HRM技術(shù)發(fā)展和應(yīng)用

(南召縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所, 河南 南召 474650)

1 HRM的發(fā)展史

HRM技術(shù)是近幾年來新興起的一種用于檢測單核苷酸多態(tài)性的診斷技術(shù)。HRM檢測技術(shù)除了具有高通量、低成本、靈敏性和特異性高之外，真正實現(xiàn)了閉管操作，因此，HRM檢測技術(shù)深受國內(nèi)外科研人員的關(guān)注并得到廣泛的應(yīng)用。已經(jīng)商品化的用于HRM檢測的儀器是LightScanner，它是由美國Idaho公司生產(chǎn)的專門用于單核苷酸多態(tài)性位點的檢測的儀器，可以在5min的時間里檢測96或者384個樣品進行突變位點的檢測。此外，市場上其他公司的熒光定量PCR儀器也可以完成對突變位點的檢測，如伯樂公司和羅氏公司生產(chǎn)的熒光定量PCR儀可以完成對反應(yīng)產(chǎn)物的突變位點的檢測和基因分型。目前,常用的應(yīng)用于基因分型的比較準確的方法之一是探針法，但是探針的合成成本比較高，因此，其臨床應(yīng)用也受到極大的限制。而本文所介紹的HRM技術(shù)不會受到堿基的位點或者堿基的類型限制，也不需要合成價格較高的探針，只需要在反應(yīng)結(jié)束后對反應(yīng)產(chǎn)物進行一步溶解，再用儀器對溶解曲線進行分析，完成基因分型和突變位點的掃描[1]。

2 高分辨率溶解曲線技術(shù)的原理

高分辨率溶解曲線技術(shù)的原理非常簡單，就是在PCR擴增結(jié)束后，另設(shè)置一個解鏈的步驟。在溫度逐漸上升的階段，DNA雙鏈由于受到熱力作用，堿基之間的氫鍵會逐步打開，在堿基雙鏈解開到一半的時候，會產(chǎn)生一個解鏈加劇的點，這個關(guān)鍵點的溫度就是DNA雙鏈的Tm溫度，在DNA雙鏈逐漸打開的過程叫做溶解。在通常情況下，多用于有效區(qū)分GC含量差異較大或者片段長度差異較大的核酸片段時，將溶解曲線溫度調(diào)整到每秒上升1℃。如有堿基差異較小的情況，那么升溫溫度一般設(shè)置在每秒上升0.1～0.3℃。因此，在溫度設(shè)置的過程中要考慮到堿基之間的差異的大小。HRM常用的染料主要為飽和燃料、熒光探針和單熒光標記引物。其中飽和染料法較為常見，由于核酸片段堿基之間的組成不同，在溫度上升階段，DNA片段特異性熒光染料在釋放的過程中會有差異，根據(jù)差異獲得基因分型。雖然常用的是飽和燃料，但是不常用于HRM分型的SYBR Green染料仍然可以用于分型上，但是限制在2個片段或GC含量差異較大的基因分型上。熒光探針和單熒光標記引物雖然也能分型，但是不常用[2]。

3 高分辨率溶解曲線技術(shù)的研究進展

高分辨率溶解曲線技術(shù)可以在DNA溶解過程中產(chǎn)生不一樣的溶解曲線圖形從而有效區(qū)分核酸片段之間的差異，進一步做突變檢測和基因分型。HRM基因突變檢測方法自被認可以來，得到廣泛的應(yīng)用。

3.1 基因分型

基因分型是HRM檢測技術(shù)最為常用的一個功能。在這項功能中，筆者不用設(shè)計熒光探針就可以達到基因分型的目的。因為不同的核酸片段有不一樣的溶解溫度，不一樣的溶解溫度又有不一樣的溶解曲線。根據(jù)溶解曲線的吻合情況可以有效將野生型和突變型進行有效區(qū)分。例如，有學(xué)者用HRM技術(shù)將人類的β球蛋白的HbS，HbC，HbE 3個基因型進行有效區(qū)分。除了臨床上應(yīng)用較為廣泛之外，HRM在科研領(lǐng)域也有較多的應(yīng)用。例如，有學(xué)者用HRM技術(shù)區(qū)分16S rRNA，將細菌進行分類；區(qū)分雞腺病毒血清型進行分型等[3]。

3.2 甲基化研究和應(yīng)用

甲基化在機體正常的生命活動中起著非常重要的作用。核酸的甲基化是指核酸在甲基化轉(zhuǎn)移酶的調(diào)節(jié)下，在基因組CpG島的CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位點共價鍵結(jié)合一個甲基團，甲基化是哺乳動物基因表達的調(diào)控方式之一。核酸的甲基化狀態(tài)改變后，基因的結(jié)構(gòu)和功能就會有很大的變化。溶解溫度之間的差異能夠反映出同原序列之間的差異。核酸片段經(jīng)過亞硫酸氫鹽的處理，沒有甲基化的胞嘧啶成為尿嘧啶，尿嘧啶在擴增過程中可以轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶。這樣，甲基化和非甲基化就可以轉(zhuǎn)化成核酸片段之間的差異，進而有效區(qū)分甲基化和非甲基化。高分辨率溶解曲線技術(shù)在甲基化的檢測中檢測靈敏度非常高，即便是0.1%的甲基化程度也能檢測出來。

3.3 突變掃描

HRM技術(shù)也常用于突變位點的篩查和發(fā)現(xiàn)新突變位點。早期Smitn研究發(fā)現(xiàn)，一名肺癌患者的表皮生長因子發(fā)生突變，突變位點在第四號外顯子上。此后不久，另一科學(xué)家將HRM技術(shù)進行可改進，用于非小細胞肺癌患者的表皮生長因子的掃描。之后，越來越多的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用HRM檢測技術(shù)檢測側(cè)出突變位點與某些疾病的發(fā)生有很大的關(guān)系。例如:BRCA1和BRCA2的突變被證實與乳腺癌有關(guān)。另一位學(xué)者同樣用HRM技術(shù)對收集的結(jié)腸癌患者的樣本進行檢測，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果與金標準方法測序結(jié)果的吻合度達到95%。

[1]楊彩虹,楊敏,于璐,等.高分辨率熔解曲線技術(shù)用于結(jié)核分枝桿菌臨床分離株異煙肼耐藥性的快速檢測[J].中國人獸共患病學(xué)報,2017(05):403-412.

[2]王海英,劉志敏,鄭建禮,等.結(jié)核桿菌異煙肼表型耐藥與katG基因突變相關(guān)性研究[J].齊魯醫(yī)學(xué)檢驗,2005(05):3.

[3]周長凱,曹婧.結(jié)核分枝桿菌對異煙肼耐藥的分子機制[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志,2013(06)：731-732+73.