(xiàn)紅外吸收光譜中，在3 392.70 cm-1的較強(qiáng)吸收峰，是締合O-H產(chǎn)生；1 653 cm-1處的吸收峰，為C=O結(jié)構(gòu)；1 617 cm-1和1 507 cm-1處的吸收峰，為苯環(huán)特征峰；1 457 cm-1處的吸收峰，為CH2結(jié)構(gòu)；1 339 cm-1處的吸收峰，為CH3結(jié)構(gòu)；1 187 cm-1、1 078 cm-1、1 118 cm-1處的吸收峰，可能是C-O-C結(jié)構(gòu)，這些可能的結(jié)構(gòu)均體現(xiàn)了花青素類結(jié)構(gòu)中的相關(guān)基團(tuán)特征。

5　酚酸類化合物分析

茶葉中的酚酸類化合物含量較少，但包括沒(méi)食子酸、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、鞣花酸、奎尼酸、茶沒(méi)食子素等多種成分[40]，并且各組分都具有特殊的功能。例如，綠原酸具有利膽、抗菌、降壓、增高白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種作用[41]；沒(méi)食子酸可用于有機(jī)合成，作為食品抗氧化劑、防腐劑、消毒劑以及葡萄生長(zhǎng)劑等[42]。

5.1　酚酸類化合物的含量測(cè)定

5.1.1高效液相色譜（HPLC）法

江和源[43]等建立了茶葉中的酚酸類化合物的高效液相色譜法的測(cè)定方法，并通過(guò)一系列優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，分析比較了茶葉中酚酸類化合物的前處理方法，得出茶葉中酚酸類化合物的HPLC測(cè)定方法條件為：以Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）為色譜柱，75%A液（2%HAc）+25%B液（甲醇）為流動(dòng)相，柱溫30℃，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm，通過(guò)外標(biāo)法定量檢測(cè)。

5.1.2普魯士蘭法

普魯士蘭法是比較經(jīng)典的測(cè)量酚酸含量的顯色方法，該方法采用十二烷基硫酸鈉-FeCl3-K3[Fe（CN）4]-HCl系統(tǒng)進(jìn)行顯色，具有操作簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)、重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn)。不同文獻(xiàn)報(bào)道的普魯士蘭法顯色劑用量不同，所以實(shí)驗(yàn)前要優(yōu)化顯色條件。

劉麗金[44]等在核桃殼中的酚酸含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)中，確定最佳顯色條件為：無(wú)水乙醇5.0 mL，0.3%十二烷基硫酸鈉溶液1.5 mL，0.6%FeCl3-0.9%K3[Fe（CN）4]混合液2.0 mL，暗處放置50 min。

5.1.3聯(lián)用技術(shù)

目前，氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）、高效液相色譜-二極管陣列（HPLC-PDA）、高效液相色譜-二極管陣列-質(zhì)譜（HPLC-PDA-MS）等技術(shù)可以快速實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品的定性定量分析，GC-MS因其主要用于揮發(fā)性成分的分析，故不常用來(lái)對(duì)酚酸類物質(zhì)進(jìn)行定性定量分析。HPLC-PDA可能因加入某種診斷試劑而造成化合物難以分離與辨認(rèn)，因此也不適用于酚酸類物質(zhì)的分析。HPLC-PDA-MS是一種較為先進(jìn)的技術(shù)，且有學(xué)者利用此方法對(duì)酚酸類物質(zhì)進(jìn)行了含量測(cè)定。

于東[45]等采用高效液相色譜-二極管陣列-質(zhì)譜技術(shù)，對(duì)紫山藥中酚酸類化合物進(jìn)行了含量測(cè)定，測(cè)得紫山藥中可溶態(tài)酚酸芥子酸含量為356.71μg/gDW，不溶態(tài)酚酸阿魏酸含量為26.92μg/g DW。

5.2　酚酸類化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

酚酸類化合物可通過(guò)1H-NMR、3C-NMR、MS等譜學(xué)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

吳瓊[46]等通過(guò)NMR和MS等譜學(xué)技術(shù)分析確定了從刺五加葉中分離純化得到的化合物結(jié)構(gòu)，參考測(cè)得的波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)波譜數(shù)據(jù)，測(cè)得從刺五加葉提取物中分離得到的8個(gè)酚酸類化合物，分別為咖啡酸、阿魏酸、原兒茶酸甲酯、原兒茶酸、對(duì)羥基苯甲酸、丁香酸、綠原酸、松柏苷。

6　結(jié)語(yǔ)

茶葉中的化學(xué)物質(zhì)因其生理活性和藥理價(jià)值越來(lái)越受到關(guān)注。通過(guò)對(duì)茶葉分離后得到的各種化學(xué)成分的含量測(cè)定研究發(fā)現(xiàn)，茶多酚中的兒茶素多以高效液相色譜法、黃酮類化合物多以絡(luò)合法、其余則多以分光光度法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為主，測(cè)定各組分含量，其主要優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，對(duì)設(shè)備要求低。而對(duì)其結(jié)構(gòu)鑒定多用光譜、質(zhì)譜和核磁共振波譜法分析，光譜中最常用的則是紫外光譜法，多譜聯(lián)用也是結(jié)構(gòu)鑒定常用的方法之一，這些圖譜為我們準(zhǔn)確推測(cè)化學(xué)物質(zhì)的結(jié)構(gòu)提供了很大的便利。利用官能團(tuán)性質(zhì)的顏色反應(yīng)，也能幫助我們初步分析部分成分的結(jié)構(gòu)。

當(dāng)然，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷提高，有越來(lái)越多的研究者在原有的方法上進(jìn)行了改進(jìn)，或?qū)ふ倚矢?、成本更低、操作更?jiǎn)便、結(jié)果更精確的新方法。這些新方法是否能在工業(yè)上使用，還需要進(jìn)一步研究探索。